《病毒学复习资料》word版.doc

病毒学复习资料盛德二年首发限量版第一章 绪论一，病毒学研究的对象及任务病毒（virus)是指那些在化学组成和增殖方式上独具特点的，只能在宿主细胞内进行复制的微生物或遗传单位。病毒性质的两重性1. 生命形式的两重性：存在形式：化学分子与细胞内寄生、结晶体与非结晶体、颗粒体形式与基因形式。2结构和功能的两重性：标准病毒与缺陷病毒缺陷病毒：装配不完全的病毒（缺损病毒，defective virus,Di颗粒）；标准病毒：产生缺陷病毒的原亲代病毒）。假病毒与真病毒假型病毒：一种病毒的核酸被另一病毒外壳包裹；假病毒：细胞DNA被病毒外壳包裹；真病毒：一种病毒的外壳包裹自己的核酸）。杂种病毒与纯种病毒杂种病毒：在混合感染中，病毒外壳包裹两种病毒的核酸3病理学两重性：致病性与非致病性；急性感染与慢性感染过客病毒：某一病毒对宿主无致病性，则该病毒称为此宿主的过 客病毒 病原病毒：某一病毒对宿主有致病性，则该病毒称为此宿主的病原病毒 亚病毒1 卫星病毒与卫星核酸 satellite virus需辅助病毒才能复制核酸（卫星病毒），或由辅助病毒提供外壳蛋白来包被核酸（卫星核酸）2 拟病毒 virusoid比卫星病毒核酸还要小，仅200400bp，最大不过1kb环状RNA。需辅助病毒才能复制，与辅助病毒同包一个外壳中。属植物病毒，目前归于环状卫星RNA。3 类病毒 viroid 240375bp单链、环状RNA；独立侵染、自立复制、无外壳，多二级结构，不编码任何蛋白，为植物病毒4 朊病毒 prion 很小的具侵染性的蛋白颗粒病毒学研究的任务1.防治和控制疾病2.基础理论研究：生命起源与进化、认识生命本质3.利用病毒造福人类：生物防治、病毒基因工程病毒学发展趋势一、病毒功能基因组学和蛋白质组学研究1.从核酸及蛋白质水平认识病毒，了解它们的致病机理与诊断防治。2.系统生物学理论的建立：系统生物学是研究一个生物系统中所有组成成分（基因、mRNA、蛋白质等）的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科。也就是说，系统生物学不同于以往的实验生物学仅关心个别的基因和蛋白质，它要研究所有的基因、所有的蛋白质、组分间的所有相互关系。显然，系统生物学是以整体性研究为特征的一种大科学。3. 新的诊断/预防/药物的发展与利用 二、新出现或再现的病原微生物的特性与诊断、防治近年新出现或再现病毒的特点1. 多数为人畜共患病的病原，可能由动物传给人2. 可能由昆虫或节肢动物为中间媒介3. 随交通旅行或工作生活习性改变、环境气候变化而传播4. 所致疾病的诊断需作病原学确证三、病毒分子病理学研究1. 生命起源、变异、毒力改变、进化2. 病毒与宿主的相互作用3. 肿瘤病毒学第二章 病毒的分类与命名病毒“种”是指构成一个复制谱系( replicating lineage) 、占据一个特定小生境(ecological niche) 、具有多个分类特征的病毒。病毒属是一群具有某些共同特征的种。其属名的词尾“virus”,但在设立一个新的病毒属时必需有一个同时被承认的代表种(type species)。病毒科是一群具有某些共同特征的属，科名的词尾为“viridae” 。病毒目：是目前最高的分类阶元。病毒目是一群具有某些共同特征的科,目名的词尾为“virales”。病毒分类原理及其依据原理：强调其分类和命名的稳定性、实用性、认可性和灵活性。稳定性是指病毒名称及其隶属关系一旦确定下来，就应该尽可能的保留。实用性是指病毒分类体制应该对病毒学研究领域是有用的。认可性是指病毒分类阶元和名称应该为病毒学研究者乐意接受和使用，所以，认可性也是实用性的必然结果。灵活性是指病毒分类阶元可以依据某些新发现而进行重新修订和再确定。依据：主要以病毒粒子特性、抗原性质和病毒生物学特性等作为依据。病毒粒子特性： 病毒形态：如大小、形状、包膜和包膜突起的有无，衣壳结构及其对称性 病毒生理生化和物理性质：如分子量，沉降系数，浮力密度，病毒粒子在不同pH、温度、Mg2+、Mn2+、变性剂、辐射中的稳定性 病毒基因组：如基因组大小、核酸类型、单双链、线状或环状，正负链，G+C所占的比例、核苷酸序列等 病毒蛋白：如结构蛋白和非结构蛋白的数量，大小以及功能和活性，氨基酸序列等； 病毒脂类含量和特性； 碳水化合物含量和特性； 病毒基因组组成和复制：基因组结构、复制策略、开放阅读框数量和位置、转录转译特性、转译后加工、病毒蛋白聚集和病毒组装的位置，病毒成熟与释放的部位和特性第三章 病毒学的研究方法一、病毒学研究常用方法离心技术：差速离心法：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。密度梯度离心：采用甘油，蔗糖，氯化铯配制成抗对流干扰连续密度梯度介质，把病毒粒子和杂质沉淀或浓缩到与它自身密度相等的位置。 电子显微镜技术：负染色法；超薄切片技术；免疫电镜技术；冷冻电镜技术 组织和细胞培养技术：组织培养法 (tissueculture) 或细胞培养 (cellculture)法,是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。群体培养: 将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层。克隆培养: 将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。原代和次代细胞培养：分离病毒最为敏感。 二倍体细胞 ：用于病毒分离和疫苗制备 传代细胞系 ：用于病毒的分离鉴定和抗病毒药物筛选研究。常用的细胞系有人宫颈癌细胞（Hela）、传代地鼠肾细胞（BHK21）、人喉上皮癌细胞（Hep-2）、传代非洲绿猴肾细胞（Vero） 。病毒基因转染细胞系：用于病毒基因调控和抗病毒药物的研究。细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）：由病毒增殖引起的细胞改变，称细胞病变效应。不同种类病毒可引起细胞圆缩、分散、溶解，如肠道病毒、鼻病毒、披膜病毒、痘病毒等；细胞融合成多核巨细胞，如疱疹病毒、副粘病毒、呼吸道合胞病毒；细胞肿胀、颗粒增多、病变细胞聚集成葡萄状，如腺病毒；胞质出现空泡，如SV40细胞；细胞浆或核内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体，一至数个不等，如狂犬病毒和巨细胞病毒；轻微病变，如正粘病毒、狂犬病毒、冠状病毒和逆转录病毒等；培养液pH的变化。 细胞培养特点：1. 细胞的变化 有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细胞病变效应 (CPE)。常见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。 有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于细胞膜，可使邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融合细胞。 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培养细胞中形成胞浆或核内的包涵体。 2.红细胞吸附 (hemadsorption,HAd)：流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎动物 (豚鼠、鸡、猴等) 红细胞的能力，这一现象称红细胞吸附，常用来测定具有HA的粘病毒与副粘病毒的增殖。若有相应的抗血清，则能中和细胞膜上的HA，HAd不再发生，称红细胞吸附抑制试验。3.干扰现象(interference)：某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易于测出的变化(如HAd)，但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖。如风疹病毒感染Vero细胞时CPE不明显，但它能干扰后感染的埃可病毒 (ECHOV) 的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE4.细胞代谢的改变：病毒感染细胞的结果可使培养液的pH值改变，说明细胞的代谢在病毒感染后发生了变化。这种培养环境的生化改变也可作为判断病毒增殖的指标。1.蚀斑测定是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作蚀斑形成单位 (plaque forming unit,PFU)。病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。2.50%组织细胞感染量 (TCID50)测定法该方法是测定病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的最小量。一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等指标，以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点。最后用统计方法计算出50%组织细胞感染量（ 50% tissue culture infectious dose,TCID50)。血清学方法中和试验：适用于病毒鉴定，机体中抗体的检测，分析病毒抗原的性质，疫苗接种效果评估等。补体结合试验。血凝抑制试验：常用于正粘病毒和副粘病毒感染的诊断和病毒亚型鉴定及抗原变异的监测，如流感病毒的分型。酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。放射免疫试验（radio immunol assay，RIA）。免疫荧光检测（immunofluorescence assay，IFA）。凝胶扩散法（gel-diffusion test)分子生物学方法聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。转印杂交 ：Southern blot、Nouthern blot和Westhern blot。蛋白质组学：肽图谱。基因组学：核酸序列测定及基因功能。基因工程：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子多肽 、病毒载体。病毒的鉴定：病毒的纯化：离心。病毒的大小和形态：电镜。细胞培养核酸类型鉴别和序列测定：PCR。乙醚敏感试验：是否具有脂类包膜。血清学反应：免疫荧光抗体技术 （三）病毒感染的快速诊断 快速诊断主要是指从含有病毒标本及感染机体的血清中检测病毒颗粒、蛋白抗原、IgM抗体和核酸等，往往在数小时内即可得出结果。 形态学检查 ：光学显微镜检查 ：包涵体 电子显微镜检查 病毒抗原检测： ELISA 病毒核酸检测 ：核酸杂交、凝胶电泳技术 、PCR血清学诊断： 病毒蛋白抗原检查 用荧光素、放射性同位素、过氧化物酶等标记抗体，采用免疫学和分子生物学技术，检测标本中的病毒蛋白抗原，具有敏感、特异、快速等优点。1.免疫荧光技术 (immunofluorescence,IF) 2.固相放射免疫测定 (solid-phase radioimmunoassay,SPRIA) 3.酶免疫技术 (enzyme immunoassay,EIA)此法可检测多种病毒及其抗体，主要是酶免疫组化法和酶联免疫吸附试验法(ELISA)。 特异性IgM抗体的检测 检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染，特别是对证实孕妇感染风疹病毒尤为重要，但应注意类风湿因子 (IgM) 的干扰。另外，检测早期抗原的抗体是快速诊断的另一途径。如检测针对EBV的早期抗原(EA)、核心抗原 (EANA) 和衣壳抗原 (VCA) 等的抗体，可以区别急性或慢性EBV感染。此外，分子生物学检测技术、气相色谱技术等，均可用来分析和鉴定病毒感染。检测病毒核酸 1.核酸杂交技术 用于病毒检测的有斑点杂交、细胞内原位杂交 、DNA印迹杂交、RNA印迹杂交等。2.核酸扩增法 目前多数病毒基因已通过分子克隆技术被明确了核苷酸序列，使得DNA扩增技术逐步发展为常规诊断技术之一。3.基因芯片技术 又称DNA芯片、生物芯片（biochip）。其原理是：将已知的生物分子探针或基因探针，大规模或有序排布于小块硅片等载体上，与待测样品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反应，在激光的激发下，产生的荧光谱信号被接受器收集，计算机自动分析处理数据并报告结果。其优点是：可以一次性完成大量样品DNA序列的检测和分析，解决了传统核酸杂交技术的许多不足。芯片技术在病毒等微生物学诊断和流行病学调查方面有着广阔的应用前景。第四章 病毒的结构一、病毒的大小表示形式：分子量：核蛋白分子（核酸与蛋白质以一定方式组合），3800106 道尔顿 密度：浮力密度（）采用密度梯度离心方法测定，需注明介质沉降系数：单位离心力作用下的沉降速率（s）壳体：由蛋白质组成，包围病毒核酸的蛋白质结构。颗粒蛋白质亚基（不同的蛋白质）以次级键形式形成 。核衣壳：由核酸与蛋白质壳体组成的核心成分 包膜：围绕或包围核衣壳的双分子层,来源于宿主，不同的病毒感染同一宿主包膜成分相同。 包膜突起钉状物糖蛋白组成复杂的病毒成分 二、病毒的结构与功能病毒的结构有二种，一是基本结构，为所有病毒所必备；一是辅助结构，为某些病毒所特有。它们各有特殊的生物学功能。基本结构：病毒核酸、病毒蛋白质辅助结构：包膜、突起（脂质、糖类等）病毒的化学组成:核酸、蛋白质、脂类、碳水化合物、无机盐病毒基因组的结构特点1.病毒基因组大小相差较大。 2.病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成。 3.多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成，还没有发现有节段性的DNA分子构成的病毒基因组。4.基因重叠5.病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的。6.病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位,形成一个功能单位或转录单元。 7.除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。8.噬菌体（细胞病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的，具有内含子。病毒核酸的结构特征 (1)粘性末端(2)末端冗余(3)循环排列(4)回文序列(5)倒转末端重复序列 是指存在于病毒基因组两端的反向互补重复序列，这样的基因组经过变性、退火处理，可以形成有部分双链区的线状环；或者产生锅柄样的结构。(6)重叠基因 (7)分段基因组：单分体病毒：多个核酸节段包装在同一病毒粒子中多分体病毒：多个核酸节段分别包装在不同的病毒粒子中，这类病毒实际上是由几个不同的病毒粒子所组成的复合体。 含分段基因组的病毒具有以下三个特点：侵染效率低；容易产生变异；具有较高的重组率。多分体现象为植物病毒所特有，并仅存在于ssRNA病毒中，是指病毒的基因组分布在不同的核酸链上，分别包装在不同的病毒粒体里。双分体病毒指遗传信息为双组分基因组包被在两种粒体里的病毒，如烟草脆裂病毒属(Tobravirus)和蠕传病毒属(Nepovirus)。三分体病毒指核酸包被在三种粒体中的病毒。(8)帽子和ploy(A)结构 真核病毒的正链RNA基因组、双链RNA基因组的正链RNA和病毒的mRNA通常有类似于真核生物mRNA 5端的帽子结构和3的poly(A)结构尾。而原核生物mRNA和相应的噬菌体基因组RNA均缺少这样的结构。 病毒基因组RNA 5端的帽子结构有着真核生物5端的帽子结构的相似功能，它对病毒基因组正链RNA具有保护作用，可以使病毒正链RNA或mRNA免受宿主细胞中的外切核酸酶的降解；病毒基因组RNA的帽子结构还与感染性有关，缺少它几乎完全丧失感染性。 病毒基因组的3的poly(A)结构尾有多方面的功能。 保持和提高病毒基因组RNA在宿主细胞中的稳定性； 3的poly(A)结构尾也与病毒的侵染性有关。 (9)其它特征 一些真核DNA病毒基因组还含有复制原点序列以及转录调控序列如启动子和增强子序列。某些真核病毒的基因组也含有内含子转染：从病毒中提取核酸，来进行遗传物质的传递，感染细胞。转染可分核酸为 侵染性核酸 非侵染性核酸 。具有RNA功能活性，进入细胞以后直接作为翻译的模板，合成大分子蛋白质，叫侵染性核酸。核酸的组成、含量与类型组成： A T C G ；A+G=T+C 类型：DS DNA ：SS DNA ；DS RNA；SS RNA 含量：不同病毒含量差异较大（P50)核酸的极性 将mRNA 的碱基排列顺序规定为(+ RNA ) 链, 其相应的模板链则为负链(- DNA ) , 因此只有负链DNA 才能被转录并产生mRNA。也就是说凡碱基排列顺序与mRNA 相同的单链DNA 或RNA , 称(+ )DNA 链或(+ )RNA 链, 凡碱基排列顺序与mRNA链互补的单链DNA 和RNA , 称(- )DNA 链或(- )RNA 链结构蛋白质：要形成完整，成熟，有感染性病毒粒子的蛋白质成分 ,包括：壳体蛋白、包膜蛋白、酶 非结构蛋白质：是由病毒基因编码，并不存在于病毒中，主要在病毒复制过程中发挥作用非结构蛋白：病毒本身基因组所形成，与病毒核酸复制有关，病毒感染宿主后，形成的前体蛋白或早期蛋白。结构蛋白的几种成分1.衣壳蛋白：构成病毒壳体的蛋白质，由一条或多条多肽链折叠形成的蛋白质亚基，是构成壳体蛋白的最小单位。单一：一种亚基 复杂：几种亚基 功能：构成病毒的壳体，保护病毒的核酸。无包膜病毒的壳体蛋白参与病毒的吸附、进入，决定病毒的宿主嗜性，同时还是病毒的表面抗原。抗原性质：有些可凝聚血细胞（血细胞凝聚特性）2.包膜蛋白：构成病毒包膜结构的病毒蛋白质，包括包膜糖蛋白和基质蛋白两类。包膜糖蛋白类似于壳体蛋白（无包膜）的功能 与病毒吸附侵入，抗原性，血细胞凝聚特性。基质蛋白：非糖基化蛋白，主要识别病毒核壳，在病毒核壳与包膜间起桥梁作用 3.酶：来源于病毒本身基因组功能表达的蛋白质分子，在病毒复制起作用 4.病毒的脂质：许多病毒包膜内存在有脂类化合物，如磷脂、脂肪酸、甘油三酸脂和胆固醇等。这些脂类几乎都是由病毒粒子在细胞内成熟，在细胞膜处以芽生方式释放，直接从寄主细胞膜上得到。病毒脂类存在与病毒的吸附和侵入有关。囊膜（Envelope）：某些病毒，如虫媒病毒、人类免疫缺陷病毒、疱疹病毒等，在核衣壳外包绕着一层含脂蛋白的外膜，称为“囊膜”。囊膜中含有双层脂质、多糖和蛋白质，其中蛋白质具有病毒特异性，常与多糖构成糖蛋白亚单位，嵌合在脂质层，表面呈棘状突起，称“剌突(Spike)或囊微粒(Peplomer)”。它们位于病毒体的表面，有高度的抗原性，并能选择性地与宿主细胞受体结合，促使病毒囊膜与宿主细胞膜融合，感染性核衣壳进入胞内而导致感染。囊膜中的脂质与宿主细胞膜或核膜成分相似，证明病毒是以“出芽”方式，从宿主细胞内释放过程中获得了细胞膜或核膜成分。有囊膜病毒对脂溶剂和其他有机溶剂敏感，失去囊膜后便丧失了感染性。5.病毒的糖类：除病毒的核酸中所含戊糖外，有的病毒还含有少量的其他糖类，为核糖或脱氧核糖和磷酸组成的核酸骨架。有包膜病毒中碳水化合物以寡糖侧链的形式与蛋白质结合形成包膜糖蛋白。6.其它组成：在某些动物、植物病毒中存在多胺类有机阳离子，包括丁二胺、亚精胺、精胺等，它们大都结合于病毒核酸，对核酸的构型有一定影响。在某些病毒的病毒体中，还发现有其它的小分子量组份，如ATP，对噬菌体尾鞘收缩提供能量。病毒蛋白质衣壳的功能（1）致密稳定的衣壳结构除赋予病毒固有的形状外，还可保护内部核酸免遭外环境（如血流）中核酸酶的破坏；（2）衣壳蛋白质是病毒基因产物，具有病毒特异的抗原性，可刺激机体产生抗原病毒免疫应答；（3）具有辅助感染作用，病毒表面特异性受体 边连结蛋白与细胞表面相应受体有特殊的亲和力，是病毒选择性吸附宿主细胞并建立感染灶的首要步骤。三、病毒粒子的对称性病毒的壳体结构决定了整个病毒体的结构形状 衣壳是由许多“壳微粒(Capsomere)”按一定几何构型集结而成，壳微粒在电镜下可见，是病毒衣壳的形态学亚单位，它由一至数条结构多肽能成。立体对称螺旋对称复合对称 第五章 病毒的感染性繁殖一、研究病毒复制的一般性方法1、建立病毒复制的实验研究系统 无论是哪种培养系统，都要考虑： 宿主细胞的敏感性与生理状态 注意感染复数 病毒感染宿主细胞后，会导致宿主细胞出现裂缝，胞内的物质渗漏，使宿主细胞死亡。 要尽可能做到感染复数为1，即一个对一个。感染复数(multiplicity of infection, m.o.i) ：用以起始病毒感染的每个细胞所需的病毒颗粒数目。单位（PFU/cell） 2、一步生长实验取样，分别测定溶液的感染效价，以培养时间为横坐标，感染效价为纵坐标，画出一步生长曲线，体现3个特征：潜伏期增长期稳定期 潜伏期中包含有隐蔽期，隐蔽期是有感染性的病毒粒子从消失到出现这段时期。 3、成熟前的裂解病毒如何体现生命特征：病毒吸附寄主细胞后，核酸进入胞内，病毒的基因组利用宿主细胞的大分子合成装置，进行核酸的复制和基因组的表达。二、病毒的增殖病毒复制周期1. 吸附（Adsorption）指病毒附着于敏感细胞的表面，它是感染的起始期。细胞与病毒相互作用最初是偶然碰撞和静电作用，这是可逆的联结。随后的特异性吸附是非常重要的，根据这一点可确定许多病毒的宿主范围，不吸附就不能引起感染。接触结合特异性吸附（病毒配体位点与细胞膜特异受体结合）.能否吸附成功取决于：环境因子、病毒吸附蛋白VAP、细胞受体2. 侵入（Penetration）:注射式侵入、细胞内吞、膜融合以及其他特殊的侵入方式。注射：有尾噬菌体的侵入方式。吸附尾钉固着尾鞘收缩尾管穿入DNA注入。 3. 脱壳（uncoating）4. 生物合成（biosynthesis）转录的调节 可利用宿主的转录酶进行转录，某些噬菌体本身携带转录酶，当转录酶与DNA进入细胞后，转录即刻开始，小的DNA噬菌体完全依赖宿主的转录酶。 某些噬菌体线形DNA以极性的方式进入胞内，由于固定一端的部分侵入，可以导致不同的基因依次被转录。 在同一转录单位的基因相继转录，靠近启动子的基因优先转录。 宿主转录酶的修饰，可以改变它与调节亚基的相互作用。 噬菌体因子与宿主转录酶的结合可以改变转录起始与终止的特异性。 噬菌体DNA出现单链的缺口或间隙可以改变它的模板性质。 不同噬菌体的mRNA的功能活性持续的时间有别。 噬菌体的多顺反子的mRNA切割成小mRNA。 DNA噬菌体的大分子物质的调节 ：mRNA的5端无帽子结构，3端无聚腺苷酸，并且能够形成部分双链区域，还可直接进行翻译，转录与翻译是互相偶联的。 5. 装配与释放（assembly and release）在宿主细胞内，有一个前体池，合成的蛋白质等累积在前体池，等达到一定浓度以后，就会以一定方式形成有感染性的病毒粒子的生物学过程称为病毒的装配。形成的有感染性的病毒粒子通过一定方式离开宿主细胞称为病毒的释放。 释放：裂解、出芽。绝大多数无包膜病毒释放时被感染的细胞崩解，释放出病毒颗粒，宿主细胞膜破坏，细胞迅即死亡。绝大多数有包膜病毒通过细胞内的内质网、空泡，或包上细胞核膜或细胞膜以出芽方式释放而成为成熟病毒，在一段时间内逐个释出，对细胞膜破坏轻，宿主细胞死亡慢。从单个病毒吸附开始至所有病毒释放，此过程称为感染周期或复制周期。一个感染细胞一般释放的病毒数约为100-1000。非增殖性感染：病毒感染宿主细胞以后不能产生有感染 性的病毒粒子就叫非增殖性感染。原因可能是病毒基因组侵入细胞后任一阶段出现差错，宿主的DNA蛋白等仍能合成，可能是装配和释放过程出现错误，从而导致非增殖性感染出现。 整合感染：病毒的基因组整合在宿主细胞染色体上，这种感染方式也不产生有感染性的病毒粒子，但与上面所说的那些不同，因为它们的基因组没有整合到宿主染色体上。 1. 非增殖性感染原因有两大类：a.源于细胞本身产生非允许细胞 （病毒无法完成感染）b.源于病毒本身产生缺损病毒造成缺损病毒的5种形式： 干扰缺损病毒（DI病毒） 整合的病毒基因组 卫星病毒 条件缺损病毒 假病毒体 DI病毒的特点：基因组是存在缺失的，不同的DI病毒缺损的大小数量是不同的，有的达到90%，但无论缺损多少，都必需保留有：a.为病毒复制起始化的序列；b.病毒壳体化序列。 可以干扰同源的标准病毒的复制，DI病毒和标准病毒为了复制竞争相同的基因功能产物而发生选择性的复制过程，且这种情况下，DI病毒一般处于优势，因为DI病毒含有较小的基因组，对核酸酶的亲和力较大，从而使标准病毒复制数量大大降低。必须依赖同源病毒才能进行复制。具有与标准病毒相同的形态特征，结构蛋白与抗原性。 卫星病毒特征是具有极端寄生性，寄生于与之无关的辅助病毒上，基因产物的病毒与DI颗粒有相似性：它也是缺损病毒，必须依赖于辅助病毒才能进行复制，并且能够干扰辅助病毒的复制；但与DI颗粒也有不同：卫星病毒并不是来源于辅助病毒的亚基因组突变体，它是在自然界中存在的一类病毒，于辅助病毒的DNA/RNA毫无关系。在病毒感染过程中，由于宿主细胞核酸完全取代了病毒基因组核酸的一类病毒，则称为假病毒体。 条件缺损病毒 ：一类基因组发生突变的条件致死突变体，在一定条件下可以增殖，在另一条件下导致病毒的死亡。处于流产感染状态的病毒，可以通过一定办法，使它们完成增殖性感染，从而产生子代病毒粒子。 协同培养：2种或2种以上的细胞来混合培养，假如其中一种细胞是另一种细胞中的病毒允许细胞则混合培养可使病毒增殖。协同感染：由2种或2种以上的病毒同时感染一个细胞，因为其中辅助病毒可为流产感染病毒提供繁殖所必需的基因产物。 第六章 病毒的遗传与变异一、病毒的突变指基因组中核酸碱基顺序上的化学变化，可以是一个核苷酸的改变，也可为上百上千个核苷酸的缺失或易位。 野生型病毒株（wild type）：通常是实验室适应的，并且与突变体进行比较和选择的病毒株，本身也含有某个性状的突变。这种野生型要与从自然界的宿主种直接分离到的野外分离株分开来，这个代表真正的野生型菌株，叫野外分离株。 （病毒）株（strain）：同一病毒不同的野生型。 型（type）：利用感染型的中和作用所确定的具有不同的血清型的病毒株。突变体（mutant）：有明确的突变，表型不同于野生型的病毒株 。变异株（variant）：变异株是表型不同于野生型，而变异原因不清楚的病毒株。 二、自发突变和诱发突变1. 自发突变：在无任何已知诱变剂的条件下所产生的突变。 DNA病毒和RNA病毒的自发突变有明显区别：DNA：有一整套完整的DNA复制、核对、修正系统RNA：不能自动修复。突变效率：DNA 10-810-9、RNA 10-3 10-4。2. 诱发突变：在各种理化因子存在的条件下提高突变力的措施。人们根据诱发突变的本质和途径，分为： 体外诱变剂 主要是通过一些化学物质时化学物质对核酸的化学作用核酸的变异碱基的置换（a.转换 b.颠换） 体内诱变剂：a.碱基类似物：通过互变异构效应来完成碱基置换（烯醇式酮式） b.嵌入体：吖啶类染料插入到核酸分子之间，导致核酸移码互变。这2种物质所引起的核酸的变异，都需要病毒细胞处于代谢活性状态，此时核酸处于复制阶段，对处于静止状态的病毒，这2种物质无作用。紫外线对生物体的损害主要是形成嘧啶二聚体：链间形成的嘧啶二聚体能破坏双链的拆分 、链内形成的嘧啶二聚体导致碱基配对的错误 三、病毒突变体的类型 根据同源突变的核酸： 沉默突变：同意突变 误意突变：错义突变 无意突变：无义突变 移框突变 缺失突变 根据突变的表型： 噬斑突变 条件致死突变 抗原性突变 宿主范围突变。突变株与原先的野生型病毒 (Wild-type virus)特性不同，表现为病毒毒力、抗原组成、温度和宿主范围等方面的改变。1毒力改变: 有强毒株及弱毒株，后者可制成弱毒活病毒疫苗，如脊液灰质炎疫苗、麻疹疫苗等。2条件致死突变株 ：指病毒突变后在特定条件下能生长，而在原来条件下不能繁殖而被致死。其中最主要是的是温度敏感条件致死突变株（Temperature-sensitive conditional lethalmutant），简称温度敏感突变株(ts株)，在特定温度（2835）下孵育则能增殖，在非特定温度（3740）下孵育则不能繁殖，而野生型在两种温度均能增殖。3.宿主范围突变株：病毒基因组改变影响了对宿主细胞的感染范围，可感染野生型病毒不能感染的细胞。宿主适应性突株： 例如狂犬病毒突变株适应在兔脑内增殖，由“街毒”变为“固定毒”，可制成狂犬病疫苗。如何保持病毒遗传形状的稳定： 采用分离纯的病毒克隆：挑取单个噬菌斑获得较纯的病毒粒子 将已纯化的病毒粒子保存在严格的条件下 尽量地减少传代的次数 四、病毒的基因重组当二种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于亲代的可遗传的子代，称为基因重组（Genetic recombination）。分子内重组：通常指发生在单一基因组内的DNA或RNA病毒中。需要核酸分子的断裂与其他核酸分子的再连接。拷贝选择重组：发生在部分具有单一分子基因组RNA病毒中，不涉及核酸分子的共价键断裂，RNA聚合酶选择性地连接到静止模板链上进行了RNA子代链的合成。基因重配：具分段基因组的RNA病毒中。在重组过程中，它没有核酸分子共价键的破坏，而是具有分段基因组病毒间的核酸片段交换，基因组各片段在子代病毒中随机分配。动物病毒的基因重组特征：具分段的基因组RNA病毒：在不同毒株之间的混合感染的时候，重组的频率非常高，有点甚至达到50%。具单组分基因组的病毒：大分子物质积聚在前体池中，一定浓度下进行装配，过程中往往是随即分配，因此对一些单组分的基因组（分子较短）来说，重组频率比较低，多组分的频率比较高。逆转录病毒：是一种非常特殊的病毒，其它病毒都是单倍体，只有它是二倍体，所以在病毒混合感染中，重组频率比较高。 植物病毒的基因重组 植物病毒混合感染：除具有分段基因组的植物病毒与上述感染特征相似外，其它的植物病毒表现出不同的特征：感染过程中存在相互干扰现象。突变与重组难以区分：由于植物病毒一般来说都是很少基因重组，频率低，很难判断。 1活病毒间的重组 ：例如流感病毒两个亚型之间可基因重组，产生新的杂交株，即具有一个亲代的血凝素和另一亲代的神经氨酸酶。这在探索自然病毒变异原理中具有重要意义。流感每隔十年左右引起一次世界性大流行，可能是由于人的流感病毒与某些动物（鸡、马、猪）的流感病毒间发生基因重组所致。2灭活病毒间的重组 ：例如用紫外线灭活的两株同种病毒，若一同培养后，常可使灭活的病毒复活，产生出感染性病毒体，此称为多重复活（Multiplicity reactivation），这是因为两种病毒核酸上受损害的基因部位不同，由于重组相互弥补而得到复活。因此现今不用紫外线灭活病毒制造疫苗，以防病毒复活危险。3死活病毒间的重组 ：例如将能在鸡胚中生长良好的甲型流感病毒（A0或A1亚型）疫苗株经紫外线灭活后，再加亚洲甲型（A2亚型）活流感病毒一同培养，产生出具有前者特点的A2亚型流感病毒，可供制作疫苗，此称为交叉复活。五、基因产物的相互作用1表型混合(Phenotype mixing) ：两种病毒混合感染后，一个病毒的基因组偶而装入另一病毒的衣壳内，或装入两个病毒成分构成的衣壳内，发生表型混合。这种混合是不稳定的，传代后可恢复其原来的特性。2基因型混合(Genotype mixing) ：指两种病毒的核酸偶而混合装在同一病毒衣壳内，或两种病毒的核衣壳偶尔包在一个囊膜内，但它们的核酸都未重组合，所以没有遗传性。病毒基因组的构建方法一、遗传学方法重组作图原理：当两株带有不同标记的病毒突变体感染同一细胞培养物时，其标记基因的位置越接近，突变体经过交换产生的病毒重组体频率越低。单一分子病毒基因组：重组通过断裂与重接机制或拷贝选择机制进行，两个突变体间的重组频率与其在基因组上的物理距离呈递级关系。依据重组频率大小排列可以对各突变体标记基因在染色体上进行精确定位。分段基因组病毒：重组频率是一种有、无类型。ts是在重组分析中最常用的突变体。中间型杂交（血清型或株系）以表型变化、核酸的电泳迁移率等作为遗传学标记，可对分段基因组病毒进行基因作图。病毒蛋白电泳迁移率作为遗传标记，确定特定蛋白的基因定位与作图。中间型多因子杂交在研究DNA病毒病理发生遗传学中发挥作用。二、分子生物学方法1. 序列分析：提供信息：ORF；利用生物信息学，分析蛋白功能；确定基因表达的短序列基元（启动子、转录起点、终止子、mRNA切割位点，翻译起始位点等）2. 转录图与多肽图。转录图：cDNA图。 多肽图：蛋白质组图。3互补 (Complementation) ：指两种病毒通过其产生的蛋白质产物（如酶、衣壳或囊膜）相补充，例如辅助病毒与缺损病毒间、两个缺损病毒间、活病毒与死病毒间都可以互补，互补后仍产生原来病毒的子代。4增强(Enhancement) ：指两种病毒混合培养时，一种病毒能促进、增强另一种病毒的产量，可能是因为前者压制了产生干扰素所致。 六、病毒变异的实际意义1研制减毒活疫苗：如ts株、宿主适应性突变株的研制。2应用于基因工程：目前病毒基因工程正沿着二个方向发展：一是将编码病毒表面抗原的基因移植到质粒中去，在大肠杆菌中产生大量表面抗原物质，以制备疫苗或诊断用抗原。如乙型肺炎病毒编码表面抗原的DNA片段已在酵母菌中表达，该疫苗正进行人体观察；二是探索病毒作为基因工程载体的可能性，以便将所需要的外源基因带入人体或动物体内，以治疗人类遗传疾病或创造动物新品种的目的。 第七章 病毒的起源与进化团聚体小滴性质：直径 1 mm 500 mm；稳定存在几小时至几周；外周增厚呈膜状结构，与周围水液有明显界限；具原始代谢特征；可以增长和繁殖。微球体性质:1 mm2 mm（相当于细菌大小）；可吸纳周围环境的脂类，并形成膜状结构；膜表现选择透性，反映渗透压变化；吸纳周围环境中蛋白质分子，微球体可“增长”和“繁殖”。“RNA 世界”假说：最原始的细胞是由一身兼有酶和繁殖二任的原始RNA 主宰的;以后经过氨酰反应合成了蛋白质,进化为以“RNA -蛋白质”为基础的细胞. 最后,再经过核苷酸的脱氧,进化为现代的“DNA - RNA - 蛋白质”为基础的细胞.难以解决的、根本性的问题：例如，RNA 在没有相应的酶系统作用下，在水溶液中是难以聚合，原始的RNA 从何而来呢? 至于复制问题,人们虽可在非酶促条件下,令核苷酸分子在人工合成的RNA 模板上聚合. 然而在形成一段寡核苷酸短链后,便停了下来,聚合点无法向前移动. 那么,在没有酶催化的情下,RNA 链能否完全复制呢? RNA world ：1，核酶具有催化功能，能主导反应；2，RNA带有遗传信息，可自主复制；3，许多辅酶和能量分子都带有RNA分子。三、病毒的起源1）退化性起源学说2）生物大分子细胞病毒学说3）生物大分子到病毒学说四、病毒的进化 1. 研究病毒进化的复杂性(1) 病毒特别小,无法用常规的进化生物学方法研究病毒进化;(2) 病毒不像其他生物有“化石”或“遗体”可供进化研究之用;(3) 病毒的进化有一定的随机性,每一步演变都有一定的概率。很难从病毒的现状或短暂时间内病毒演变的情况,来推论出病毒演变的过去和未来。2. 病毒进化的基础 变异是病毒进化的基础 a、突变 突变主要是指单个碱基的替换、插入或缺失。不同病毒的变异频率差异很大。变异性差异反映了寄主范围的差异。微观进化(microevolution) ,是病毒“准种”形成的原因。b、重组 重组是复制时不同遗传变株的核苷酸链间交换遗传信息片段的过程,可分为同源重组和非同源重组。重组是宏观进化(macroevolution) ,病毒通过重组可以获得新的基因,增加对寄主的适合度,使有益性状得以产生和传播,使有害性状得以清除。 c、重排 有些植物RNA 病毒的基因组是分离的,这些病毒的RNA 片段可以进行种间交流,即重排(reassortment)也称假重组(pseudorecombination)。重排也是造成变异的一种机制。基因重复(gene duplication) 也是病毒进化的一种推动力。3细胞基因、转基因等对病毒进化的影响 a、病毒基因与细胞基因的重组 病毒和其寄主中表达的一些基因可能发生许多重组,进而产生毒性更强的新变株(种) 。b、病毒基因与转基因的重组 转基因与缺陷型病毒间可以重组,而且重组恢复很容易检测到。c、入侵病毒对病毒进化的影响 如果植物在自然条件下受两种或多种病毒的侵染,可能会产生新的病毒。异源重组一般不亲和,即使亲和其功能也不全,在竞争中处于劣势,因而多不能存活。寄主转基因与病毒重组出现毒力更强病毒的可能性更小。4. 病毒进化的基本特征 (1) 新病毒不断产生,而且基本上是从另一种宿主的病毒演化而来。(2) 新病毒产生后,在新的宿主以较快的速度进行变异。(3) 新病毒稳定后,病毒的毒力大多处在中等水平上。 (4) 病毒的进化既有一定的随机性,又受到一定的选择压力而呈现一定的方向性和稳定性。 (5) 病毒的各个基因以及基因的各个部分,在进化上具有不同的进化特征。 5. 病毒进化的根本目的是增加病毒的多样性。6、病毒进化的研究方法病毒基因组特别小,进化快,受干扰因素少, 是一种研究进化问题的很好材料。 研究病毒的进化有多种方法，可以通过序列同源性、基因组排列顺序、基因组的基因组成等方面构建病毒的进化树。一组相关病毒的进化史称为种系发生,通常以分叉的进化树表示,两个枝端的毒株在其起点处有着共同的祖先。毒株的亲缘关系的远近以树枝的长短表示。进化树的推导受多种因素的影响。一方面由于快速测序技术的发展, 毒株序列数据积累很多, 样本越多它们之间种系关系中可能的排列组合方式呈指数增加, 从中可能推导出的树的种类就越多, 这就给分析工作增加了难度。另一方面, 毒株的样本收集不全也会使得出的进化树与真实的情况有差异。第八章 病毒与肿瘤 2007一、肿瘤的概念 肿瘤是机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织细胞基因发生改变导致克隆性增生而形成的新生物，通常形成肿块。（一）肿瘤的增生1 呈持续性、自主性生长，与机体不协调，原因去除仍能继续生长。2 具有不成熟性，在不同程度上失去了分化成熟的能力。3 有害无益。（二）生理、炎症和损伤的增生1 都为机体生存所需要的增生，与机体协调，受机体控制，原因去除增生停止。2 都具有成熟性。3 多数对机体有利 三、肿瘤发病机理遗传因素（一）、体细胞突变正常细胞-突变癌前细胞-促癌因素肿瘤1、肿瘤的单克隆起源学说：特异标记染色体；相同同工酶2、两次突变说：视网膜母细胞瘤3、基因外调节学说：蛋白质、RNA、生物膜改变；基因修饰；（二）、癌基因1、种族差异2、家族聚集3、遗传性肿瘤4、遗传缺陷、染色体畸变与肿瘤环境因素致癌因子物理致癌因子：很多能产生辐射的物质，电离辐射、X射线、紫外线、太阳光化学致癌因子：砷、煤焦油及其衍生物、苯、某些烃类、苯胺（一种用于染色的物质）、石棉等。生物因素病毒致癌因子。 四、肿瘤发生机制的学说1、单克隆起源学说（或者体细胞突变）肿瘤细胞群体来自单一细胞的克隆。学说的证实：(1)女性葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)基因在肿瘤中表现出均失活或均不失活。(2)同一肿瘤所有细胞具有相同的标记染色体。2、二次突变论学说：细胞必须发生两次突变才能形成肿瘤。遗传性肿瘤的第一次突变发生在生殖细胞内，并遗传给后代，后代体细胞又一次发生突变，使细胞转化。学说的证实：遗传性视网膜母细胞瘤：双侧，早发，家族性。散发性视网膜母细胞瘤：单侧，晚发，散发性。“二次突变”假说的意义一，为解决遗传性和体细胞突变通过何种机制在肿瘤发生过程中起作用提供了思路。二，肿瘤细胞发生过程中隐性遗传性决定因素与体细胞表型连接起来。3、多步骤遗传损伤学说：细胞癌变需要多个肿瘤相关基因的协同作用，须经过多阶段的演变，这些基因的激活/失活在时间上有先后顺序，在空间位置上有一定配合。肿瘤的起始阶段原癌基因激活（逆转录病毒的插入和原癌基因的点突变）。肿瘤的演进阶段染色体重排、基因重组、基因扩增。癌基因(oncogene,onc)能够使细胞癌变的基因统称为癌基因。癌基因是正常细胞中的基因，是细胞的必须基因癌基因已被证实是正常存在于生物(包括人类)基因组内的,它的结构异常或表达异常,也的确可以引起细胞癌变.控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性。（一）病毒癌基因逆转录病毒中，能够引发肿瘤的基因片段。这个片段来源于宿主基因组而非原病毒基因组，宿主RNA逆转录后插入病毒中，作为病毒的一部分。此插入片段的编码蛋白是肿瘤的强诱导剂。 致瘤病毒中存在的某些核苷酸序列称为癌基因,即病毒癌基因(v-onc)。将逆转录病毒上所含的致癌基因称为v-onc,而将宿主细胞基因组中的同源基因称为原癌基因或细胞癌基因。(二) 细胞癌基因是指真核细胞中存在的一段核苷酸序列,这段核苷酸序列在正常细胞中以非激活形式存在,故又称原癌基因(proto-onc).在某些特定条件下激活可致癌变。对应宿主细