FnCBD64基因重组腺病毒载体AdFnCBD64的构建.doc

FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64构建的实验研究徐瑞剑 王志强包头市九原区医院胸外科 内蒙古包头 014060内蒙古自治区自然科学基金项目 项目编号2009MS1148通讯作者：王志强Xu ruijian Wang zhiqiangDepartment of Thoracic Surgery, Jiuyuan District Hospital of Baotou, Baotou Inner Mongolia 014060实验目的：构建纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组人腺病毒载体（Ad.FnCBD64）。实验方法：1.FnCBD64重组腺病毒粘粒载体的构建。2.293细胞和Hela细胞的培养。3.磷酸钙转染。4. 筛选和扩增FnCBD64基因重组腺病毒。5设计公共PCR引物。6. 鉴定Ad. FnCBD64重组腺病毒。7. 浓缩纯化重组腺病毒。8. 测定病毒滴度（50组织培养感染量TCID50）。9.体外安全性研究。结果：成功构建了纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64。结论：本实验成功地构建了携带人FnCBD64基因的重组腺病毒，为应用FnCBD64促进骨髓间质干细胞的黏附力提供了转染载体，使应用骨髓间质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜成为可能。运用基因转染的技术加强及改造种子细胞的功能是组织工程研究中的热点问题之一。通过这一手段的应用，不仅能获得具备旺盛生理功能的种子细胞，而且还能使种子细胞大量表达需要的目的蛋白，有利于组织构建。腺病毒载体是组织工程基因改造的常用的病毒性载体，同其他的载体体系对比，腺病毒载体是最具有潜力的载体之一，具有高效感染分裂细胞及非分裂细胞能力，制备容易、纯化和储存方便，并且滴度高、容量大1。能插入大片段的目的基因，携带的外源基因不会整合在宿主染色体中，在靶细胞内以附加体形式存在，插入突变的危险极低，具有较低的遗传毒性。腺病毒能够高效地在体外途径进行基因转移，容易操作2；病毒转染24小时以后就有相当数量的重组基因表达，且持续时间长，可达14天以上，这与使用种子细胞体外构建组织工程心脏瓣膜所需要的时间相一致，病毒载体可在体外对种子细胞进行基因改造，以满足我们的需要，用于构建组织工程心脏瓣膜。1 材料与方法1.1材料1.1.1试剂限制性核酸内切酶（BioLabs公司），DNA分子量标准品、PCR试剂（TaKaRa公司），DNA包装蛋白（Novagen公司），高糖DMEM培养液、PRMI1640培养液、胎牛血清（FCS）（GIBCO公司），PCR引物（上海生工生物工程有限公司），新生小牛血清（NCS）（杭州四季清公司），BES（N-2-羟乙基-2-氨基乙磺酸）（CNI公司），胰酶、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司），Sephadex G-50介质（Amersham Pharmacia公司），氯化钙（CaCl2）、氯化铯（CsCl2）（Amresco公司），硫酸链酶素（上海四药股份有限公司），青霉素钠（上海先锋药业有限公司）等。1.1.2主要仪器电泳仪PhastSystem（Pharmacia Biotech公司），恒温烤箱（Fisher公司），CO2培养箱BB5060（Hereaus公司），PCR仪 GeneAmp PCR System 2400（PERKIN ELMER公司），RC-26低温高速离心机（杜邦公司），MDF3820 -70低温冰箱（SANYO公司），TGL-16C台式离心机（上海安亭科学仪器厂），12孔排枪、枪头、Eppendorf管（BIOHIT公司），Olympus IX-70倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司）等。1.1.3细胞人胚肾293细胞（ATCC CRL1573），Hela细胞（中国科学院上海细胞所）。1.2实验方法1. 构建FnCBD64重组腺病毒粘粒载体：(1) FnCBD64 DNA片段回收及加工(2)粘粒载体pAxCAwt酶切及纯化(3)目的粘粒载体重组pAxCAwt. FnCBD64的获得(4) 鉴定和扩增pAxCAwt. FnCBD64。2. 293细胞及Hela细胞培养。(1)常规培养：于含10血清培养基中（293细胞使用DMEM的培养液，HeLa细胞使用1640的培养液），37及5CO2条件下进行培养。传代：对数生长期细胞，0.25%的胰酶消化制成细胞悬液，按一定浓度加入新瓶中培养。(2)冻存：取对数生长期细胞，0.25%的胰消化酶制成细胞悬液，离心，弃上清，加入1ml冻存液，打匀制成细胞悬液，细胞浓度为106-107/ml。转移至细胞冻存管，按顺序41小时，-202小时，-804小时，而后置液氮中长期保存。(3)复苏：从液氮中取出细胞冻存管，迅速置于37温水中融化，液体移入10ml离心管，加无血清培养基5ml，1000rpm离心5min，弃上清，加入新鲜含血清培养基，移至细胞培养瓶中培养。 3. 磷酸钙转染法。(1)细胞准备：用6cm、10cm培养皿培养293细胞，覆盖率至70-80左右。转染前12h更换培养液。(2)磷酸钙-DNA沉淀的制备：取两个1.5ml无菌Eppendorf管，A管中首先加入MQ-H2O 170l、1M CaCl2 80l，轻微吹打混匀，然后加入DNA-TPC 5l、重组粘粒（pAxCAwt. FnCBD64）200l（8g）和CaCl2 45l，总体积500l，上下混匀两次；B管加入2BES 500l。将A管的混合物缓慢逐滴地加入到B管，同时用一支移液枪在液面下轻轻吹泡，这一步非常重要，因为它可以降低沉淀颗粒的体积，使其更容易进入细胞。室温下静置20min。磷酸钙-DNA溶液逐滴加入到6cm培养皿的293细胞中，轻摇混匀，3CO2、37培养14-18h，更换培养基，继续培养6h。(3)细胞分传：上述6cm培养皿中的293细胞消化后以11ml培养液稀释（A），未转染的10cm培养皿中的293细胞消化后以30ml培养液稀释（B），A和B按1:0、1:10、1:100比例混合：1:0为9.6 ml A，1:10为1 ml A和10 ml B，1:100为0.1ml A和11ml B，分别接种于三个96孔培养板，每孔100l，使得三个培养板各孔之间的细胞数目无明显差别。置37、5CO2培养箱中培养。于第56天和第1011天时每孔加入50l 10FCS-DMEM，使用12孔排枪，每孔更换枪头。4. FnCBD64基因重组腺病毒的筛选和扩增。(1)第一代重组腺病毒的筛选： 818天时将因病毒增殖引起细胞死亡的孔初步定为阳性孔，分别收集培养液（含死细胞），-80保存。1518天时完成判断，选择阳性孔10孔以上培养板中的阳性孔作为观察对象，将该板阳性孔的细胞悬液反复37 /-80冻融6次，5000rpm离心5min，上清保存于-80，此为第一代重组腺病毒液。(2)第二代重组腺病毒的扩增：应用24孔板培养293细胞与Hela细胞，使各自铺满70100。每2孔293细胞和1孔Hela细胞加入10l同一克隆的第一代腺病毒液、0.1ml 5FCS-DMEM，每20min摇动24孔板数次以使病毒液充分接触全部细胞，1h后每孔追加0.4ml 5FCS-DMEM继续培养，34天后Hela细胞无病态反应而293细胞全部死亡的孔定为阳性孔，丢弃Hela细胞有病态反应的第一代腺病毒液。将阳性孔的细胞悬液反复冻融6次，5000rpm离心5min，上清保存于-80，此即为第二代重组腺病毒液。(3)第三代重组腺病毒的扩增：在25cm2培养瓶中培养293细胞，当铺满瓶底7080时加入15l已鉴定好的第二代腺病毒液和0.5ml 5FCS-DMEM，感染1h，补加4.5ml 5FCS-DMEM。约34天后细胞完全死亡，收集后反复冻融，4、3000rpm离心10min除去细胞碎片，将上清按每管1ml分装，快速冻存于-80，此为第三代重组腺病毒液。(4)第四代重组腺病毒的扩增：当75cm2培养瓶中293细胞铺满瓶底100时加入50l第三代重组腺病毒液、2ml 5FCS-DMEM，感染1h，补加13ml 5FCS-DMEM，培养34天后细胞死亡，收集、1000rpm离心10min，弃上清，用1ml病毒保存液重悬，冻融，4、3000rpm离心10min，弃沉淀，快速冻存于-80，此为第四代重组腺病毒液，病毒滴度可达109pfu/ml。5公共PCR引物的设计。设计腺病毒粘粒载体pAxCAwt公共PCR引物：应用PC-GENE软件选取腺病毒粘粒载体pAxCAwt外源基因插入位点两端的公共部分设计，设计引物时充分考虑PCR的要求：引物长度在1825bp之间；A/T含量与G/C含量尽可能接近；两条引物退火温度基本相同；引物自身连续互补碱基不大于3bp，引物之间不应多于4个连续互补碱基，尤其应防止两引物的3端之间形成互补碱基对，从而避免出现引物二聚体；碱基随机分布，避免某种碱基连续多次出现，3端不超过3个连续的G或C，其他部位没有连续4个或4个以上的相同碱基。其上游引物位于外源基因插入位点之前90-113bp处，下游引物位于外源基因插入位点之后95-117bp处。引物序列如下：上游引物5-CTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTC-3；下游引物5-GATCTCAGTGGTATTTGTGAGCC-3，公共部分长度为230bp，退火温度为55。引物由上海生工生物工程有限公司合成，实验前用TE缓冲液溶解成25mol/L浓度直接使用。鉴定引物的准确性：以腺病毒空粘粒载体pAxCAwt和试剂盒中所带pAxCAi-LacZ粘粒为模板行PCR反应，产物取20l进行1琼脂糖凝胶电泳分析。6. Ad. FnCBD64重组腺病毒的鉴定。收集病毒反应阳性的293细胞，冻融破碎细胞得到病毒液后以酚/氯仿/异戊醇按下述流程抽提病毒DNA进行PCR，同时抽提正常293细胞基因组DNA并以携带FnCBD64基因的腺病毒粘粒载体pAxCAwt. FnCBD64行PCR作为对照。7. 重组腺病毒的浓缩纯化。制备CsCl2密度梯度，先加入10ml 轻CsCl2（22.3g CsCl2溶解于77.6ml 0.01M Tris -HCl），再从管底加入10ml重CsCl2（42.23g CsCl2溶解于57.77ml 0.01M Tris-HCl），在液面上加入第四代腺病毒粗提液48ml，420000rpm离心2h。用2ml注射器及18g针头收集中下1/3交界处的半透明带；将此再加入到已制备的CsCl2密度梯度中，4 20000rpm离心2h，收集同上，收集液在0.01M Tris-HCl （pH8.1）反复透析除去CsCl2后，于病毒保存液中-70保存备用。8. 病毒滴度测定（50组织培养感染量TCID50）。(1)重组病毒液的稀释：0.1ml病毒液，用0.9ml 5FCS-DMEM稀释，由此稀释后的病毒液中取0.1ml，再用0.9ml 5FCS-DMEM稀释，如此用5FCS-DMEM反复10倍稀释病毒液制备104病毒稀释液，用于滴度测定。(2)细胞准备：10cm培养皿培养293细胞，待覆盖率达80时用于测定。(3)测定：取一96孔培养板，每孔加50l 5FCS-DMEM，第1排每孔加104重组腺病毒稀释液25l，用8孔排枪由各孔取出25l加至第2排各孔中，由第二排各孔取出25l加入第三排各孔中，重复上述操作至第11排，第11排各孔取出25l弃去，第12排为阴性对照，这一系列稀释度为3-13-11104，每个稀释度有样本8孔。消化10cm培养皿中的293细胞，悬浮于6ml 5FCS-DMEM中，每孔50l加至测定用96孔板中，于第5天、第8天时每孔加入10FCS-DMEM 50l。(4)判断：在1113天时镜下观察，细胞完全病态反应表现为细胞变园肿胀、透亮和成团飘浮，此反应大于50并且表现规则的孔为阳性孔，分排阳性孔计数。 (5)计算：按照Karber，s公式：TCID50=第一排稀释度稀释度-0.5，=“出现病态反应孔的数目/每个稀释度的标本数”的总和。因为用50l病毒液，故没有稀释的病毒滴度（pfu/ml）为：TCID501ml / 0.05ml9. 体外安全性研究。在重组缺陷型腺病毒制备和扩增过程中，可能会产生野生型病毒（wild-type）。野生型腺病毒含有早期转录基因（E1、E3），能在宿主细胞内复制，导致宿主细胞破裂、死亡。因此无论是动物实验还是今后应用于临床，重组腺病毒中都不应有野生型病毒的污染。我们用HeLa细胞检测是否有野生型腺病毒产生，以确定其使用的安全性。以5104个Hela细胞/孔接种于12孔培养板，待细胞贴壁伸展后，按MOI值50计算所要加入Ad.FnCBD64的体积，并以PBS定容至100l，分别加入12孔板的Hela细胞中，感染1小时后，加入足量的5%NCS-1640培养液，共设2组：Ad.FnCBD64组和未感染组（uninfected），每组每个MOI值每个时间点设3个培养孔，观察细胞形态改变，每隔2天换液，分别于第1天、3天、5天和7天消化细胞计数，绘制生长曲线。2 统计学处理所有数据以均数标准差（s）表示，用SPSS19.0软件进行t检验，P0.01表示统计学差异非常显著，P0.05表示无统计学差异，必要时直接给出P值。3结果1. FnCBD64基因酶切回收和黏粒载体pAxCAwt酶切电泳图(图2-1，图2-2)。图2-1 pET28/ FnCBD64质粒的酶切电泳结果。泳道A：DNA分子量Marker，泳道B-C：酶切后pET28/ FnCBD64质粒图2-2 黏粒载体pAxCAwt酶切电泳图泳道A：DNA分子量Marker，泳道B：黏粒载体pAxCAwt用SwaI 酶切线性化后2. pAxCAwt. FnCBD64重组粘粒的鉴定用PCR鉴定粘粒中有无目的基因(图2-3)。图2-3 pAxCAwt. FnCBD64重组粘粒PCR鉴定电泳图泳道A：DNA分子量Marker，泳道B-C：pAxCAwt. FnCBD64重组粘粒PCR鉴定阳性克隆3. 阳性粘粒进一步用Sal I酶切 1琼脂糖凝胶电泳回收7676bp大小的片段 (图2-4) 。图2-4 pAxCAwt. FnCBD64重组粘粒Sal I 酶切后泳道A：DNA分子量Marker，泳道B-C：pAxCAwt. FnCBD64重组粘粒Sal I酶切后4. 亚克隆质粒经抽提纯化后EcoR I 和Sal I酶切电泳检测 电泳检测，出现3255bp和4421bp片段的为正向插入，出现2044bp和5632bp的为反向插入(图2-5)。挑取正向插入克隆扩增粘粒待用。A B C 图2-5 目的基因插入方向鉴定图A:分子量Marker，B：正向插入重组质粒酶切后，C：反向插入重组质粒酶切后4、 细胞培养生长状态良好的293细胞贴壁快、伸展佳、边界清晰、细胞内颗粒少，一般3天需传代。生长状态良好的293细胞(图2-6a)。5、 第一代Ad. FnCBD64的产生应用磷酸钙共沉淀方法，将重组腺病毒粘粒载体pAxCAwt. FnCBD64与DNA-TPC导入293细胞，经同源重组产生重组腺病毒，同源重组主要过程(图2-7)。7-8天后开始出现噬斑现象，1215天时出现噬斑的孔中293细胞发生肿胀、漂浮、死亡（图2-6c），18天时完成判断，1:0的96孔板上有90个孔细胞全部死亡，1:10的96孔板上有50个孔细胞全部死亡，1:100的96孔板上有12个孔细胞全部死亡。图2-6腺病毒制备过程中各阶段293细胞的生长状态（100）A为正常293细胞，B 为漂浮、肿胀、死亡的293细胞 图2-7 同源重组的主要过程6、重组腺病毒的筛选及鉴定以腺病毒空粘粒载体pAxCAwt和pAxCAi-LacZ粘粒为模板行PCR反应，产物凝胶电泳分析可见230bp和3360bp处各有一个高度特异性条带，与引物之间公共部分长度以及插入LacZ基因大小完全一致，证明引物序列是准确可靠的。所制备腺病毒抽提DNA后进行PCR反应，产物凝胶电泳分析可见在约2000bp处有高度特异性条带，而293细胞DNA进行PCR时不出现此条带（图2-8）。 图2-8 PCR鉴定重组腺病毒电泳泳道A：pAxCAi.LacZ；泳道B：pAxCAwt；泳道C：pAxCAwt.FnCBD64；泳道D：293细胞7、重组腺病毒滴度测定TCID50法测定第四代Ad. FnCBD64的滴度约为1.2109pfu/ml。经氯化铯密度梯度离心后的滴度达到2.21012pfu/ml。8、重组腺病毒体外转染的安全性大量实验证实Hela细胞对腺病毒具有显著的易感性。如果MOI值50的病毒液感染HeLa细胞，HeLa细胞出现变圆、漂浮等细胞病态反应（CPEs，cytopathic effects），说明其中混有野生型病毒，应当重新制备。本研究中制备的重组腺病毒Ad. FnCBD64以50的MOI值感染Hela细胞后，观察7天，细胞未出现病态反应，各个时间点细胞计数两组间相比差异不显著（见表2.1，图2-9）。表2.1 两组各个时间点细胞计数结果（细胞数：104）（s）1天3天5天7天Ad. FnCBD64组（n=3）8.52.315.93.220.83.621.43.4未感染组（n=3）8.12.016.53.121.63.322.13.7两组各个时间点比较P0.05，统计学上差异不显著。图2-9转染病毒后Hela细胞的生长情况讨论：293细胞是经腺病毒的E1区转化的人胚肾细胞，作为腺病毒的同源重组场所，其提供了腺病毒复制所必需的E1区3。获得高滴度的重组腺病毒最关键的一步是293细胞的初始状况，其中细胞密度尤其重要，不应过度密集或过稀。我们在转染前24小时将2106个细胞接种于6cm培养皿上，这样转染后24小时细胞覆盖可达95100%，既有足够的细胞被转染，又避免过度聚集影响细胞生长状态。在构建FnCBD64重组腺病毒时我们选用的是在BES中形成磷酸钙-DNA沉淀的高效转染方法，用这种方法将重组腺病毒粘粒载体pAxCAwt.FnCBD64与DNA-TPC共同转染293细胞，近50%的细胞稳定地整合和表达转染的DNA，核酸以磷酸钙-DNA共沉淀的形式出现，培养细胞摄取DNA的能力将显著增4过量的DNA对细胞有一定的毒性，一般讲6cm培养皿细胞可吸收15g的DNA量，所应用的DNA的质量也影响转染效率，应用的DNA是经氯化铯纯化处理。在鉴定插入片段是否为目的基因时，我们没有采用单纯设计FnCBD64基因引物进行PCR酶切鉴定的方案。这是因为即使单纯目的基因片断PCR阳性，只能证明样本中含有目的基因，并不能证明目的基因已整合到腺病毒DNA中，因此我们设计了位于腺病毒粘粒载体pAxCAwt外源基因插入位点两端的公共引物，如果用此公共引物行PCR，产物经鉴定含有FnCBD64基因，则目的基因必然已整合到腺病毒DNA中。用空病毒粘粒和pAxCAi-LacZ粘粒DNA为模板进行PCR，出现230bp和3360bp的条带，这证明了公共引物的准确性。当然，我们注意到293细胞来源于人体组织，其细胞基因组中可能会含有FnCBD64基因，所以我们抽提了293细胞基因组DNA同时进行PCR，以排除293细胞基因组DNA可能造成的假阳性结果，结果表明293细胞基因组DNA行PCR未出现阳性条带。为进一步确证此条带即为FnCBD64基因，我们在PCR的基础上，对所得片段进行Nco酶切鉴定，得到597bp、146bp两个片段，与理论上的计算和直接用pAxCAwt. FnCBD64基因PCR产物进行酶切的结果一致，表明所获得的重组腺病毒中确实携带FnCBD64基因。制备重组腺病毒的步骤我们采用的是Kanegae等的方法5，即将腺病毒基因组DNA末端蛋白复合物和重组粘粒共同转染293细胞。DNA-TPC是腺病毒母病毒基因组55kDa末端蛋白，由盐酸胍裂解腺病毒母病毒后经氯化铯纯化而来，经磷酸钙共沉淀法将含有目的基因的重组腺病毒粘粒和DNA-TPC共转染受体细胞，发生同源重组后，腺病毒基因组的两个末端即具有末端蛋白，293细胞表达E1基因，通过重叠重组而复制，产生大量的有目的基因的复制缺陷型的重组腺病毒6，这是本实验高效同源重组的关键，我们应用的TaKaRa公司的腺病毒重组试剂盒，其中DNA-TPC是经EcoT22I在七个位点以上切割，从而降低野生型病毒的产生，效率提高的另一个原因是载体和母病毒同源重组的长度，此长度对同源重组的频率和重组腺病毒的产生比较重要。在实验中排除野生型病毒的存在十分重要。在每次Ad载体扩增时，理论上均有产生野生型病毒的可能7，因此每次扩增腺病毒后都需要分析是否存在有复制能力的腺病毒，常用的方法用PCR检测是否存在E1A区，同时进行Hela细胞的噬斑分析。该细胞对腺病毒具有显著的易感性，如果MOI低于100的病毒感染Hela细胞后就已出现CPEs，说明有野生型病毒污染，应当重新制备。在实际操作中，每次病毒扩增后，我们都没有发现野生型病毒，说明用磷酸钙/DNA-TPC方法构建的腺病毒载体具有纯度高、毒性低的优点。本实验成功地构建了携带人FnCBD64基因的重组腺病毒，为应用FnCBD64促进骨髓间质干细胞的黏附力提供了转染载体，使应用骨髓间质干细胞更快、更好地体外构建组织工程心脏瓣膜成为可能。参考文献:1.Woodword C D, Isomm H C. Transformation of differentiated rat hepatocytes with adenovirus and adenovirus DNA.J Virol.1987,61(11):3570-3579.2.VorburgerSA, HuntKK. Adenoviral gene therapyJ.Oncologist,2002, 7(1): 46-59.3.Granam FL,