固定化脂肪酶研究进展.doc

固定化脂肪酶研究进展毛满琴（生物工程一班，20091489）摘 要：固定化脂肪酶由于其易与底物分离且可重复使用而备受关注。综述了常用的固定化方法，包括吸附法、共价交联法和包埋法，不同的固定化方法对酶的性质有不同的影响。关键词：固定化，脂肪酶，载体Research progress in lipase immobilizationMAO Man-qin(Class one, bioengineering, 20091489) Abstract: Immobilized lipase become a hotspot because its easy to separate and can be reused. The common immobilization methods were generally introduced including adsorption, covalent cross-linking method and entrapment method. Different immobilization methods had different effects on the enzyme.Key words: immobilization; lipase; carrier脂肪酶(Lipase EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一类特殊的酰基水解酶，它的底物是油脂，其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键；脂肪酶能在油水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构体拆分等有机合成反应，是目前被重点研究的酶催化剂。脂肪酶与底物的作用过程包括：第一步，活化丝氨酸的酰基化（通过亲核攻击）和酯键裂解，甘油二酯释放后，四面体半缩醛中间产物形成；第二步，脱酰基作用（丝氨酸酰基化的逆反应），是活化水分子对酯进行攻击，接下来的裂解过程同样包括脂肪酸释放后四面体半缩醛中间产物结构的形成。游离脂肪酶催化技术虽然成熟，但酶分离困难，不能重复使用，难以实现过程连续化，因此脂肪酶催化技术工业化很大程度上取决于酶的固定化。当底物和产物是小分子的可溶性物质时，固定化酶更占优势。1 固定化脂肪酶的方法1.1 吸附法1 2吸附法是最简单的固定化方法，载体和生物催化剂之间的作用力是次级作用力。根据吸附的特点又分为物理吸附法和离子交换吸附法。彭立凤3等研究了以CaCO3粉末为载体吸附法固定化脂肪酶的方法。结果表明，当酶的用量为CaCO3质量的013g.g-1，吸附时间1.5h，所得固定化酶活最高，为158.1UCaCO3/g.min。林繁华4等利用以醋酸纤维素/聚丙烯复合膜为载体对脂肪酶进行吸附固定，研究了不同条件对固定化脂肪酶活性的影响。实验结果表明当酶浓度为0.020g/mL时效果最好，当酶的浓度低于0.020g/mL时，固定化酶活随酶浓度的增大而增加，而高于此值固定化酶的酶活不再增加。说明脂肪酶在吸附固定化时,载体吸附的酶量是有限的，一方面可能是载体的吸附能力较弱，使载体可吸附的酶量较少，催化活性较低；另一方面即使载体吸附性较强，但吸附的蛋白质过多，造成酶分子相互聚集导致脂肪的活性中心互相遮盖，使酶的催化活性可能很低。因此在酶的固定化过程中，要得到较好的固定化效果需要选择合适的载体和合适的酶浓度；随吸附时间的增加,醋酸纤维素/聚丙烯复合膜在23h时固定化酶相对酶活较大，当进一步延长固定化时间，酶分子与载体反应基团的结合可能已经不是主要因素，酶在环境中失活或者由于酶分子相互聚集导致脂肪酶的活性中心互相遮盖而影响酶活，因此醋酸纤维素/聚丙烯复合膜在23h时固定化酶酶活较大。罗文5等利用多孔玻璃珠为载体，采用共价法对假丝酵母99-125脂肪酶进行了固定，对比了固定化酶与游离酶的最适反应温度、pH值以及热稳定性。多孔玻璃珠表面的羟基与硅烷化试剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷反应，载体表面接入氨基；再用交联剂戊二醛对载体进行活化：戊二醛的一个醛基与载体表面的氨基以共价键结合后，载体表面接入醛基。载体上的醛基将与酶蛋白分子的氨基结合而将脂肪酶固定。实验发现固定化酶的最适温度为4045，比游离酶最适反应温度(40) 范围有所变宽，并且温度在40以上时，固定酶的相对活力大于同一温度下游离酶的相对活力。这说明了游离酶经固定化后热稳定性升高，这可能是因为固定化过程稳定了酶分子的构象，因而使固定化酶的临界变性温度提高。关于酶的热稳定性，实验测定了酶在各个温度下保持1h后的活力。随着温度的增加，游离酶活力逐渐下降，在60已基本失活；固定化酶活力则随着温度的增加，酶相对活力在轻微增加后才下降，在50下保存1h后，固定化酶相对酶活达到最高值(143%)，固定化酶在70下，酶活还能维持为初始酶活的86%.可见经改性多孔玻璃珠固定化工艺后，脂肪酶的热稳定性明显提高。可见改性多孔玻璃珠对脂肪酶的固定，稳定了脂肪酶构象，使其热稳定性提高。固定化酶相对活力随着温度的变化情况则可能与酶分子在载体上的状态有关。虞英6等以D311离子交换树脂为载体，通过离子交换吸附法对Lipolase100L脂肪酶进行了固定化。采用考马斯亮蓝法测定了酶蛋白在离子交换树脂上的吸附率，考察并得到了酶固定化的最佳条件。有效的固定化。实验结果表明固定化的最佳条件为在pH=10缓冲液下，加酶液量为每克预处理过的树脂加入1.5mL原酶液，吸附时间为10h，温度为35。得到的固定化酶催化合成月桂酸月桂醇酯，在加酶量4mg/mL，最佳水质量分数8%，55的条件下酯化反应催化效果最好，反应210 min转化率可达91.3%.刘汝宽7等采用大孔树脂D3520作载体以载体涂布法来固定化脂肪酶，对固定化条件进行了优化并分析固定化酶的性能，在水分含量为3%5%，pH 9.0，反应温度为40条件下，固定化酶具有最佳的催化活力(91.49U/g).与游离酶相比，固定化酶具有更好的性能。胡隼8以无纺布为载体，吸附法固定化假丝酵母99-125脂肪酶。研究了温度对固定化脂肪酶的影响：多数脂肪酶催化反应的最佳温度范围介于3037，固定化增加了酶的构象稳定性，使最适温度会有所上升。温度的提高有利于酯化反应生成水的脱除，但过高的温度会使酶热失活，所以实验需控制适宜的反应温度范围。高贵9等采用硅藻土作为载体，对脂肪酶进行固定化，研究了固定化条件对固定化脂肪酶的催化活性以及硅藻土吸附脂肪酶量的影响。得到最适的固定化反应条件：温度为3035；pH值为7.7;缓冲液离子浓度在0.010.03mol/L之间；载体与脂肪酶的质量比为8:1.1.2 共价交联法1 2共价交联法取决于酶分子与其他物质之间的共价键，通常在载体上加入氨基、醛基等功能性集团来使酶结合得更牢固。使载体活化的方法很多，主要有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。刘新喜10研究了蛋壳作载体，吸附交联法固定化脂肪酶的最佳工艺：酶用量为0.12，搅拌吸附时间为30min，而在pH=6.2室温下得到的固定化酶的最大活力29.41)，该固定化酶最适用的温度为35，pH=9.0，重复使用6次后活力仍保留53 %；蛋壳作载体固定化脂肪酶，吸附过程简单操作方便，固定化酶稳定性较高，载体易得便宜。本身具有较好的机械性能，产生的固定化酶流动性能良好，有利于装柱催化合成反应。陈秀琳11等以CM-葡聚糖凝胶为载体的固定化脂肪酶的制备方法及比较固定化脂肪酶与游离酶在酶学特性上的变化。载体先用10 20倍量的0.5mol/L盐酸浸泡，然后用蒸馏水洗至中性，再用10倍量的0.5mol/L NaOH浸泡，并用水洗至中性，如此反复数次，最后再用10倍量的0.5mol/L HCl处理成H型，水洗至中性。称取一定量的该载体用pH7.0, 0.01mol/L KH2PO4-NaOH缓冲液平衡，吸出上清液，并加入一定量的酶液，搅拌均匀，在4下反应8h，用缓冲液充分洗涤、过滤，测定滤液中蛋白质浓度，直至滤液中蛋白质浓度为零为止，真空干燥，得到固定化酶。结果为固定化酶的稳定性较高，最适作用pH值为10.0，最适作用温度为48，其催化油脂水解操作半衰期为325h。因此，以CM-葡聚糖凝胶固定化脂肪酶是一种较好的固定化方法。盛梅12等研究了以交联烯丙基葡聚糖凝胶(CADB)为载体，对-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)为偶联剂固定化脂肪酶的工艺条件，并考察了固定化脂肪酶的稳定性。试验结果表明：CADB与SESA反应的最适条件是pH=12.0, SESA与CADB质量比为6:1，反应生成的对氨基苯磺酰乙基交联烯丙基葡聚糖凝胶(ABSE-CADB)经重氮化后与脂肪酶偶联的最适条件是pH7.5，偶联时间12h。加酶量为400u/g1200u/g(载体)时，所得固定化酶活力为193u/g448u/g(载体)，此时固定化酶的活力回收率较高（37%）。固定化脂肪酶稳定性较高，其操作半衰期约为720h。杨江科13等以甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、乙烯基三甲氧基硅烷(VTMOS)、乙烯基三乙氧基(VTEOS)、辛基三甲氧基硅烷(OTMOS)和四甲氧基硅烷(TMOS)为前趋体制备4种不同的固定化脂肪酶，并系统考察了烷基侧链对sol-gel固定化酶胶体结构和酶活性的影响。结果表明，随着烷基侧链的增长和数目的增加，固定化酶活力均逐渐增加，固定化脂肪酶颗粒平均孔径逐渐增大，孔体积逐渐增加，对底物的传质阻力逐渐降低；同时颗粒逐渐由球形变成不定形或团块状结构。脂肪酶活性的增加不仅来源于疏水性烷基侧链引起的脂肪酶的界面激活效应，同时固定化颗粒结构的改变了增加了底物和酶分子的结合，提高了固定化酶的表观活性。彭立凤14等研究了壳聚糖涂层在纤维素滤纸上成膜后再固定化猪胰脂肪酶的最佳条件。结果表明，当戊二醛浓度为5%，活化12h，与pH7.6的酶的磷酸盐缓冲溶液于室温( 15)交联12h,获得的固定化酶活最高为0.26U/cm2。固定化酶最适温度40，比游离酶提高了5；最适pH8.5，与游离酶相比，向碱性偏移了0.5个pH.证明了用壳聚糖成膜后固定化脂肪酶反应条件温和，步骤少，简便易行，得到的固定化酶最适温度比游离酶提高了5，这对其催化油脂水解反应是非常有利的，一方面可以在较高的温度下操作，提高反应速率；另一方面可使熔点较高的油脂融解，免加有机溶剂，具有一定的潜力。1.3 包埋法1 2包埋法是不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，反应条件温和，很少改变酶结构的固定化方法。其基本原理是单体和酶溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应，将酶固定于载体材料的网格中，包埋法包括凝胶包埋法和微囊化法。杨本宏15等研究了以海藻酸钠为载体，用包埋法制备固定化德氏根霉(Rhizopus delemar)脂肪酶的条件。将酶粉和海藻酸钠溶于pH 5.0的HAc-NaAc缓冲溶液，用注射器将此混合液滴入到0.05mol/L无菌CaCl2溶液中，静置固化45min，经过滤、洗涤和干燥后得到球状固定化酶。固定化酶的活力回收约为34.1%.酶学性质研究表明，此固定化酶的热稳定性较好。游离酶在60下保温1h已完全丧失活力，而固定化酶在100下保温1h仅损失36.2%的活力，在100 下保温6 h仍可保持46.8%的酶活力。酶经固定化后，其橄榄油水解反应的最适温度由40上升至90，Km值由13.8mg/mL下降为8.1mg/mL. 常见有机溶剂对固定化酶的活力影响较小。将该固定化脂肪酶用于非水溶剂中正戊酸异戊酯的合成，重复使用6次后，固定化酶仍保持95%的酶活力。李丽丽16等以米糠为原料，研究了米糠固定化脂肪酶的制备及生化性质。结果表明：米糠经过一定的处理后，不仅能获得米糠中油脂，且能保留米糠脂肪酶的活性，形成一种以米糠为天然载体的米糠固定化脂肪酶(immobilized rice-bran lipase; IRB-L)，且以石油醚在35下去脂5min得到的IRB-L的活动度最高，约为10.72 mL/g。该酶在催化油脂水解反应中，最适水解温度约为40，最适pH值为7.0。在催化油脂酯化反应中，最优条件为IRB-L 与油酸的质量比为60%，甲醇与油酸摩尔比1:1，反应温度40，反应时间6h；在上述条件下，产物油酸甲酯得率可达44.98%.且该酶在40的环境中保存40天可维持80%以上的活性，在批次水解反应下重复使用5次之后，残余酶活力仍达62%.2 存在的问题与展望2.1 存在的问题很多固定化方法在单独使用的时候往往有其缺点所在，吸附法中由于酶与载体之间的作用力弱，改变温度、离子强度等条件，酶就可能从载体上解离下来。吸附法的另一个缺点是其他物质也可能非特异性吸附到载体上，这就可能改变固定化酶的性质并影响酶的吸附量；共价交联法过程较复杂，化学试剂的使用使酶在处理过程中易失活，有机溶剂和金属离子对酶的活性会有一定的影响；包埋固定化酶易流失。在实际的应用过程中常将几种方法联用。2.2 展望脂肪酶在食品、洗涤剂、制药等方面应用广泛。由于固定化酶的制备方法过于复杂，效率低、成本高，以及化学试剂的使用易使酶活力降低或失活等因素的制约，固定化酶在工业生产中的应用受到限制。寻找廉价、易于活化和制备的载体是脂肪酶固定化发展的一个方向。另外，由于酶的活性与其所处的微环境有关，改善其反应的微环境可能会提高其活力。但随着生物技术以及材料、化工等各相关学科的发展，新型载体的开发利用及各种固定方法的发展完善，相信固定化脂肪酶的工作会有新的突破。参考文献1谭天伟. 生物化学工程M. 北京:化学工业出版社,2008:105-111.2陈秀琳. 脂肪酶固定化的研究概况J. 海峡药学,2007,19(12):114-115.3彭立凤, 刘新喜, 杨国营. CaCO3粉末作载体固定化脂肪酶催化合成单甘酯J. 日用化学工业,2001,5:13-15.4林繁华, 张庆庆, 汤斌, 晋青波. 醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化脂肪酶的研究J. 安徽工程科技学院学报,2007,22(3):17-19.5罗文, 谭天伟, 袁振宏, 吕鹏梅, 王芳. 多孔玻璃珠固定化脂肪酶及其催化合成生物柴油J. 现代工业,2007,27(11):40-42.6虞英, 蒋惠亮. 离子交换树脂吸附法固定化脂肪酶的研究J. 食品与生物技术学报,2007,26(4):97-100.7刘汝宽, 李昌珠, 张玉军, 肖志红. 树脂固定化脂肪酶技术的研究J. 河南工业大学学报,2007,28(2):68-71.8胡隼, 王芳, 谭天伟. 固定化假丝酵母99-125脂肪酶催化合成甘油二酯J.北京化工大学学报,2007,34(2):1