测定痕量痕量CytC及预测人体疾病.doc

2009.8.20修改Tween-80增敏富勒醇固体基质室温磷光法测定痕量细胞色素C及人体疾病预报摘 要 基于Tween-80能增敏富勒醇(Fullerol，简记F-ol)与细胞色素C (Cytochrome C，简记Cyt C)生成无磷光化合物的反应而导致F-ol的室温磷光(RTP)信号剧烈猝灭的学术思想，据此建立了Tween-80增敏F-ol固体基质室温磷光法 (SS-RTP)测定痕量Cyt C的新方法。该方法的检出限为12.0 zg spot1，灵敏度高，且准确、简便、快捷和选择性好，且在0.040-9.6 ag spot1范围内与Ip成线性关系，适用于人血清中Cyt C含量的测定与人体疾病预报，结果与ELISA相吻合。同时探讨了Tween-80增敏F-ol SS-RTP测定痕量Cyt C的反应机理。新的方法拓展了F-ol在生命科学的应用领域，为临床人体疾病预报提供了新的技术。关键词：富勒醇; 细胞色素C; Tween-80; 固体基质室温磷光法1. 前 言 Cyt C不仅是一种水溶性的含血红素类氧化还原蛋白质1，亦是线粒体释放的最重要的促凋亡因子之一，具有调节能量代谢和调节细胞凋亡的作用2-3。小儿白血病是小儿恶性肿瘤中发病率最高的疾病，严重地威胁着患者的生命安全。近年来的研究发现，白血病的发生和化疗药物对白血病细胞的杀伤作用都与细胞凋亡密切相关4。有关细胞色素C 的临床检测及其促凋亡活性调节分子机制和释放机制的研究已成为当前研究的热点5。国内外有关细胞色素C的测定有分光光度法(LD: 1.3 103 g mL1) 6、荧光猝灭法 (LD: 12.4 g mL1) 7、同步荧光光谱法(线性范围为0.036-0.192 g L1) 8、CdTe/CdS 量子点共振瑞利散射光谱法(LD: 1.1 109 g mL1) 9、电化学探针伏安法(LD: 1.6 104 g mL1) 10、循环伏安法11、吸附法(LD: 5.0 103 g mL1) 12、ED/Au /I 复合修饰电极法(LD: 4.0 106 g mL1) 13、毛细管电泳法(Capillary zone electrophoretic method，CZE，LD: 7.43 1013 g mL1) 14、电流测定法(Amperometric method, LD: 4.2 105 g mL1) 15、蛋白质印迹法(LD: 5.0 105 g mL1) 16、酶联免疫法 (ELISA, LD: 1.0 109 g mL1) 17等。上述方法除了灵敏度较低外，还存在以下缺陷：分光光度法选择性差，荧光猝灭法背景的干扰较大，同步荧光光谱法线性范围较窄，共振瑞利散射光谱法仪器昂贵，电化学分析法重现性较差，酶联免疫法非特异性干扰较大等。显然，这些方法难于满足生物试样中低含量Cyt C测定的需要。因此，探讨高灵敏、准确测定Cyt C的新方法及Cyt C含量和细胞凋亡的相关性，已成为当前的研究热点，具有较高的学术研究价值与重大意义。实验研究发现，在50、15 min和Pb2+离子微扰剂的条件下，F-ol、Cyt C均可发射微弱的RTP；当Tween-80存在时，F-ol的RTP信号剧烈增强，表明Tween-80可增强F-ol的RTP信号，同时emmax蓝移了22.2 nm，提示体系中有胶束化合物生成；往体系中加入9.6 ag Cyt C时，F-ol的RTP信号剧烈猝灭，比无加Tween-80时Ip (12.7)增大9.4倍，据此可建立Tween-80增敏F-ol SS-RTP测定痕量Cyt C的新方法。该方法的检出限为12.0 zg spot1 (对应浓度为3.0 1017g mL1)，灵敏度高，已成功用于人血清中Cyt C含量的测定，结果与ELISA相吻合。依据Cyt C含量与细胞凋亡的相关性，可预测人体疾病。鲜见Tween-80增敏F-ol SS-RTP测定痕量Cyt C的文献报道。本文基于F-ol的RTP特性及其与Cyt C的反应，提出了SS-RTP测定痕量Cyt C和人体疾病预报的新方法，在生命科学领域中有广阔的应用前景。 2. 实验部分2.1 仪器与试剂LS-55型荧光分光光度计(Perkin Elmer公司)，仪器参数：Delay 0.1ms，Gate 2.0 ms，Cycle 20 ms，Flash Count 1，Ex Slit 10 nm，Em Slit 8 nm，Speed 1500 nm min1；AE240型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；pHS3B酸度计；0.5L平头微量注射器(Shanghai Medical Laser Instrument Plant (Shanghai, 200000, hina)。细胞色素C (Cyt C, 美国Sigma公司)工作溶液：先配制1.0 103 g mL1储存液(桃红色)，临用时用水逐级稀释为1.00，10.00和100.00 (fg mL1)；1.0 105 mol L1 Fullerol (简记F-ol，按18方法合成)，0.067 mol L1 KH2PO4-Na2HPO4 (pH = 6.08)缓冲溶液， 2.0% Tween-80，1.50 mol L1 LiNO3。除了细胞色素C为基准试剂外，其它为分析纯，水为三次亚沸水。定量滤纸(杭州新华纸业有限公司)；聚酰胺膜(PAM)、醋酸纤维素膜(ACM)与硝酸纤维素膜(NCM)，均购置于路桥四甲生化塑料厂。预先剪切成 = 1.5 cm的圆片备用。2.2实验方法往25 mL比色管中加入1.00 ml F-ol，2.00 ml Tween-80，pH = 6.08 的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液以及适量Cyt C，定容，混匀，50水浴加热15 min，水流冷却5 min，终止反应。取NCM ( = 15 mm)浸入1.50 mol L1 LiNO3溶液10 s后，于901干燥2 min；在NCM压痕( = 4.0 mm)处，用0.50 L平头微量进样器悬空点样0.40 L，继而在901下干燥2 min，同时做试剂空白。于exmax/emmax = 456/622 nm处测定扫描体系的磷光光谱，记录试液的Ip和试剂空白的Ip0，计算Ip (= Ip0Ip)。3. 结果与讨论3.1 磷光光谱按实验方法扫描F-ol-Tween-80-Cyt C体系的磷光光谱 (图1)。结果表明，在50、15 min和Pb2+离子微扰剂的条件下，F-ol、Cyt C均可发射微弱的RTP，其exmax/emmax 分别为478.8/645.2、468.6/634.4 nm (图1，曲线4.4，2.2)， Ip依次为79.5、55.0；当Tween-80存在时，F-ol的RTP信号剧烈增强 (exmax/emmax = 457.0/623.0nm，Ip = 213.7，曲线7.7)，表明Tween-80可增强F-ol的RTP信号，同时emmax蓝移了22.2 nm，提示体系中有胶束化合物生成；往体系中加入9.6 ag Cyt C时，F-ol的RTP信号剧烈猝灭 (exmax/emmax = 456.01/621.94 nm，Ip = 94.1，曲线5.5)，Ip = 119.6，比无加Tween-80时Ip (12.7，曲线3.3，Ip = 66.8)增大9.4倍，故选择456/622 nm作为测定Cyt C的工作波长。此外，Cyt C使F-ol的RTP猝灭，emmax由645.2 nm蓝移至622.0 nm (emmax = 23.3，曲线3.3)，可能是Cyt C与F-ol作用生成无磷光化合物的缘故。Ip/nm 图1 F-ol-Tween-80-Cyt C体系的室温磷光光谱(Curves 1, 2 , 3, 4, 5, 6 and 7 were the excitation spectra , curves 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 7 were the emission spectra.)1.1 NCM 2.2 9.6 ag spot1 Cyt C 3.3 4.4+ 9.6 ag spot1 Cyt C 4.4 1.00 ml Fol5.5 7.7 + 9.6 ag spot1Cyt C 6.6 7.7 + 0.040ag spot1Cyt C 7.7 4.4 + 2.00 ml Tween-80 3.2 最佳条件 对于2.40 ag Cyt C spot1，分别考察试剂的浓度与用量（表2）、反应酸度（表2）、反应温度和时间（表2）、氧气（表2）、烘干温度（表2）、烘干时间 (表2)、放置时间（表2）、固体基质（PAM(a), ACM(b), NCM(c), Paper(d)，图2）、离子微扰剂（1.010 4 mol l 1 的 I(NaI，e)、Li+ (LiNO3，f)、Hg2+ (Hg (NO3)2，g)、Cd2+ (Cd(NO3)2，h)、Pb2+ (Pb(Ac)2，i)，图2）、增敏剂（SLS(j), Tween-80 (k), CTMAB(l), Triton X-100 (m)，DBS(n)，PVA(o)，图2）与缓冲溶液种类(Na2CO3-NaHCO3 (p), KH2PO4-Na2HPO4 (q), Tris-HCl(w)，图2)等对体系Ip的影响，结果表明，当 1.00 ml 1.0 105 mol L1 F-ol，2.00 mL 2% Tween-80、1.00 mol L1Pb2+、反应pH为4.98-7.42、反应温度为50和反应时间为15 min、烘干温度为90和烘干时间为2 min、固体基质为NCM、离子微扰剂为Pb2+，增敏剂为Tween-80和缓冲溶液为KH2PO4-Na2HPO4时，体系的Ip最大。自取出水流冷却5min 后始计，在10-60 min内体系中的Ip几乎不变。在通或不通干燥的N2的条件下体系是稳定的。此时体系的pH = 6.08。可能是在pH = 2.0和pH = 10.0的磷酸盐缓冲溶液中，血红素中铁卟啉轴向第六配体的变化对细胞色素C的活性影响很大，从而导致细胞色素C失活19，而在pH = 6.08时细胞色素C活性最大。表2. 检测条件检测条件IpOptimalF-ol(104 mol L1)(ml)1.0, 0.10, 0.010, 0.00100.50,1.00,1.50,2.00, 2.5021.2, 34.1, 15.7, 7.211.6, 33.7, 26.1, 19.0, 17.51.0 105 mol L11.00 mL Tween-80 (1%)(mL)0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.01.00, 1.50, 2.00, 2.50, 3.00, 4.008.22, 11.9, 34.5, 28.7, 23.58.6, 20.9, 33.5, 28.3, 26.1, 17.82.0 %2.00 mLPb2+(104 mol L1)0.10, 0.25, 0.75, 1.00, 1.2014.8, 16.2, 20.5, 33.8, 20.91.00体系的pH1.99, 3.42, 4.98, 5.76, 6.08, 6.63, 7.42, 8.31, 10.054.6, 17.4, 33.2, 33.9, 34.1, 33.6, 33.4, 21.4, 12.94.98-7.42反应温度 ()10.5, 23.7, 34.3, 24.0, 15.6, 12.3, 5.210.5, 23.7, 34.3, 24.0, 15.6, 12.3 5.250 反应时间 (min)5, 10, 15, 20, 255.1, 13.9, 33.5, 25.6, 19.115 min烘干温度 ()50, 60, 70, 80, 90, 95 10.9, 13.1, 18.3, 26.1, 33.6, 21.790烘干时间 (min)0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.016.4, 20.2, 22.9, 27.7, 33.0, 28.22 min放置时间 (min)10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 8033.1, 33.7, 33.9, 34.0, 34.2, 33.8, 21.4, 12.9 10-60 min图2 固体基质（B）、离子微扰剂（C）、增敏剂（D）和缓冲溶液种类（E）对体系Ip的影响（固体基质、离子微扰剂、增敏剂和缓冲溶液分别为NCM、Pb2、Tween-80和KH2PO4-Na2HPO4时，体系的Ip最大。） 3.3 线性范围、工作曲线、检出限与精密度Cyt C的含量与Ip值成线性关系。本法与文献9、10、16方法的线性范围、工作曲线的回归方程、相关系数、RSD%(对0.04 ag spot1 和9.60 ag spot1的Cyt C进行7次平行测定)和检出限(对试剂空白进行11次的平行测定，以3Sb/k计算)等与文献方法比较列于表2。 /nm 表2 分析方法的比较方法 Method线性范围 Analyticalrange回归方程Regression equation 相关系数 r检出限 Detectionlimit (g mL1)相对标准偏差 RSD(%)本法0.040-9.6 (ag spot1)0.10-24.00（fg mL1）Ip= 1.609 + 12.39 m Cyt C (ag spot1) (n = 6)0.999412.0(zg spot1)3.0 10172.3-3.0Ref.9(n = 5)0.036-1.31mg L1I = 27.4 + 721.98 C0.998710.8 1090.63-0.82Ref.101-16 g mL1ipa = 15.0 -0.269C0.9991.6 107Ref.160.2-600 pmol L1y = (1.6149 105)x + 3.4579 1040.99897.4 1013 2.26注: Red. 16 y: peak area x: analyte concentration (pM)由表2可见，本法比文献方法的检出限低，灵敏度高，可用于试样中痕量Cyt C的测定。3.4 干扰实验用本法(6.0 fg mL1 Cyt C)与文献 (0.1 mg L1 Cyt C, 9 )法分别测定Cyt C，当相对误差为5% 时，以下物质共存(物)的允许浓度列于表3。根据文献9，Cu2+、Ni2+干扰较严重，可用10 g L1EDTA溶液0.5 mL1 掩蔽0.3 mg L1Cu2+和0.5 mg L1 Ni 2+。 表3. 共存物质的影响本法Ref.9共存离子(物)允许浓度(mg L1)Er(%)允许浓度(mg L1)Cu2+0.102.0有干扰Ni2+0.101.3有干扰H2C2O40.522.50.0025Mn2+ (SO42)0.821.10.008Sr2+0.880.3H2PO41.600.10.015Ba2+1.800.70.010Ag+1.800.80.010HPO421.981.9Zn2+ (SO42)2.001.20.015Ca2+2.003.40.030Mg2+2.101.70.020C12.252.20.040葡萄糖2.701.50.060蔗糖3.203.00.15由表3可见，本方法比文献9方法的选择性好，可能是F-ol具有高选择性的缘故。3.5 样品分析取1.00 mL的小儿白血病患者A、B、C、D、E和F的血清(早上空腹)，用pH = 6.08 KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液逐级稀释至fg级，按实验方法测定上清液中的Cyt C，同时做加入标准回收率实验平行测定6次(表4)。结果与ELSIA法临床检测的结果比较(表4)。 表4 样品分析结果样品Sample本法测得值Found(mg L1)(n = 6)加入量Added(mg L1)回收量Recovery(mg L1)回收率Percentrecovery(%)RSD(%)ELISA测得值相对误差(%)Serum A0.411.001.026102.64.40.422.4Serum B6.671.001.008100.80.256.501.5Serum C19.331.000.97797.73.819.611.4Serum D41.001.001.007100.71.140.680.79Serum E50.981.001.011101.11.949.004.0Serum F84.011.000.98398.30.9181.12据文献4报道，当细胞色素C浓度在0 - 37.5 mg L1 时，细胞凋亡抑制率逐渐增加，这会导致急性髓系白血病细胞系HL-60细胞数目的增加，从而增大发病率；当细胞色素C浓度大于37.5 mg L1时，细胞凋亡率增加不明显，但细胞出现坏死，说明可诱导白细胞死亡。全身炎症反应综合症以及多器官功能障碍综合症患者血清细胞色素C浓度增加最大值可达0.21 mg L120。由表4结果可知，患者A、B、C的急性髓系白血病细胞系HL-60细胞数目仍在增加，病情在加重；而患者D、E、F的血清分析结果表明其病情已经受到控制。3.6 SS-RTP测定痕量Cyt C的反应机理在50、15 min和Pb2+离子微扰剂的条件下，F-ol本身可发射微弱的RTP (图1，曲线4.4)；当Tween-80存在时，F-ol的RTP信号剧烈增强 (图1，曲线7.7)，同时emmax蓝移了22.2 nm，可能是体系中生成胶束化合物导致F-ol分子从无序状态向有序排列的缘故。当体系中Cyt C存在时，在弱酸性情况下，Cyt C分子19中OOC与H+作用生成HOOC (图15)： 图15 Cyt C分子中的OOC与H+作用继而Cyt C分子中的 HOOC与F-ol的OH反应21，结果生成无磷光化合物(F-ol-Cyt C，图16)： 图16 Cyt C与F-ol的反应导致 F-ol的RTP信号剧烈猝灭(图1，曲线5.5)，其Ip与Cyt C含量成线性关系，且比无加Tween-80时的Ip增大9.4倍。Ip与emmax的变化，既证明了Cyt C与F-ol之间能发生反应，又揭示了Tween-80对该反应有促进作用，最终生成无磷光化合物(F-ol-Cyt C)而导致RTP信号剧烈猝灭，据此可用 Tween-80增敏F-ol SS-RTP测定痕量Cyt C。 4. 结束语 研究了F-ol的RTP特性、Tween-80对F-ol的RTP的增敏效应，以及F-ol与Cyt C之间的定量反应，建立了高灵敏SS-RTP测定痕量Cyt C的新方法，并成功地预测人体疾病，推动了F-ol、SS-RTP与生物分析的研究进展。 参考文献1 李绍中(LI Shao-zhong), 高新义(GAO Xin-yi). 细胞色素C的电化学研究进展(Electrochemical Research Progress of Cytochrome C). 山西食品工业(Shanxi Industry). 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Exploitation of phosphorescent labelling reagent of fullerol-fluorescein isothiocyanate and new method for the determination of trace alkaline phosphatase as well as forecast of human diseases.Analytica Chimica Acta, 2009, in prees 原始数据3.结果与讨论3.1 磷光光谱/nmIp 图1 F-ol-Tween-80-Cyt C体系的室温磷光光谱ex em Ip Ip 1.1 NCM 412.20 584.99 45.032.2 9.6 ag spot1 Cyt C 468.57 634.39 55.00 3.3 4.4+ 9.6 ag spot1 Cyt C 457.13 621.95 66.79 12.7 23.274.4 1.00 ml Fol 478.85 645.22 79.49 5.5 7.7 + 9.6 ag spot1Cyt C 456.01 621.94 94.12 119.59 6.6 7.7 + 0.04 ag spot1Cyt C 457.38 623.06 211.78 1.93 7.7 4.4 + 2.00 ml Tween-80 457.04 623.02 213.71 134.22 22.21.1 lsx1#11; lsx1#13 2.2 lsx3#11; lsx3#15 3.3 lsx3#36; lsx3#344.4 lsx4#04; lsx4#07 5.5lsx2#76; lsx2#75 6.6 lsx2#08; lsx2#09 7.7 lsx1#34; lsx1#35 1.1 NCM 2.2 9.6 ag spot1 Cyt C 3.3 4.4+ 9.6 ag spot1 Cyt C 4.4 1.00 ml Fol5.5 7.7 + 9.6 ag spot1Cyt C 6.6 7.7 + 0.04 ag spot1Cyt C 7.7 4.4 + 2.00 ml Tween-80 3.2 最佳条件 表1. 检测条件 ReagentsConcentrations and volumesIpOptimalF-ol(104 mol L1)(ml)1.0, 0.10, 0.010, 0.00100.50,1.00,1.50,2.00, 2.5021.2, 34.1, 15.7, 7.211.6, 33.7, 26.1, 19.0, 17.51.0 105 mol L11.00 mL Tween-80 (1%)(mL)0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.01.00, 1.50, 2.00, 2.50, 3.00, 4.008.22, 11.9, 34.5, 28.7, 23.58.6, 20.9, 33.5, 28.3, 26.1, 17.82.0 %2.00 mLPb2+(104 mol L1)0.10, 0.25, 0.75, 1.00, 1.2014.8, 16.2, 20.5, 33.8, 20.91.00体系的pH1.99, 3.42, 4.98, 5.76, 6.08, 6.63, 7.42, 8.31, 10.054.6, 17.4, 33.2, 33.9, 34.1, 33.6, 33.4, 21.4, 12.94.98-7.42反应温度()10.5, 23.7, 34.3, 24.0, 15.6, 12.3, 5.210.5, 23.7, 34.3, 24.0, 15.6, 12.3 5.250 反应时间(min)5, 10, 15, 20, 255.1, 13.9, 33.5, 25.6, 19.115 min烘干温度50, 60, 70, 80, 90, 95 10.9, 13.1, 18.3, 26.1, 33.6, 21.790烘干时间0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.016.4, 20.2, 22.9, 27.7, 33.0, 28.22 min放置时间10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 8033.1, 33.7, 33.9, 34.0, 34.2, 33.8, 21.4, 12.9 60 min 图1 检测条件IpOptimal固体基质PAM(a), ACM(b), NCM(c), Paper(d),21.0, 17.0, 33.4, 12.0NCM离子微扰剂1.00 mol L1I(NaI，e)、Li+ (LiNO3，f)、Hg2+ (Hg (NO3)2，g)、Cd2+ (Cd(NO3)2，h)、Pb2+ (Pb(Ac)2，i)24.3, 12.6, 26.1,17.1, 35.0Pb2+增敏剂2%SLS(j), Tween-80 (k), CTMAB(l), Triton X-100 (m)，DBS(n)，PVA(o)6.3, 33.1, 22.8, 18.8, 12.2, 19.4 Tween-80缓冲溶液种类(Na2CO3-NaHCO3 (p), KH2PO4-Na2HPO4 (q), Tris-HCl(w)21.5、34.0、13.8KH2PO4-Na2HPO4图2 固体基质（B）、离子微扰剂（C）、增敏剂（D）和缓冲溶液种类（E）对体系Ip的影响3.2.1试剂浓度与用量 表1. 试剂浓度与用量ReagentsConcentrations and volumesIpOptimalF-ol(104 mol l1)(ml)1.0, 0.10, 0.010, 0.00100.50,1.00,1.50, 2.00, 2.5021.2, 34.1, 15.7, 7.211.6, 33.7, 26.1, 19.0, 17.50.1 104 mol l1F-ol1.00 ml F-olTween-80(1%,W/V)(ml)0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.00.50,1.00,1.50,2.00, 2.50, 3.00, 4.008.22, 11.9, 34.5, 28.7, 23.54.9, 8.6, 20.9, 33.5, 28.3, 26.1, 17.82% Tween-802.00 ml Tween-803.2.2 固体基质IpIp 图2 固体基质对体系Ip的影响 图3