纳米药物的有效性与安全性评价.docVIP

第14章 纳米药物的有效性与安全性评价14.1概述 大量的研究已证明，纳米粒具有特殊的生物学特性。纳米载药系统能使许多药物的药效学和安全性特征发生较大或根本性变化，从而使其临床使用价值大大提高1。近年来，纳米技术正广泛用于改善药物的释药性能和药动学特征、提高治疗药物的靶向性、降低药物的毒性或用作基因治疗的载体等。纳米制剂已成为解决药物制剂难题的一项重要手段。在纳米药物的研究开发中，纳米制剂的有效性和安全性是倍受关注的问题。近年来，对纳米药物的有效性和安全性研究已取得了一些进展。在有效性研究方面，集中于提高难吸收药物的生物利用度、抗肿瘤药物的组织靶向性、提高药物的脑靶向性分布、作为基因治疗载体的表达效率等研究。安全性评价方面主要研究纳米药物降低药物的全身性毒性、纳米载药系统的细胞毒性评价、纳米脑靶向药物对血脑屏障的影响等。但至今纳米药物在有效性和安全性评价方面的技术性规范尚未建立。对纳米药物的有效性和安全性评价，应遵循新药药理毒理学研究的一般原则，同时应结合纳米粒的生物学特性，有针对性增加相关性研究，如纳米药物在用药局部的致炎性、纳米药物对机体免疫系统的影响、纳米材料的生物相容性与细胞毒性、吸入性纳米药物在肺部的沉积、纳米粒对血液循环系统的影响、纳米粒对各种屏障系统的损伤等。纳米药物的脑组织分布及对神经系统的损害、纳米药物的致突变性、纳米药物对靶向组织的致癌性也应认真考虑。14.2纳米药物的药物动力学评价14.2.1药物动力学评价方法药物动力学(Pharmacokinetics)是研究机体对药物处置规律的科学。血药浓度经时变化规律的研究是药物动力学的基本内容，由此可得到药物在机体内的动力学参数。系统的药物动力学包括机体对受试物的吸收、分布、代谢及排泄等过程的研究。随着药物动力学学科的发展，形成了一些新的分支，包括疾病状态下的药物动力学、群体药物动力学及药物代谢物的动力学等。内源性药物代谢动力学、生物技术产品药物动力学、中药药动学等也已引起重视。药物动力学研究常用方法是整体动物实验，离体实验方法如透皮吸收、细胞培养方法如结肠腺癌细胞株（Caco-2）单层小肠吸收模型等常用于评价药物的经皮或经肠道吸收情况。药物动力学研究在新药研制及评价中具有十分重要的意义，是新药和新制剂研制的基本内容。目的在于认识药物进入体内后的转运、药物从体内排出的形式与速度、不同剂量下变化的异同等规律。系统的药物动力学研究可以提供药物多方面的信息，为药物的有效性与安全性评价提供依据。其实用价值包括：利用药物消除半衰期指导临床用药方案的制定 ；通过生物利用度研究进行药物等效性评价；通过药物的组织分布研究分析药物作用的靶向性；通过药物代谢研究发现新的活性化合物；通过比较药物动力学研究使不同用药人群用药群体化；通过疾病状态药物动力学调整用药方案 ；通过多剂量药物动力学研究评价药物的蓄积作用；通过药物动力学研究指导新药的定向修饰；通过排泄实验分析药物的消除情况。药物动力学包括非临床药物动力学和临床药物动力学。非临床药物动力学研究内容较广泛，并可为临床药物动力学研究提供大量信息。以下主要介绍非临床药物动力学的研究方法。1 药物动力学研究总体要求药物：试验样品应符合质量标准要求，并与药效学和安全性评价所用样品一致。应全面了解药物的物理和化学性质，并按其理化特性的要求保存试验样品。动物：通常应选择啮齿类（大鼠）和非啮齿类动物（犬）进行实验，雌雄动物各半。不宜选用草食动物进行吸收实验。应考察不同年龄和不同生理状态动物的差别。剂量：应进行不同剂量的药动学研究，以考察吸收和消除过程是否为一级动力学过程。一般设3个剂量组，高剂量接近最大耐受量，低剂量接近最低有效剂量。给药途径：一般应与临床拟用途径一致，水溶性药物还应进行静脉给药途径研究。2 生物样品药物分析方法的建立与确证生物样品的药物分析方法的建立是药物动力学研究的基础。近年来，药物分析方法发展迅速，除常用的微生物法、色谱法、放射性标记法外，色谱-质谱联用、免疫学方法也已较广泛应用。在建立方法后应按要求进行特异性、准确度、精确度、灵敏度、稳定性等研究。分析方法应建立测定的标准曲线，并确定最低定量限（LOQ）和线性范围。标准曲线应覆盖样品可能的浓度范围，系列浓度包括58个不同浓度的样品，并另设不含药物的空白样品。特异性是样品中存在干扰成分（主要是生物样品中内源性物质）情况下，分析方法是否能准确、专一测定药物及其代谢物。一般用样品的制样方法进行提取，测定其色谱和光谱行为，并与分析物溶剂进行比较，以确实有无干扰。准确度指测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度，一般用药物回收率表示。应在标准曲线的范围内选择低、中、高3个浓度，每个浓度至少测定5次。应注意考察最低定量限附近的回收率。通常认为回收率应达至70%以上。精确度是指同一样品多次测定的结果符合程度，用相对标准偏差（RSD）表示。可细分为日内精确度和日间精确度。日内应选择3个浓度，重复测定5次。日间应在不同时间测定5次以上。稳定性是考察样品在采取、制样、贮备、测定过程中的稳定情况，以确定适宜的相关条件和注意事项。生物样品通常在-20保存，不宜反复冻融，测定时适当避光，测定时放置时间不超过24h。3 药物动力学研究项目血药浓度-时间曲线：常称为药-时曲线，是计算血药动力学参数的基础。实验动物一般雌雄各半，每个采样点不少于5个数据，尽可能得到每个动物的完整药时曲线。采样点分布一般包括吸收相23个点，平衡相至少3个点，消除相46个点。采样持续时间为35个消除半衰期或血药浓度降至峰浓度的1/101/20。所得药动学参数血管内给药包括消除半衰期（t1/2）、表观分布容积（Vd）、药时曲线下面积（AUC）、清除率（CL）、平均滞留时间（MRT）等，血管外还应包括达峰时间（Tmax）和峰浓度（Cmax）。吸收：血管外给药的药物应研究药物的吸收部位和吸程度，并应考察食物对吸收的影响。口服给药的吸收部位主要在小肠，少数药物亦可能在胃部吸收，局部给药在用药部位吸收。生物利用度是指药物进入体内的程度和速度，根据参比药物用药途径不同分为绝对生物利用度和相对生物利用度。同一药物血管外给药与血管内给药的比较称为绝对生物利用度；血管外给药间的比较则称为相对生物利用度。分布：应有针对性地对药物的效应部位及毒性靶组织进行药物浓度检测。测定多个采样点的分布情况，通常在血药峰浓度时设1个采样点，在消除相再设12个采样点。通过测定脑脊液和乳汁中药物浓度，以考察药物通过血脑屏障、血乳屏障情况。应特别注意监测药物浓度高、蓄积时间长的器官和组织中药物浓度变化情况。代谢：创新药物应进行代谢类型、代谢途径和代谢物确证的研究。还应进行药物对药物代谢酶影响的研究，观察对细胞色素P450同工酶的诱导或抑制作用，以便分析药物代谢的相互作用。可根据药物结构，分析可能出现的代谢物。也可通过体内代谢物检测，推断药物的代谢途径。排泄：通过对尿液和粪便中药物和代谢物的回收测定，分析药物从体内排泄的主要途径。当药物代谢物情况不明确时，可通过同位素标记的方法，测定药物和代谢物总体排泄情况。用尿液、粪便中药物回收的总量计算出尿液和粪便中药物排泄率。当胆汁药物浓度较高时，应分析是否存在药物肝肠循环过程。药物的血浆蛋白结合率：常采用平衡透析法测定，也可采用凝胶过滤、超过滤、分配平衡等方法测定。药物血浆蛋白结合率大小影响药物的分布和消除。当血浆中存在不同药物与同一蛋白竞争结合时，可能出现药物体内的相互作用。4 药物动力学数据处理与分析血药浓度-时间曲线通过药物动力学计算得到相关动力学参数。国内常用软件为中国药理学会数学药理专业委员会编写的3P87（3P97）实用药动学计算程序及大型药理学计算软件DAS（Drug and Statistics）。国外软件有美国WinNonlin软件和NONMEN软件。药动学数据处理时应判断属线性还是非线性动力学模型。采用房室模型分析时，应判断房室模型情况。具体使用方法参考软件使用介绍。14.2.2 纳米药物的药物动力学特征 药物通过纳米化，其理化性质如溶出度、饱和溶解度、晶型、溶出速度、亲水亲脂性等界面化学性质发生了改变，进而影响其生物药剂学及药物动力学行为，如生物粘附性、在胃肠道的化学稳定性、口服生物利用度、缓控释特性和靶向特性等，最终达到增强药物疗效、降低药物不良反应、提高药物治疗指数、增强制剂顺应性等目的。1 纳米药物的吸收吸收是药物从用药部位进入体内的过程。药物非血管内给药方式都有吸收过程。药物的吸收大多通过被动过程，仅少数药物为主动吸收。药物因理化性质不同和用药部位不同，生物利用度存在较大的差异。同一药物因剂型或粒径的不同，生物利用度也可发生很大变化。一些难溶性药物、不稳定药物或大分子药物进行纳米化技术处理，能明显提高药物的生物利用度，从而提高药物治疗效果。药物的水溶性差影响药物的稳定性和生物利用度。将水溶性差的药物纳米化，制备的纳米悬浮液，生物利用度优于胶束溶液，所用表面活性剂的量大大减小，而且使药物缓释，易于靶向作用于肺脏、肝脏和脾脏 2。神经激肽受体拮抗剂阿瑞吡坦（aprepitant）在小肠碱性环境中水溶性低，难以吸收。阿瑞吡坦纳米化制剂，可增加药物的表面积，从而增加药物的溶解性，与胶束剂相比，纳米制剂不仅能提高生物利用度，还可消除食物对吸收的影响3。用纳米粒载带水溶性差的药物亦可改善吸收。环孢素A化学结构为环状11肽，不同助溶剂对环孢素A羟丙甲纤维素酞酸酯纳米粒在体内相对生物利用度的影响不同 4。制备酸敏感纳米粒也可提高生物利用度。用溶剂分散法制备环孢素A酸敏感纳米粒CyA-HPMCP，与环孢素A微乳进行相对生物利用度比较，相对生物利用度提高19.6%5。用聚甲基丙烯酸树脂甲基丙烯酸复合体制备环孢素A酸敏感纳米粒，与环孢素A微乳的相对生物利用度比较能提高13.6%32.5%6。纳米粒经修饰后可进一步提高其从肠道的吸收，采用Caco-2细胞作为体外模型评价口服生物降解聚合物纳米粒的摄入。细胞对维生素E和维生素E的衍生物（TPGS）包裹的聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）纳米粒的摄入量为聚乙烯乙醇（PVA）包裹的PLGA纳米粒的1.4倍，为裸聚乙烯苯纳米粒的46倍 7。2 纳米药物的组织分布纳米药物重要的生物特性为靶向性分布，靶向的形成主要是由于生物体对纳米粒转运方式的改变。纳米粒具有尺寸效应，可以透过血管内皮细胞进入器官或组织。纳米粒的表面修饰可提高靶细胞对纳米粒的识别。纳米药物靶向性根据层次可分为：组织与器官靶向，即药物对某一特殊器官或组织具有靶向性，如对肝脏、大脑或肿瘤组织具有靶向性；细胞靶向，即药物对机体某类细胞或某种器官、组织中的某类细胞具有靶向性；细胞器靶向，即对特异性细胞内某种细胞器具有靶向性。纳米药物靶向性根据转运方式可分为3种：被动靶向，即自然靶向，纳米药物通过生理过程从毛细血管内渗透进入器官或组织。被动靶向主要通过网状内皮系统的吞噬作用而实现。肝脏、脾脏、肺和骨髓等组织富含吞噬细胞，是纳米粒的主要靶向组织。静脉给药后，粒径小于50nm的粒子，能过过肝内皮细胞、淋巴系统到达脾脏和骨髓，或能进入肿瘤细胞。粒径50100nm的粒子，进入肝实质细胞。粒径100200nm的粒子，被吞噬细胞吞噬进入肝星形细胞。粒径大于是1000nm的粒子，被毛细血管网摄取或肺内毛细血管机械截留而被动靶向于肺。主动靶向，纳米药物通过靶细胞膜特异性转载系统进入靶细胞内。纳米粒表面经特殊修饰，可防止网状内皮细胞的吞噬，经靶向细胞表面特异性转载系统的作用而进入靶组织或器官。物理靶向，利用磁力、温度、pH等条件将药物输送至靶细胞内。（1）组织与器官的靶向性药物的脑靶向输送是一种重要的靶向药物输送方式。一般药物不能自由地通过血脑屏障（BBB）进入脑内，需要通过脑毛细血管内皮细胞上特异性受体进行运输。聚乙二醇（mPEG）-聚乳酸（PLA）/聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）具有良好的安全性和缓释作用，制成特异靶向性免疫纳米粒，通过连接细胞表面受体可将包裹的药物输送到脑内，且不改变血脑屏障的通透性8。用表面活性剂吐温和泊洛沙姆修饰聚氰基丙烯酸酯纳米粒后能将多种药物转运通过血脑屏障，包括阿霉素（doxorubicin）、洛哌丁胺（loperamide）、箭毒碱（tubocurarine）、肽类药物dalargin和kytorphin等。这些药物进入脑内可通过被动扩散或细胞主动转运9。用非离子表面活性剂、胆固醇和二乙酰磷酸制成的含甲氨蝶呤（MTX）的多层大囊泡（100125nm）经静脉注射后，尽管大量药物被肝脏摄取，但脑内MTX的水平更高，可能是由于大囊泡的组成对血脑屏障通透性的影响。紫杉醇因其低的血脑通透性和溶剂的多种严重不良反应而限制其用于临床脑瘤治疗，药物血脑屏障通透性低可能与紫杉醇和P-糖蛋白作用有关。将紫杉醇包裹于十六烷酯乙醇或吐温-80中制成纳米粒，用脑灌流模型评价紫杉醇的脑摄入能力,结果表明纳米粒能明显增加紫杉醇的脑摄入量，增加对表达药物外排泵P-糖蛋白的肿瘤细胞的毒性。紫杉醇纳米粒可能阻止了紫杉醇与P-糖蛋白的结合，从而提高药物脑和肿瘤细胞的摄入率10。用维生素B1连接聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE），并用微乳化技术制备纳米粒。维生素B1修饰的纳米粒更易粘附在血脑屏障的维生素B1转运体上而被脑组织摄取，从而改进脑对纳米粒的摄取11。Cu()螯合剂D-青霉素胺能有效溶解铜-淀粉样蛋白结合物（Cu-A），但D-青霉素胺因其亲水性而难以透过血脑屏障。D-青霉素胺通过二硫键或硫醚键与纳米粒结合后能通过血脑屏障而在大脑发挥作用，防止Cu -A结合物的蓄积，减少中枢系统金属离子蓄积，防治阿尔兹海默氏病及其它中枢神经系统疾病12。药物的肿瘤靶向输送是另一种重要的靶向药物输送方式13 14。对此，本书第二章已有详细论述，在此不再重复。胶体型纳米具有粒径小、释药缓慢特点，在胃肠道内可通过派伊氏旁路转运。当直径小于200nm的粒子进入体内后，可被淋巴网状内皮系统作为异物吞噬，尤其是肝脏枯否氏细胞摄入最高，从而形成被动靶向性。阿苯达唑聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）纳米粒（ABZ-PBCA-NP）的肝和脾中的靶向指数分别为11.4和3.9，肝和脾放射性之和占体内药物总量的46.5%，显示出对淋巴系统的靶向特性。脑中相对摄入量为阿苯达唑混悬液的44.0%，也可降低了药物的中枢毒性作用15。在荷Lewis肺癌的C57BL/6J小鼠比较明胶纳米粒和用PEG修饰的明胶纳米粒的分布。大多PEG修饰的明胶纳米粒存在于血液或被实体瘤、肝脏摄入，在血液中存留时间也较明胶纳米粒时间长，表明PEG能使纳米粒具有长循环的特性并能优先分布在肿瘤组织中16。Walker-256肝癌荷瘤大鼠肝动脉内注射阿霉素纳米粒较普通制剂在肝脏、脾脏和肿瘤中浓度明显升高，而其它组织中浓度则明显降低17。明胶和聚氰基丙烯酸正丁酯两种纳米粒用乳糖作为载体进行喷雾干燥，纳米粒可通过载体粒子输送至肺部， 当接触肺内皮水性环境时载体粒子发生溶解，可作为肺部释药和肺病诊断的新靶向系统18。（2）细胞靶向性在肿瘤血管内皮细胞表面表达特异性分子是用血管生成抑制剂进行抗癌治疗的关键。一些肿瘤特异性分子可通过噬菌体库（基因文库）方法判别。这些基因操作噬菌体表面修饰有随机产生的短肽，静注这些短肽在噬菌体基因表面表达，并粘附到内皮细胞相应结构上，作为配体与它的受体结合。噬菌体上产生多肽系列的DNA序列。这种血管定位寻找方法可用于诊断和肿瘤定向治疗。细胞毒药物可配对于纳米表面多肽，产生定位作用，降低全身性毒性19。阿霉素（dox）包裹在聚氰基丙烯酸烷酯（PIHCA）中制得PIHCA-dox纳米球，能防止P-糖蛋白介导的人肿瘤细胞株产生多药耐药性，明显改变或延迟其耐药过程20。纳米粒与核酸分子（aptamer）的复合物，具有明显的前列腺癌细胞靶向性，能被前列腺癌细胞株（LNCaP）表皮细胞占据，表达前列腺特异性膜抗原蛋白 21。明胶纳米粒通过抗生物素-生物素复合物的形式与生物素化（biotinylated）抗CD3抗体粘附，这种抗体修饰的纳米粒对T-淋巴细胞具有特异性靶向22。血管内皮细胞生长因子（VEGFR）-脂质体可特异性识别肿瘤血管内皮细胞，结合率为非特异性脂质体的2倍，载药的VEGFR-脂质体可特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞23。3 纳米药物的代谢与排泄 药物与纳米载体形成复合物后，可减少生物体内环境包括酸碱、酶及体液因子的破坏，防止药物在进入靶器官或组织前被代谢或破坏。纳米粒的吸附特性和释放特性可使纳米药物具有缓释作用。纳米粒生物吸附力强，可延长在体内滞留时间。通过增强纳米粒对肠道粘膜的附着力，可延长药物在肠道的吸收时间，从而减少直接排出体外的比例。药物被纳米材料包裹后，逐步从纳米粒中释放，从而达到缓释作用。聚乳酸-聚乙醇酸（PLGA）/蒙脱石（MMT）纳米粒是一种新型的生物粘附药物输送系统。用乳化/溶剂蒸发法制备紫杉醇PLGA/MMT纳米粒（平均粒径为310nm），为双相释药过程，包括快速相和缓慢相。与PLGA纳米粒比较，PLGA/MMT纳米粒在Caco-2细胞的细胞摄入能力提高57%177%，在HT-29细胞的摄入能力提高11%-55%。PLGA/MMT纳米制剂在胃肠道有较长的滞留时间，从而促进紫杉醇的释放24。用Caco-2细胞模型比较甲壳素与PEG修饰的脂质纳米粒作为降钙素口服输送载体的潜力。PEG包裹纳米粒不影响单层Caco-2细胞的渗透性，甲壳素包裹纳米粒则呈剂量相关的转载能力提高。与口服降钙素制剂比较，降钙素聚甲壳素纳米粒明显并持续降低血清钙水平。相反，降钙素PEG纳米粒与口服降钙素制剂比较在降低血钙作用无区别。表明甲壳素纳米粒具有作为多肽药物载体的潜力 25。转铁蛋白（transferrin）连接的紫杉醇PEG纳米粒具有主动靶向性，并能明显延迟紫杉醇从小鼠血液中的清除，24h内的药物浓度明显高于游离的紫杉醇注射液。纳米在体内肿瘤中分布呈蓄积性增加，给药后6h肿瘤中紫杉醇浓度为紫杉醇注射液或PEG纳米粒的4.8倍和2.1倍26。拓朴异构酶抑制剂喜树碱类药物水溶性差，并有不稳定的内酯环。用喜树碱、磷脂和聚乙二醇制备的纳米粒，性质稳定，半衰期长，抗瘤疗效优于伊立替康27。14.3 纳米药物的有效性评价一般说，纳米药物不是一类新的化合物，它是应用纳米技术研制的药物新剂型。纳米药物作为用纳米技术研究开发的新药物制剂，其生物效应除与药物和载体的性质有关外，还与纳米载药体系的粒径、表面电荷、亲水亲脂性等有关。因此对纳米药物的有效性评价除应遵循药物有效性评价的一般原则和方法，对纳米药物的特殊情况还应运用一些新的评价方法。14.3.1 药物有效性的评价技术与方法 1 药效学试验的一般原则28随机、对照、重复是药效学实验中应遵循的三大基本原则。随机：随机是使每个实验对象在接受试验处理时具有相等的机会，以减少主观因素的干扰，减少或避免实验对象分配不均衡而造成的误差。随机化方法可采用随机数字表的方法，或利用计算机随机功能进行随机化，这种方法为完全随机或绝对随机。在药物有效性研究中常采用“均衡随机”的方法，以减少能控制的非药物因素如性别、体重、年龄等造成的误差。具体方法是先根据能控制因素进行均衡分层，然后从各层中随机取出相同数量的动物分配到设定的实验组。对照：对照是确定药物有效性的基础。溶媒对照或生理盐水、蒸馏水对照称为“阴性对照”。在病理造模实验中，常设不造模的“正常对照”。已知有效的典型药物称为“阳性对照”，用于确定所进行实验的可靠性。在新药研究中，还常选择一种同类且在临床上广泛使用的药物作为对照，以评价被研究药物上市的潜在价值。各种对照组在动物数量及性别、体重、年龄等方面应与实验组基本一致。重复：重复有两种含义，一是在实验中应有足够的动物数或实验次数，即应具有一定的样本数，通常小鼠、大鼠应每组为1030只，家兔、猫为812只，犬为510只。另一意思是在同样条件进行实验重复，如抗肿瘤药效学实验需重复3次实验，以保证实验结果的可靠性。为保证实验的重现性，在实验条件方面如动物的品系、体重、年龄、性别、饲养条件等，药物的含量、溶媒、酸碱度、给药时间与间隔等应尽量保持一致，并在研究报告中予以介绍。2 评价方法29(1）药物有效性评价可分为体外和体内两类方法体外方法是在体外进行的药物有效性观察，包括离体器官和离体组织、细胞培养、试管测试等。体外试验减少了部分干扰因素，并可减少实验动物的用量。体外试验方法常用于药物作用机制的研究。体内方法是在整体动物进行的有效性观察，可用正常动物进行实验，也可使用病理模型动物。按用药期和实验观察期，可进行短期实验或长期实验。体内实验虽影响因素多，重现性较体外实验差，但接近人体情况，观察了药物的药动学和药效学过程，是药物有效性必须评价的内容。(2）不同层次的药物有效性研究方法完整的药物有效性评价应在整体、离体组织或器官、细胞和分子水平进行评价。目前生命科学发展迅速，现代生物学先进技术已大量用于药物的筛选与评价。生物大分子的研究是现代医学和药物学研究最基础和最有成效的领域，药物分子水平的研究是揭示药物作用机制的主要方法，人类基因组计划、后基因组研究是推进生命科学研究的主流。近年来，药物代谢组学、毒性代谢组学研究已得到高度重视，并已取得了一些进展，为了解药物或毒物对生物体整体性影响提供了帮助。细胞是生命体的最基本单元。药物作用主要是通过调节细胞机能而发挥作用。细胞水平研究是药物有效性评价的最基本的实验模型。细胞功能测定、细胞内信号传导、细胞间相互作用、细胞形态学观察等是观察药物分子对机体影响的最直接的方法，同时也是药物分子机制研究的基础。离体器官或组织保持了完整细胞群的形态和功能，同时避免了机体神经、体液、免疫的影响，可直接观察药物对器官或组织的生理、生化学影响。离体器官或组织研究可观察药物对细胞群的机械力、分泌活动、电生理活动的影响，是分子、细胞水平与整体水平之间桥梁。药物对整体动物的影响是药物对机体生理、生化影响的综合表现，是药物从实验阶段过度到人体研究的关健一步。药物治疗目的不同，所选择的动物种属、年龄、机能状态也不同，给药途径与给药期也有变化。3 试验设计(1）给药剂量设计28，30药效学试验通常应反应药物的量效关系，即在一定剂量范围内药物效应随剂量增大而增强。一般情况下，试验应设3个以上剂量组，确定药物的最低有效剂量和接近最大反应的剂量。在量效关系明确的情况，最好能计算出ED50、ED5和ED95。剂量组设置通常按等比数原则，2倍或3倍数常用。安全范围较小或有效剂量范围窄的药物也可采用等差级数分组。在确定药效学剂量时，常需参考人体或某种动物的有效剂量，一般按不同种属动物间剂量换算的方法确定大致的剂量。换算方法介绍如下。标准动物的等效剂量换算：先按表13-1查出折算系数（K），再按下式计算：DAK*DBDA为A种动物的剂量（mg或 g/只），DB为B种动物的剂量（mg或 g/只）。表13-1 标准动物等效剂量（mg或 g/只）的折算系数（K）B种动物小鼠大鼠豚鼠兔猫猴犬人20g200g400g1.5kg2kg4kg12kg70kg小鼠 20g1.07.012.2527.829.764.0124.0388.0A大鼠 200g0.141.01.743.94.29.217.856.0种豚鼠 400g0.080.571.02.252.45.29.231.5动免 1.5kg0.040.250.441.01.082.44.514.2物猫 2kg0.030.230.410.921.02.24.113.0猴 4kg0.0160.110.190.420.451.01.96.1犬 12kg0.0080.060.100.220.230.521.03.1人 70kg0.00250.0180.0310.070.0780.160.321.0等效剂量的直接折算法：先按表13-2查出KA，KB，RA，RB，再按下式计算：标准动物公式： DBDA *KB/KA 任何动物公式： DBDA *（RB/RA）*（WB/WA）2/3DA为A种动物的剂量（mg或 g/只），DB为B种动物的剂量（mg或 g/只）。表13-2 不同动物等效剂量（mg或 g/只）的折算系数（K）动物种属小鼠大鼠豚鼠兔猫猴犬人标体K（剂量折算数）1712.327.829.764124388准重K（kg体重剂量折算数）10.710.620.370.300.320.210.11任体R（动物体型系数）0.0590.090.0990.0930.0820.1110.1040.1何重W（标准体重）0.020.20.41.5241270(2）动物模型选择动物模型选择是否适当，影响药物效果与结果判断。在新药药效学评价时，有成熟和公认的模型时应优先选择，以保证实验结果的可信性。每项药效作用常用2种以上的动物模型进行评价。对传统中药进行药效学实验时，模型选择应考虑中医证候和特异性。用于药物有效性评价的动物主要有小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、猫、犬等，微型猪、猴的使用也在增加。动物模型有自发性病理模型和实验性模型两大类。自发性动物模型包括突变系遗传疾病，如高血压模型大鼠、无胸腺裸鼠、高血糖小鼠、自发肿瘤模型、肥胖症小鼠等。实验性动物疾病模型是通过化学、物理、生物等因素，人工诱发器官、组织或全身性损害，动物在功能、形态或代谢上与人体相应疾病状态相似。如动物发热模型、动物食物性高血脂模型、动物佐剂性关节炎模型等。(3）观察指标选择观察指标的选择应考虑以下问题：特异性： 所选指标应针对性强、专属性好，反映病因的本质。客观性： 尽可能采用客观指标观察包括仪器检测指标，以期减少人为判断误差。敏感性： 尽可能监测实验过程中的轻微变化，以期减少假阴性结果。量化性： 当观察指标为质反应指标时，尽可能进行数据量化记录。确定分级标准进行量化观察，以提高观察的灵敏度，进行分级统计处理。重现性：应尽可能控制试验过程中的干扰因素，保证观察结果具有良好的重现性。14.3.2 纳米药物的有效性 纳米药物通过提高生物利用度和使药物集中于靶部位而提高药物的疗效，同时也降低药物的不良反应。目前，纳米技术较多用于抗肿瘤药物及多肽蛋白类药物的纳米载药体系。以达到提高药物的有效性的目的。这些内容在本书有关章节已作了较详细的介绍。1 抗肿瘤药物制备聚甲基丙烯酸酯阿霉素纳米球，比较其与游离阿霉素对单核样白血病细胞株U-937的抗肿瘤活性，实验发现纳米球的活性为游离药物的3倍31。荷网状细胞肉瘤的小鼠给予阿霉素纳米粒后，癌细胞的转移数目较游离阿霉素明显降低，小鼠成活率明显提高32。在肿瘤模型小鼠比较米托蒽醌纳米粒和脂质体的抗肿瘤活性，米托蒽醌纳米粒和脂质体均能提高米托蒽醌的抗瘤活性，脂质体能明显延长P388白血病小鼠的存活时间，纳米粒则使B16黑色素瘤体积明显减小33。阿克拉霉素A聚氰基丙烯酸异丁酯毫微粒与游离阿克拉霉素A比较，对原位移植人肝癌裸小鼠的抑瘤率明显提高，肿瘤细胞增殖阳性率明显降低34。 将紫杉醇包裹于聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的纳米粒后，可使荷黑色素瘤的C57B1/6小鼠的肿瘤体积明显减小，动物存活时间明显延长，抗肿瘤活性明显强于游离的紫杉醇35。三尖杉碱（HT）BCA纳米粒静脉注射后对小鼠S180肉瘤的抑制率明显高于游离的三尖杉碱，其LD50值也明显高于游离的三尖杉碱36。二乙烯三氨五乙酸（DTPA）为一种细胞外螯合剂，具有抑制人巨细胞病毒复制的作用和抗肿瘤作用。用人乳腺癌细胞株（MCF-7）和神经母细胞瘤细胞株（UKF-NB-3）评价DTPA对肿瘤细胞的作用。当DTPA与人体血清蛋白（HAS）共价结合后，在蛋白质载药系统如HAS-NP、明胶B型分子、明胶B型纳米作用下，细胞对药物的摄入量增加，DTPA的杀肿瘤细胞作用和抗病毒活性可提高58倍。激光电镜检测显示， MCF-7和UKF-NB-3细胞株可摄入DTPA-HAS-NP 37。用KB和HeLa细胞体外评价多金属氧酸盐脂质体（LEP）对细胞的通透性、稳定性和抗肿瘤作用。脂质体体外抗肿瘤活性增加，体内对HL-60细胞的毒性降低38。人鼻咽癌细胞（KB ）和人前列腺癌细胞（LNCaP）高度表达叶酸结合蛋白，连接不同量叶酸的纳米粒进入两种细胞的活性不同。在RT-PCR分析中，KB细胞高度表达叶酸受体mRNA，而LNCaP细胞则不表达。相反，LNCaP高度表达前列腺特异性粘膜抗原mRNA。表明连接叶酸纳米粒在人口腔癌细胞和人前列腺癌细胞的摄入机制有所不同，连接叶酸纳米粒更可能用作前列腺癌基因治疗的靶向载体39。23个氨基酸合成的溶解性多肽（Hecate）与磁性纳米粒共价结合，在乳腺癌细胞株（MDA-MB-435S）的体外培养显示，多肽磁性纳米粒具有抑癌效果40。血管内皮细胞生长因子（VEGFR）-阿霉素长循环脂质体对靶细胞肿瘤血管内皮细胞的杀伤作用优于阿霉素长循环脂质体，与游离阿霉素相似，对非靶细胞平滑肌细胞的毒性明显低于游离阿霉素 23。ND-1是选择性与大肠癌特异结合的单抗，包入ND-1免疫脂质体的紫杉醇对表面具有特定抗原的靶细胞的生长抑制作用明显提高，对癌细胞的杀伤作用为游离紫杉醇的88.7倍，是普通质脂体的6.7倍41。2 抗微生物药物在感染沙门氏菌的小鼠，氨苄西林的聚氰基丙烯酸异已酯（PIHCA）纳米粒0.8mg/kg剂量的抗菌活性与32mg/kg游离药物相当，小鼠能全部成活，而模型组和游离药物组小鼠在10d内全部死亡42。对感染伤寒沙门氏菌的鼠存活率庆大霉素PBCA纳米粒在剂量为2mg/kg时即与游离药物20mg/kg相当，有效剂量降低了10倍43。两性霉素B的传统制剂为去氧胆酸钠盐（商品名Fungizone），用纳米技术将两性霉素B制成脂质体纳米制剂（LNS-AmB），与Fungizone比较，体内外抗真菌活性相同，但溶红细胞作用明显降低44。环丙沙星聚氰基丙烯异丁酯（PIBCA）纳米粒在家兔静注给药，药动学特征发生了明显改变，表现为t1/2、AUC、Vd增加，而CL降低。对人巨噬细胞内鸟分枝杆菌有效性试验表明环丙沙星纳米粒较游离环丙沙星更有效。在进行纳米材料的细胞毒性评价时发现，当PIBCA浓度高于80ug/mL时对活的巨噬细胞具有强烈的还原作用，这可导致环丙沙星纳米粒不能达到预期效果45。3 抗寄生虫药物伯氨喹（Pentamidine）聚己基丙烯酸烷酯（PHCA）纳米囊体外对利曼氏原虫的作用为游离伯氨喹的21倍46。伯氨喹纳米粒对小鼠黑热病的ED50明显低于游离伯氨喹，纳米粒的ED90与游离药物的ED50相近，表明纳米粒的活性明显高于游离药物47。4 多肽和蛋白质药物胰岛素锌为低水溶性药物，用泊洛沙姆、去氧胆酸钠和水在中性条件下采用磨粉技术制备胰岛素锌纳米分散体，经皮下和十二指肠给药能有效降低高血糖大鼠血糖水平48。胰岛素聚氰基丙烯酸酯（PACA）纳米粒皮下注射后降糖作用持续1224h，胰岛素BCA纳米粒在糖尿病大鼠皮下注射后降糖作用最长达7d，而胰岛素注射液的降糖作用仅维持8h。表明纳米粒的降糖时间明显长于注射液49。胰岛素纳米囊在糖尿病大鼠皮下注射后降糖作用可持续7d，3d 1次给药降糖作用可接近1d 3次常规的胰岛素治疗效果50。TNF-纳米粒在S180实体瘤小鼠的抗肿瘤活性高于游离TNF-，纳米粒的抑瘤率明显提高，且动物未出现体重降低51。鲑降钙素纳米囊大鼠灌胃的生物利用度可达40%，降钙活性为静脉注射的45%52。5 基因治疗药物粒径100120nm 的pDNA磷酸钙纳米粒可作为高效非病毒基因载体，在低酸性缓冲液（pH=5.0）释放DNA，体外转染（transfection）效率高于已商品化产品Polyfect53。磷酸钙纳米粒（CPNP）作为非病毒载体能转载外源性DNA到靶细胞，并具有高度的转染效率，具有DNA结合特性和防止DNA降解作用，对人鼻咽癌细胞（CNE-2）无明显毒性54。叶酸连接纳米粒（NP-F）与质粒DNA的复合物在鼻咽癌细胞（KB）、前列腺癌细胞（LNCaP）和胰腺癌细胞（PC-3）中显示了高度的DNA转染效率。在自杀基因治疗时在LNCaP细胞中该基因载体与单纯疱疹病毒胸腺核苷激酶（HSV-tk）和连接通讯基因（Cx43）一起提高了更昔洛韦抑制细胞生长的作用。基因（HSV-tk和HSV-tk/Cx43）-F-NP对KB和LNCaP细胞异种皮移植的肿瘤生长有明显的抑制作用，表明叶酸连接纳米粒是运载人前列腺癌和鼻咽癌自杀基因的有潜力的载体55。1,2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)是阳离子脂质体，DOTAP/胆固醇纳米粒作为一种非病毒基因载体能有效运载mda-7/IL-24基因至人肺癌异种皮移植瘤中，抑制肿瘤的生长和肿瘤中血管的生成56。PLGA/ PLGA混合纳米粒作为新的基因治疗载体可控释质粒DNA，对人乳腺癌细胞株（MCF-7）无明显的毒性57。小鼠在感染呼吸道合胞细胞病毒前后鼻内给予靶向病毒NS1基因的siRNA纳米粒，能明显降低肺组织的病毒滴度，降低炎性反应58。阴离子硅纳米粒表面用AHAPS修饰，在小鼠肺的基因转载能力为绿色荧光蛋白（EGFP）基因的两倍，细胞毒性很低或无59。 DOTAP/胆固醇纳米粒能有效转载肿瘤抑制基因FUS1，用于肺癌的全身基因治疗，但同时引起剂量相关的炎性反应。小分子的抑制剂能抑制炎性反应而不影响基因表达60。6 局部应用药物大分子物质如多肽和蛋白质难以克服粘膜障碍，进入血液循环前即被降解。聚多糖甲壳素纳米粒对胰岛素、降钙素、破伤风类毒素具有转运作用61。毛果芸香碱PBCA纳米粒与毛果芸香碱水溶液剂比较，对眼内压升高的家兔的作用前者作用维持时间明显延长。药动学研究表明，纳米制剂的药时曲线下面积显著增加，消除半衰期也明显延长62。环孢素A聚已酸丙酯纳米囊用于眼部给药，使环孢素A在角膜中的浓度比环孢素A溶液高5倍，维持时间延长3d以上63。用双标记激光共聚焦显微镜观察到聚合物纳米粒呈时间依赖性优先聚集在猪皮肤毛囊的开口处，这种局部化现象与粒径大小有关，粒径越小，在毛囊处聚集得越多，而且在皮肤沟纹中也发现有纳米粒64。14.4 纳米药物的安全性评价14.4.1 药物安全性的评价技术与方法 安全、有效、质量可控是新药研究过程中的三个基本问题。临床前安全性评价目的在于预测新药对人类健康的危害程度，是新药评价的核心内容之一，是决定新药能否进入临床试验的关键因素，其质量直接关系到人民用药的安全。GLP（Good Laboratory Practice for Non-clinical Studies）即药物非临床研究质量管理规范，是一种国际通用的药物安全性评价技术规范。GLP的建立旨在保证实验资料的真实、完整和可靠，进而保障人民用药安全。中华人民共和国药品管理法已明确规定，药物安全性评价必须遵循GLP。世界各国对药品注册的技术要求各不相同。为加强不同国家和地区间合作和资源共享，美国、日本和欧共体三方政府药品注册部门和制药行业于1989年起协商成立了人用药品注册技术要求协调会（ICH），三方对药品注册的许多技术要求取得了共识。世界经济合作与发展组织（OECD）化学物质试验指导原则集于1981年完成，定期进行修改，是目前国际上药物安全性评价公认的指导原则。1991年我国卫生部颁布了化学药物药理毒理试验指导原则，1993年又颁布了中药新药药理毒理指导原则。国家药品监督管理局成立后，于2001年颁布了化学药品毒性研究指导原则。2005年国家食品药品监督管理局重新对指导原则进行了修订，颁布了化学药物的急性毒性、长期毒性、一般药理以及刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则。新颁布的指导原则参考了FDA、EPA、OECD和日本相关毒性试验指导原则，使我国药物安全性评价技术规范逐步与国际接轨。以下按我国GLP检查的项目分别介绍各项试验的主要内容28，6566。1 单次给药毒性试验（Single dose toxicity study）常称为急性毒性试验（Acute toxicity test），是研究动物一次或24h内多次给予受试物后，一定时间内所产生的毒性反应。单次给药毒性试验是药物药理毒理研究的早期阶段，为反复给药毒性试验、遗传毒性试验、生殖毒性试验、安全性药理试验等提供剂量依据和毒性信息，并能提供人体急性中毒相关信息。单次给药毒性试验应尽可能提供可能的毒性靶器官，确定最大无毒性反应剂量、最小毒性反应剂量、最大耐受剂量或近似致死剂量或最小致死量，对于需要测定的药物应计算半数致死量（LD50）。单次给药毒性试验所用动物有小鼠、大鼠、犬、猴等。给药途径有口服或灌胃、腹腔注射、静脉注射、肌肉注射、吸入给药等，水溶性好的药物一般应进行静注给药。动物性别一般为雌雄各半，也可对不同性别动物分别进行试验。动物体重小鼠为1822g，大鼠为120150g，犬为68kg。单次给药毒性常用方法有近似致死剂量法、最大给药量法、固定剂量法、序贯法、累积剂量法、半数致死量法。非啮齿类动物（犬、猴）主要用近似致死量法、累积剂量法，啮齿类动物（小鼠和大鼠）常测定半数致死量（LD50）、最大给药量、固定剂量法等。单次给药毒性观察指标除动物死亡情况外，应按毒理指导原则规定的一般观察与指征要求进行部分或全面进行观察，包括鼻孔；呼吸阻塞；呼吸频率和深度；体表颜色改变；运动功能；惊厥；反射；眼检指征；心血管指征；唾液分泌；坚毛；痛觉丧失；肌张力；胃肠指征；皮肤等。2 反复给药毒性试验（Repeated dose toxicity study）常称为长期毒性试验（Long team toxicity study），是研究动物连续给予受试物后由于积蓄而对机体产生的毒性反应，它与单次给药毒性、生殖毒性、致癌性等毒理学研究关系密切，是药物非临床安全性评价研究的核心内容。结果应提供受试物可能引起的临床不良反应、毒性的靶组织或器官、无毒性反应剂量、毒性的可逆性等情况。（1） 动物选择化学药物和中药的反复给药毒性试验所用动物常用啮齿类的大鼠（Wistar或 SD品系）和非啮齿的Beagle犬，生物制品常用猴、狒狒或纯系小鼠。一般应为雌雄各半，也可用单性别动物进行试验。应选择正常、健康和未孕的动物，体重差异应在平均体重的20%之内。动物应符合国家规定的相应动物等级。试验前啮齿类动物至少应进行5d的适应性观察，非啮齿类至少应驯养12周。（2） 分组与给药应设3个或3个以上剂量组。一般大鼠为雌雄各1030只，犬、猴各46只。高剂量应有少数动物出现严重毒性反应或死亡（不超过20%），低剂量应相当或略高于药效学有效剂量且应不出现毒性反应。中剂量在高低剂量间确定。给药途径应与临床一致，口服药物可用灌胃或掺食，大鼠1个月以上静注给药可用腹腔注射代替。给药周期一般为临床用药时间的24倍。大鼠最长给药期为6个月，犬为9个月。临床需反复用药时应按实验动物最长用药期进行实验。(3) 观察项目与次数观察项目包括一般检查、实验室检查和病理检查。一般检查：包括行为活动、外观体征、摄食量与摄水量、体重、死亡情况、粪便情况、给药局部反应等。当动物出现濒死情况应立即处死，进行实验室和病理检查。一般检查应每天观察1次以上。非啮齿类（犬、猴）应作体温、心电图、眼科检查。实验室检查：包括血液学、血液生化学、尿液分析和粪便检查（非啮齿类动物）等。血液学检查包括红细胞和网织红细胞总数、红细胞容积、平均红细胞容积、血红蛋白、平均红细胞血红蛋白、白细胞总数及分类、血小板计数、凝血酶原时间、骨髓功能等。血液生化学主要包括ALT、AST、ALP、T-Bil、BUN、TP、ALB、GLU、T-CHO、Crea等10项生化以及钾、氯、钠等3项电解质，还可根据药物特性增加其它项目。尿液检查包括尿外观、pH值、比重、尿蛋白、尿糖、尿胆红素、尿胆原、酮体、潜血、白细胞等。粪便检查包括潜血、白细胞等。病理学检查：分为病理剖检和病理组织学检查两方面。大体解剖后应对主要脏器称重并计算脏器系数。非啮齿类动物应对对照组和各给药组进行病理学检查，啮齿类动物应对对照组和高剂量组动物，以及大体解剖异常者进行病理学检查，如有病理改变也应对中、低剂量组动物进行剖检。反复给药毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官有：脑、心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、胸腺、脾脏、睾丸、附睾和卵巢等。反复给药毒性试验中需进行病理组织学检查的组织或器官有：脑（大脑、小脑、脑干）、脊髓（颈、胸、腰段）、垂体、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、食管、唾液腺、胃、小肠和大肠、肝脏、胆囊、肾脏、肾上腺、脾脏、胰腺、气管、肺、主动脉、心脏、附睾、睾丸、卵巢、子宫、前列腺、乳腺、坐骨神经、膀胱、眼（眼科检查发现异常时）、视神经、给药部位、骨髓、淋巴结（包括给药局部淋巴结、肠系膜淋巴结）等。通过反复给药毒性试验，应能够对受试物的临床不良反应、临床毒性靶器官或靶组织、安全范围、临床需重点检测的指标，以及必要的临床监护或解救措施作出合理的预测和判断。3 遗传毒性试验（Genotoxicity study）是研究受试物的遗传毒性及潜在的致癌作用。遗传毒性的研究内容较多，大的方面包括基因突变试验、染色体畸变试验和啮齿动物微核试验。在我国新药毒理学研究指导原则中包括微生物回复突变试验、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微核试验和显性致死试验等项目。4 生殖毒性试验（Reproductive toxicity study）是研究受试物在动物受精、妊娠、分娩及哺乳过程中对母子两代的影响。一般将生殖毒性分为三个阶段。1、一般生殖毒性：检查受试物在动物妊娠前及妊娠初期的生殖毒性；2、敏感期生殖毒性：也称致畸试验，检查受试物对胎仔器官形成期的生殖毒性；3、围产期毒性试验：检查受试物对妊娠后期及授乳期的生殖毒性。一般生殖毒性试验时，合笼前雄性动物应连续给药60