禽病学实验实习指导书20109修订.doc

禽禽病学实验实习指导书编者：陈建红 司兴奎 张济培佛山科学技术学院动物医学系禽病学课程组二0一0年9月修订说明禽病学实验实习指导书以佛山科学技术学院原禽病学实验指导书为基础，以佛山科学技术学院禽病学实验教学大纲（2007版）及禽病学教学实习大纲（2007版）为依据作删减修订。目前，本实验实习指导书的实验指导部分包括“家禽的尸体剖检及病料采取”、“家禽具有血凝性病毒病的免疫监测”、“鸡白痢与小鹅瘟的血清学诊断”、“鸭疫里默氏杆菌病的实验诊断”4个内容（共8学时）；教学实习指导包括“鸡新城疫的实验诊断”1个内容（18学时）。本实验、实习体现了病禽剖检、病料采取、血清学试验、病毒分离鉴定和病原菌分离鉴定等禽病诊断的基本技术，学生能认真操作并结合禽病学相关技术书籍进行学习，将有益于其在禽病学实验技术方面打下必要的基础。本指导书适合于兽医专业本科(或专科)禽病学课程实验实习指导，亦适合于兽医工作人员临床操作时参考。目 录第一部分 禽病学实验指导实验一 家禽的尸体剖检及病料采取实验二 家禽具有血凝性病毒病的免疫监测实验三 鸡白痢与小鹅瘟的血清学诊断实验四 鸭疫里默氏杆菌病的实验诊断第二部分 禽病学教学实习指导鸡新城疫的实验诊断 第一部分实 验 指 导实验一 家禽的尸体剖检及病料采取一、实验目的掌握家禽尸体剖检、病料采取及病原分离的具体方法。二、实验内容1病禽的剖检；2病料的采取与病原菌的分离。三、实验仪器、设备及材料1剖检病禽的用材：解剖剪、解剖盘、消毒液、洗手盆、毛巾、待检禽等。2病料采取及病原(细菌、病毒或其他微生物)分离的用材：消毒的小剪刀、小镊子、灭菌玻璃容器、研钵、酒精棉、酒精灯、接种棒、培养基及上述剖检用材。四、实验原理 1家禽机体在健康的情况下，各种组织器官具有正常的形态，发病后某些组织器官会发生特征性的变化，通过病禽剖检可以为临床诊断疾病提供依据。2家禽健康的状况下体内不携带病原或毒物，发病后，通过特定的组织器官作病原分离鉴定或对中毒病禽作毒物检测，可以为实验诊断禽病提供可靠的依据。 五、实验步骤1病禽的剖检进行剖检之前，应首先了解发病禽群的流行病学，临床症状情况，家禽的品种，饲养情况，疫苗的接种情况，发病后的经过和处理方法等等。剖检时，应注意详细记录各器官的病理变化，如同时剖检多只病死禽，则应注意编号，以免混淆。剖检基本术式如下：（1）外貌检查检查天然孔：注意口、鼻、眼(包括眼下方的羽毛是否干燥，若湿润则表明有流泪的可能)有无异常的分泌物，分泌物的量及性状；注意泄殖腔周围羽毛有无异常粪便粘污，泄殖腔粘膜的变化及内容物的性状等。检查皮肤：注意头、冠、肉髯及身体其他部位的皮肤有无痘疹或结痂等；是否发生腐败；检查家禽的趾爪，注意有无赘生物、外伤、化脓、失水及胫骨有无变软等。检查各关节及龙骨：注意各关节有无肿胀、变形及长骨、龙骨有无变形、弯曲等表现。检查病禽的营养状态：触摸感觉病禽胸肌厚薄及龙骨的显突情况而初步判定家禽的营养情况。（2）体腔检查 第一步，用消毒水将禽体羽毛浸湿，防止病原扩散及避免羽毛飞扬。 第二步，用剪刀将股内侧连接腹侧的皮肤剪开，将两大腿向外和下方翻压，直至髋关节脱臼，使禽体以背卧位平放于瓷盆上。 第三步，横向剪开腹部皮肤，使切口与上述股侧皮肤切口相连，握住游离皮肤，向前一直剥离到锁骨部，检查皮下组织和胸肌的状态。横向剪开腹肌、腹膜，并沿胸骨的两侧，向前将各肋骨、锁骨剪断，抓住龙骨的后端，用力向前向上翻拉(此时应注意观察体腔内各气囊壁有无混浊、增厚等)，暴露整个体腔的器官。注意体腔有无积液，粘附渗出物及其他异常变化。将腺胃、肌胃、心、肝、脾、肺、肠、肾、卵巢、睾丸、法氏囊等各内脏器官先后从体腔摘出作细致检查，先观察外表形态、大小、色泽、质度等变化，再分别切开检查内部变化，注意有无炎性肿胀、充血、郁血、出血、溃疡、坏死或结节等。（3）颈部检查将下颌骨、食道、嗉囊剪开，注意观察口腔和食道粘膜有无出血、溃疡、假膜或脓包等；同时，剥离颈部皮肤检查胸腺(尤其是雏禽)有无出血、萎缩等变化；将小剪刀插入喉头，剪开气管和支气管，检查喉头和气管粘膜有无渗出、充血、出血或溃疡等。（4）头部检查 第一步，眼部检查。主要观察眼的角膜有无异常变化及眼结膜有无出血或溃疡等。 第二步，鼻窦部检查。沿额面经鼻孔剪开约l3厘米切口，将切口用手分开即可见鼻窦，观察其有无出血或渗出物的特性。 第三步，脑部检查。用剪刀将头部皮肤剪开、以尖剪将整个额骨、颅顶骨剪除，暴露大脑和小脑，先观察脑膜血管的状态，脑膜下有无水肿和积液，然后再以钝器轻轻拨离，将前端嗅脑、脑下垂体及视神经交叉等部逐一剪断，将整个大脑和小脑摘出，观察脑实质的变化；（5）神经检查主要检查的神经为坐骨神经干。将股内侧的肌肉钝性分开即可见乳白色有横纹的坐骨神经干，观察神经干外膜有无水肿或出血及神经干的粗细是否均匀等。（6）剖检时的注意事项 剖检的场地应尽量远离行人、水源、禽舍，并选择易于消毒的地方，避免由于剖检造成病原扩散。 剖检前后运载病、死禽只，应采用密封容器，避免沿途遗漏病禽羽毛、分泌物及排泄物等。剖检完毕，应将尸体深埋或焚化，或作其他无害化处理。对剖检场地及器械要随手洗刷消毒。2病料采取与病原菌(毒)分离家禽传染病的确诊，通常必须过实验室诊断，采取病料与病原分离是实验诊断的前提。（1）采料时间 病毒性病料、中毒性材料(如肉毒梭菌素中毒)的采取一般应在急性感染期，选择典型的濒死病禽，病前不久用过疫苗或经抗病毒药物处理的禽只不宜采料。（2）采取病料的方法：器械消毒：刀、剪：镊子等采料用具可干热灭菌或煮沸30分钟灭菌，注射器等器皿应干热灭菌或高压灭菌。采料部位：病料采取的部位应根据不同疾病相应地采取其脏器或内容物，一般应采取病原含量高而污染机会少的实质性器官，如肝、脑、脾为好。在无法估计是何种传染病时，可进行全面采取。各种病料的具体采集方法A病毒性病料的采取与病毒分离：用灭菌剪刀及镊子剪取含毒量高的组织(通常为肝脏、脑、脾脏、胰脏等实质脏器)23克，投入灭菌瓶中，加盖，有条件的地方可即时将病料用灭菌乳钵研磨，并应用超声波或反复冻融法裂解细胞，以利于细胞内病毒的释放，加入510倍的灭菌生理盐水或PBS配成悬液，30008000转/分钟，离心1520分钟，去除沉淀，在每毫升上清液中加入青霉素、链霉素(或其他有效抗生素)各20004000IU，置48C冰箱中感作24小时。经无菌检验合格后，接种相应的生物学培养基(禽胚或细胞培养物等)作病毒分离培养，观察感染禽胚死亡及病变情况，收集胚液做进一步鉴定。如果病料采取后不能立即处理时，应直接放入低温冰箱或相应保存剂(如Hanks液或50的甘油PBS)中，并置于冰箱保存。B细菌性病料中病原菌分离：对于各种细菌性疾病，应在病禽剖解前备好相应的培养基。对营养要求低的病原菌，如大肠杆菌，可用普通琼脂；对营养要求较高的病原菌，如多杀性巴氏杆菌，可用血液琼脂等；有特殊要求的病原菌，要使用特殊的培养基和方法进行培养，如鸭疫里氏杆菌、鸡副嗜血杆菌等要用巧克力琼脂在含510CO2的空气条件下培养；怀疑有杂菌污染的病料，应尽量使用需分离细菌的选择性培养基；病原含菌量少时应采用液体培养基，或用相应的增菌培养基增菌培养后，再进行分离培养；未能确定病原菌的种类时，应同时使用多种培养基分离培养，以提高病原菌的分离成功率。分离病原菌时，用接种棒直接从病禽体内相应脏器钓取病料在固体培养基上划线培养或液体培养基上接种；如不能即时分离培养，则应以无菌手续采取病料一小块投入无菌的保存剂中，置48C保存，并应尽早进行分离培养。病原菌的分离应在急性发病期和未使用过敏感药物的前提下进行。C血清学材料：一般都应采取双相血清，即在发病初期及后期(病愈期)各采取一份，进行检验，以检查有关抗体的变化情况。具体方法为：采少量血清时，可用注射器沿向心端的方向从翅静脉直接采取血液；如需大量血清，则可从心脏采血。血液先放在经干热灭菌的小瓶或其他容器中自然凝固，待其自然析出血清，再将血清移至灭菌容器中冻结保存备用。血清若有溶血则会影响试验结果的准确性。D组织学材料的采取：供病理组织切片的材料，应将病禽典型病变部分及其相连的健康组织一并切取，随即投入10%甲醛中固定备用。E肠道内容物材料的采取：用棉线将决定采取内容的肠道两端扎紧，然后剪下置于灭菌容器中，必要时可放入20C保存，并迅速送检。不论上述哪一种材料，都不应该在死后过长时间(一般不超过死后46小时)采取，否则会对正确的诊断造成一定的影响。所有病料采取后均要贴上标签。若要送检时，还要用医用胶布或石蜡封口，置于冰瓶中及时送出。六、实验报告要求1扼要地反映病禽剖检与病料采取的基本程序。2说明操作的注意事项。 3陈述实验体会。七、实验的注意事项(参阅实验步骤)八、思考题家禽尸体剖检、病料采取及病原分离的方法与注意事项如何?实 验 二 家禽具血凝性病毒病的免疫监测一、实验目的1.掌握血凝性病毒病免疫监测的基本方法。2.学会根据血凝性病毒病免疫监测的结果指导鸡群血凝性病毒病免疫接种。二、实验内容 1.红细胞凝集试验检测抗原的HA效价及4个血凝单位抗原的配制。2.红细胞凝集抑制试验检测免疫禽只的HI抗体。3.根据血凝性病毒病免疫监测的结果指导鸡群相应病毒病的免疫接种。三、实验仪器、设备及材料1.抗原原液：购自标准厂家，根据监测抗体的种类而确定抗原的种类。ND免疫监测ND抗原；AI H5免疫监测H5抗原；AI H9免疫监测H9抗原；EDS76免疫监测EDS抗原。2.被检血清：随机采取被检禽群的血液（抽样比例约为12，或每个禽群抽取2040只），取血液自然凝固后析出的血清作为被检血清。3.灭菌PBS生理盐水，PH7.0，按常规配制。4.红细胞悬浮液：采取健康公禽（被检测血清为鸡血清时，应采用公鸡，被检血清为鸭、鹅血清时，应采用公鸭）血液（每次可采510mL），抗凝，加灭菌PBS生理盐水离心洗涤35次（每次离心的速度和时间为3000转/分钟，15分钟，将血浆、白细胞等充分洗去，将沉淀的红细胞用灭菌PBS生理盐水稀释成1悬浮液。该红细胞悬浮液在4存放，可用35天。注意悬浮液颜色变暗应予弃去。5.其他材料：25uL移液器，96孔V型反应板，普通离心机等。（以下内容主要以ND的免疫监测为例，同学们可依此类推探讨其他血凝性病毒病免疫监测的相关技术）四、实验原理鸡群ND免疫后，体内可产生抗ND中和抗体及红细胞凝集抑制抗体（HI抗体）。后者在体外可抑制NDV凝集红细胞的能力。在一系列试管中，将被检鸡血清作连续稀释，血清中HI抗体越高，则能使ND病毒凝集红细胞能力完全抑制的血清稀释度就越高。由于HI抗体与中和抗体的消长是基本一致的，故通过HI抗体水平的检测可以达到ND免疫监测的目的。五、实验步骤(一) 红细胞凝集试验（微量法检测ND抗原原液HA效价及配制4个血凝单位ND抗原）1.分装生理盐水：用移液器在96孔V型反应板的一排孔上的112孔，每孔加入PBS生理盐水25uL，换滴头；2.添加抗原：吸取标准ND抗原原液25uL加入第1孔，换滴头；3.稀释抗原：用25uL移液器将第1孔中的抗原与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第2孔；用移液器将第2孔中的抗原与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第3孔，如此，直至第11孔，从11孔吸取25uL溶液弃去，换滴头；4.加入PBS生理盐水：向1-12孔加入PBS生理盐水，每孔25uL；5.加入红细胞悬浮液：向1-12孔加入红细胞悬浮液，每孔25uL；6.静置感作20-30分钟，然后判定结果；7.判定结果（观察、判定、记录反应结果的相关概念与方法）“凝集”的概念：观察反应孔，当一层红细胞凝集颗粒均匀覆盖于整个孔底，判定为“凝集”（将反应板倾斜，无红细胞流淌现象），记录为“+”。 “不凝集”的概念：观察反应孔，当红细胞完全自然沉降到孔底中央，形成一个边缘光滑无凝集颗粒的红圆点，判定为“不凝集”（将反应板倾斜，有红细胞流淌现象），记录为“”。ND抗原的血凝效价的概念：凡能使鸡红细胞完全凝集的抗原最高稀释度称为该ND抗原的血凝效价。判定、记录反应结果的方法判定、记录反应结果时，可绘制一个表格，将试验情况与结果判断作填写。如下是一个ND抗原原血凝效价测定结果判定与记录的例子，可作模仿。孔号123456789101112效价抗原稀析1：24816326412825651210242048PBS对照1：64反应图像结果记录+-84个血凝单位（4HAU）抗原的配制方法依据ND抗原原液的HA效价，用PBS生理盐水将该抗原原液稀析为4HAU抗原（用于下述HI试验）。每mL抗原原液加入PBS生理盐水的毫升数为：该抗原原液效价的倒数除以4减1。如上例，抗原原液效价为1：64，则，每mL抗原原液加入PBS生理盐水的毫升数为64/4-1=15。（二）红细胞凝集抑制试验（微量法）检测免疫禽只的HI抗体。1分装PBS生理盐水：在96孔反应板上，取其12孔，第1-11孔每孔加入PBS生理盐水25uL;2.向第1孔加入被检血清；3.稀释被检血清: 用25uL移液器将第1孔中的被检血清与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第2孔；用移液器将第2孔中的抗原与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第3孔，如此，直至第10孔，从10孔吸取25uL溶液弃去，换滴头；4.加入4HAU抗原：向第1至第11孔加入4HAU ND抗原溶液，每孔25uL;5加入红细胞悬液：向第1至第12孔加入1鸡红细胞悬浮液，每孔25uL，室温中静置2030分钟，观察结果并记录。6. 判定结果（观察、判定、记录反应结果的相关概念与方法）“凝集”的概念：观察反应孔，当一层红细胞凝集颗粒均匀覆盖于整个孔底，判定为“凝集”（将反应板倾斜，无红细胞流淌现象），记录为“+”，读作凝集。“完全抑制”的概念：观察反应孔，当红细胞完全不凝集而自然沉降于试管底部中央，形成一个边缘光滑的红圆点，边缘没有分布红细胞凝集颗粒，判定为完全抑制，记录为“”，读作完全抑制；被检血清HI效价的概念：凡能使0.25mL 浓度4个凝集单位的ND抗原凝集红细胞的能力完全抑制的血清最高稀释度称为该被检血清的HI效价。判定、记录反应结果的方法判定、记录反应结果时，可绘制一个表格，将试验情况与结果判断作填写。如下是2个被检血清HA效价测定结果判定与记录的例子，可作模仿。孔号123456789101112效价血清稀析 度1：2481632641282565121024抗原对照PBS对照1：256血清1反应图像结果记录-+-血清2反应图像1：64结果记录-+-（三）根据ND等血凝性病毒病免监结果指导鸡群相应病毒病免疫接种的步骤1计算禽群ND抗体合格率禽群ND抗体合格率的计算公式：ND抗体合格率=（被检血清样品数-抗体效价低于临界滴度*的样品数）/被检血清样品数100%。*注：ND抗体效价临界滴度：鸡群可抵抗NDV感染的ND抗体的最低滴度。这是一个由生产实际总结得出的数值，可因实际情况的变化而变化。目前，此值通常定为1：32。2.确定禽群抗体合格率的标准 禽群抗体合格率的标准也是一个由生产实际总结得出的数值，而且鸡的日龄不同其标准有不同。目前各种日龄鸡群能够抵抗ND感染的的抗体合格率参考标准为：1月龄以下的小鸡，抗体合格率要求在85以上，且其余15的被检鸡只的抗体水平不低于1:5；中成鸡群的抗体合格率应在95以上，且其余5的被检鸡只的抗体水平应不低于1:5。3将被检鸡群抗体合格率对照禽群抗体合格率的标准，确定被检鸡群目前的免疫状况，指导其进一步的免疫接种。 如下为根据ND等血凝性病毒病免监结果指导鸡群相应病毒病免疫接种的一个例子：某后备种鸡群，18周龄，共3000只种鸡，随机采血20份，经ND HI试验检测，各样品抗体水平情况如下表。请根据该免监结果，对该指导鸡群的ND免疫接种作指导。抗体效价1:640监测只数13316600解：1计算鸡群ND抗体合格率（临界滴度取1：32）：鸡群ND抗体合格率（被检血清样品数-抗体效价低于临界滴度*的样品数）/被检血清样品数100%（20-4）/20100%80% 2. 确定禽群抗体合格率的标准：本鸡群为中成鸡群，中成鸡群的抗体合格率标准为95以上，且其余5的被检鸡只的抗体水平应不低于1:5。3. 将被检鸡群抗体合格率对照禽群抗体合格率标准，确定被检鸡群目前的免疫状况： 该被检鸡群的ND抗体合格率为80%，而中成鸡群的抗体合格率标准是95%，故可见该鸡群目前ND免疫状况未及格，建议尽快给于ND疫苗的加强免疫接种。六、实验报告要求1.扼要反映本实验步骤。2.报告实验结果应包括各被检血清样品各孔的反应结果和各被检血清的HI效价，及应用本试验结果指导被检鸡群的ND临床免疫接种。3.试指出应用本技术对不同的血凝性病毒病作免疫监测时，在材料、方法上有何异同。七、实验的注意事项 (参阅实验步骤)八、思考题家禽具血凝性病毒病的免疫监测技术有哪些关键点?请作扼要陈述。实验三 鸡白痢与小鹅瘟的血清学诊断 本实验包括鸡白痢平板凝集试验及小鹅瘟琼脂扩散试验二部分。实验三之一 鸡白痢平板凝集试验一、实验目的1掌握平板凝集试验的基本原理与操作方法。 2了解平板凝集试验在诊断、监测、控制与净化鸡群鸡白痢中的应用。二、实验内容 1鸡白痢平板凝集试验操作。2鸡白痢平板凝集试验在养鸡生产中的应用。三、实验仪器、设备及材料 1鸡白痢抗原：是用鸡白痢沙门氏杆菌培养物加入0.3的甲醛溶液灭活后，制成每毫升含菌100亿的悬浮液，并加入抗凝剂和色素制成。由兽医生物制品厂提供。 2鸡白痢标准阳性血清：由兽医生物制品厂提供。 3被检血清或全血：采自被检鸡群。 4洁净玻璃板、微量移液器或滴管、采血针头、不锈钢丝环、混合棒及被检鸡若干只。四、实验原理在有电解质存在的条件下，细菌等颗粒性抗原和特异性抗体相互结合，出现肉眼可见的凝集颗粒（块），称为凝集反应。根据颗粒的大小与出现时间的快慢判定试验反应结果。参与反应的抗原与抗体分别称为凝集原和凝集素。平板凝集试验具有由于简易、快速、敏感、特异的特点，长期以来，广泛用于人畜多种传染病的快速诊断，在家禽最常用的是鸡白痢鸡与败血支原体感染的检验。五、实验步骤1操作程序取一洁净玻片，用蜡笔划成若干方格，并编号，将抗原充分振荡混匀，用移液器或滴管吸取鸡白痢抗原，垂直滴一滴(约005mL)于平板各格上，在第一格抗原上滴上鸡白痢标准阳性血清一滴，在第二格抗原上滴上阴性血清一滴。其余各格为样品检测格（每只鸡一格），用针头刺破被检鸡的翅静脉或鸡冠，用不锈钢丝环沾取血液一环或用移液器吸取血液005mL滴加在抗原滴上，用灭菌牙签迅速将被检鸡全血与抗原混匀并散开至直径约为2厘米的薄层后，轻轻晃动玻板，观测至5分钟，判定结果并记录。2结果判定标准在阳性对照出现100%凝集和阴性对照液体均匀混浊无凝集现象的前提下，抗原与血液或血清混和后，于1分钟内出现很多大块的凝集颗粒且底液清亮者为强阳性反应，记录为“#”；13分钟内出现很多大小不等的凝集颗粒且底液略有混浊者为中强度阳性反应，记录为“+”；34分钟后，出现少量细微颗粒，-底液较混浊者为弱阳性反应，记录为“+”；未见凝集现象发生或在4分钟以后出现不明显的凝集现象者为阴性反应，记录为“一”。六、实验报告要求 1应将试验的结果写清楚，分析阳性结果的判断标准。 2将本试验在生产中应用及应注意的主要问题列出纲要。 七、实验注意事项 1鸡白痢平板凝集试验的应用： 鸡白痢是流行普遍、危害严重的家禽传染病，其传播的重要途径之一是经卵垂直传播。因此，搞好种鸡群中对该病的控制甚至净化工作是防制工作中的重要手段。鸡白痢平板凝集试验以简便、快捷、特异、敏感等特点在国内外普遍用于该病的临床检验，监视该病的控制与净化效果，指导控制与净化措施的修订与实施。为更好地发挥本试验在疾病控制中的作用，在实施检验时应注意如下事项。 2对一般性商品生产种鸡群作鸡白痢检疫时应注意以下问题： (1)检测样品抽检比例一般为12。 (2)检测出的阳性鸡只可淘汰也可不淘汰。 (3)检测的时间间隔对后备鸡群，首次检验应在40-70日龄，第二次检测在全面开产后每年检测23次。 (4)检测工作一定要配合有效的防疫工作。 (5)检测后对结果作统计，计算感染的阳性率并与上次检验结果比较，以便评估上次检测后相应防疫措施的效果，以便修订防疫计划，直至鸡群感染率下降至最低水平。 3对以建立净化鸡白痢为目的的SPF鸡群作检疫时应注意以下问题： (1)检测样品的比例应为100。 (2)检测出的阳性鸡只应予淘汰。 (3)检测时间间隔应为每月1次，或根据具体净化计划确定间隔时间。 (4)对阴性鸡群实施特别严格的隔离、卫生消毒措施和药物防制措施。 (5)鸡群完全净化的基本标准是以最后连续三次检测全为阴性，且鸡群在该段时间未用过对相应疾病敏感的药物。 4、注意事项 (1)鸡白痢抗原应保存于8-10C、避光、干燥处，使用过程中应不断摇匀。 (2)鸡向痢抗原适用于检查产蛋母鸡及一年以上的公鸡，对幼龄鸡的敏感性较差。 (3)平板凝集反应应在20以上的室温下进行。 (4)使用蓝紫色鸡白痢抗原作试验，最好衬以白色背景以便于观察。 (5)本试验还可以以被检鸡卵黄液作被检材料，判断标准同上。八、思考题 1鸡自痢平板凝集试验应注意哪些内容，判定结果的标准如何? 2在生产中为有效控制鸡白痢，应结合鸡白痢平板凝集试验采取哪些措施?实验三之二小鹅瘟琼脂扩散试验一、实验目的了解琼脂扩散（AGP）试验的原理，并掌握小鹅瘟（GP）琼脂扩散试验的的操作方法和临床应用的方法。 二、实验内容1GP琼脂扩散试验。 三、实验仪器、设备及材料1标准GP抗原：将已知GPV种毒按110稀释，接种于12-14日龄的无相应抗体的鹅胚尿囊腔内，02mL只，继续孵化，每天照蛋，收集接种后72-120小时之间死亡胚，气室向上静置4冰箱412小时，收获尿囊液及具有典型病变的胚体，取l份胚体，2份尿囊液捣碎制成匀浆，加等量三氯甲烷(氯仿)震摇30分钟，以3500转/分钟离心30分钟，吸取上清液装入透析袋，包埋于干燥硅胶中越夜，至袋内溶液完全干燥，向袋内加入原液容量1/20的去离子水，使内容物溶解，即为沉淀抗原。2标准阳性血清：小鹅瘟高免血清。3被检抗原：无菌采取具有典型病变的患病雏鹅肝组织，捣碎加2倍量离子水，制备成组织悬液，参照制各标准GP抗原方法用氯仿处理硅胶包埋浓缩加入原悬浮120的去离子水为被检抗原。4被检血清：受检雏鹅血液自然析出的血清。5琼脂板凝胶制备与打孔： 凝胶配方：琼脂糖 0.71.2克，氯化钠 8克，苯酚0.1mL，蒸馏水 100mL。凝集制备：将各种试剂依次加入后，用5.6碳酸氢钠溶液调pH 6.8-7.6，水浴加热使琼脂糖充分溶解。将溶化的琼脂凝胶倾注于清沽的玻板上或平皿，制成厚度约为3毫米的琼脂凝胶板。注意不要产生气泡。打孔方法同马立克氏病琼脂扩散试验。打孔：在制备好的琼脂凝胶扳上打孔，(其打孔图形按需要而定，一般采用七孔梅花图形，操作时，先用一张与凝胶板大小相仿的白纸片，按要求画好打孔图形，然后，将图形放在凝胶板底下，用打孔器依样打孔。四、实验原理琼脂扩散试验(AGP)是血清学沉淀试验的一种，以琼脂凝胶作为抗原抗体免疫扩散和形成沉淀反应的载体。琼脂凝胶的含水量在90以上，能允许分子量在200000以下的大分子物质自由通过和扩散，绝大多数的可溶性抗原与免疫球蛋白的分子量都在200000以下，所以能在凝胶内自由扩散。若特异的抗原、抗体在凝胶中各以其固有的扩散系数扩散，当两者在比例最合适的区域内相遇，反应生成的沉淀物的颗粒较大，停留在凝胶中不再扩散，即发生沉淀反应形成不透明的白色沉淀线。小鹅瘟琼脂扩散试验，可用标准抗原检测血清抗体，亦可用标准血清检测GP抗原，前者阳性检出率为100，后者检出率达50以上。五、实验步骤 1操作程序方法一：用GB标准抗原检测受检血清GB抗体 用移液管吸取标准GB抗原加入中心孔内，外周任何两个相对孔加入GB标准阳性血清，其余各外周孔加入各被检鹅的血清，容量以平孔面为度，注意不要溢出孔外，不要有气泡，并记录点样顺序。所有样本加入完毕，放入湿盒35-37恒温中过夜，次日（24h）观察并记录结果。方法二：用GB标准阳性血清检测GB抗原 用移液器吸取GB标准阳性血清加入中心孔内，外周任何相对的两孔加入标准GB抗原，其余外周孔分别加入受检鹅组织处理液，加入量以平孔面为度。注意不要溢出孔外，不要有气泡，并记录点样顺序。 所有样品加完后，放入温盒置35-37恒温箱中过夜，次日观察并记录结果。3结果判定 若受检血清有GB特异抗体或受检组织含有GB病毒抗原，则在抗原与抗体孔之间产生肉眼可见的清晰的白色沉淀线，此为阳性反应。相反，如抗原、抗体之间不出现沉淀线则为阴性。 沉淀线一般出现在抗原抗体孔之中间，但有时由于抗原浓度与抗体浓度不一，沉淀线往往偏近抗原孔或抗体孔，有时可能出现一条以上的沉淀线，这些情况均属阳性反应。如果被检孔没有出现白色沉淀线，但邻接的阳性对照孔的沉淀线末端向该被检孔内侧偏弯，可认为该被检孔样品为阳性：若邻近的阳性对照孔的沉淀线末端向该被检孔直伸或一向其外侧偏弯，或该被检孔虽然有沉淀线，但该沉淀线与阳性对照孔沉淀线交叉(属非特异性沉淀线)，则此被检样品为阴性。 理论上，大多数传染病都可应用AGP试验作检验，目前常应用AGP试验检测的家禽传染病还有鸡马立克氏病、传染性法氏囊病、家禽脑脊髓炎、病毒性关节、滑液囊霉形体病、禽流感、禽霍乱等，基本原理和方法同上，具体操作可按试剂说明书进行。六、实验报告要求 1说明琼扩试验的基本原理、方法。 2准确报告本次试验的结果，分析存在的问题。 3说明本试验还可以应用于哪些家禽传染病的检验。七、实验注意事项 1配制琼脂凝胶时，琼脂浓度的很重要，要根据经验而定，琼脂浓度较大时，制成的琼脂胶较硬，较易打孔，但过硬的凝胶板容易在反应过程中千裂，而且由于密度大，还会影响样本的扩散速度；而浓度太小时，琼脂凝胶板则很软，难于打孔，而且打孔后，孔内容易渗出水来，影响加样量；气温高时，浓度应大些，气温低时，浓度应小些。通常浓度为0.651.2o 2为了避免打孔时孔周边琼脂脱离漏底，可在制各琼脂板前，将玻璃板浸入充分溶化的琼脂凝胶液中，取出放在恒温箱中烘干。再行倒板，这样由于玻璃板面较粗糙，与琼脂结合较牢，打孔时孔周琼脂不易脱离。 3点样时，其加样量应统一以加至各孔满为标准，不要时多时少。如果抗原抗体的比例不当，最易影响反应结果。 4反应温度必须始终相对恒定，否则可能会造成假阳性。 5观察结果最好在日光灯下进行，必要时可借助放大镜。八、思考题 1家禽传染病的AGP试验基本操作方法与注意事项如何?结果判定方法如何? 2本方法常可用于哪些家禽病的检测?实验四 鸭疫里默氏杆菌病的实验诊断一、实验目的1了解鸭疫里默氏杆菌病的实验诊断程序与方法。 2熟悉鸭疫里默氏杆菌的形态特点、培养性状、生化特征和致病性。二、实验内容 1. 鸭疫里默氏杆菌病的临床症状与病理变化观察。 2鸭疫里默氏杆菌病的病原分离和培养。 3鸭疫里默氏杆菌培养特性与细菌形态观察。 4鸭疫里默氏杆菌的生化特性观察。 三、实验仪器、设备及材料 1解剖剪、镊子、解剖盘、接种棒、酒精灯、酒精棉球、一次性手套、灭菌棉签、1ml注射器、放大镜、香柏油、擦镜纸、显微镜、生化培养箱等。 2试验动物、鲜血琼脂平板、肉汤培养基、灭能小牛血清、微量生化发酵管等、革兰氏染色液等。四、实验原理根据鸭疫里默氏杆菌的特征病理变化、培养特性、菌体形态和生化特征，可以同其他细菌性病原导致的家禽传染病鉴别；但分离菌株是否具有致病力须采用敏感动物进行人工致病试验。五、实验步骤 1. 鸭疫里默氏杆菌病的临床症状与病理变化观察认真观察实验鸭只的临床症状后进行详细系统的解剖，观察病鸭的病理变化。发生鸭疫里默氏杆菌病病鸭表现出该病的特征症状与病变，病鸭主要特征表现为精神沉郁、湿眼圈，鼻窦部肿胀，跗关节肿胀，中枢神经紊乱，共济失调；剖检可见纤维素性渗出性心包炎、肝周炎和气囊炎，部分病鸭可见鼻窦腔有黄白色干酪样渗出物。 2鸭疫里默氏杆菌病的病原分离和培养。 在急性败血症期，细菌在病鸭各器官组织，如心血、脑、气囊、肝脏、肺、骨髓和病变渗出物中均可分离到，而前三种器官最适合细菌分离。无菌操作剪开病鸭腹腔和头部颅骨，分别从心血、肝脏和脑进行细菌分离，划线接种鲜血琼脂平板（或巧克力琼脂、胰酶大豆琼脂），置烛缸或厌氧培养箱37培养24-36小时，观察细菌生长情况。 3鸭疫里默氏杆菌培养性状与细菌形态观察。培养特性 鸭疫里默氏杆菌在鲜血琼脂、巧克力琼脂和胰酶大豆琼脂上生长良好，在血液琼脂上经37培养24小时，可形成1-2.5mm、圆形、凸起、边缘光滑、闪光或奶油状菌落，不溶血。在血液肉汤中经37培养24小时，可见上下一致浑浊，管底无或仅有少量灰白色沉淀物。在麦康凯琼脂上不生长。细菌形态 将鸭疫里默氏杆菌分离菌株的1824小时纯固体培养物按常规进行革兰氏与瑞氏染色，普通光学显微镜下（油镜）观察菌体形态。鸭疫里默氏杆菌为革兰氏阴性、不运动、不形成芽孢的杆菌，大小为（1-5）m（0.3-0.5）m，单个或成双存在，液体培养可见丝状长达11-24m。瑞士染色呈两极着色。 4鸭疫里默氏杆菌的生化特性观察。将接种环拉直并烧灭菌后（稍冷却）挑取血液琼脂平板分离菌的24小时培养的单菌落接种细菌微量生化反应管，发酵管开口端用胶布封口，盲端向上3045度角放置烛缸37培养24-36小时，观察发酵管内液体的颜色变化。鸭疫里默氏杆菌不发酵葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇。吲哚和硫化氢试验、硝酸盐还原及枸橼酸盐利用试验均为阴性。六、实验报告要求1扼要反映鸭疫里默氏杆菌病病鸭的的病原分离、细菌形态观察、培养特性和生化特性检验的实验步骤。 2准确报告本次试验的结果，分析存在的问题。七、实验注意事项 1注意鸭疫里默氏杆菌的染色方法及显微镜下的形态特点。 2注意禽鸭疫里默氏杆菌的培养特性与生化特性。八、思考题 1鸭疫里默氏杆菌病的实验诊断的基本方法如何?2鸭疫里默氏杆菌病的培养特性与生化特性如何?第二部分教学实习指导鸡新城疫的实验诊断1 实习目的要求通过本课程实习，掌握鸡新城疫常规实验诊断原理、方法，并可据此开展对其他家禽病毒性传染病的实验诊断。2 实验原理NDV感染鸡通常可表现呼吸困难、嗉囔积液、头冠紫黑等特征症状，出现腺胃、肌胃出血，盲肠扁桃体肿大、出血，泄殖腔出血等特征病理变化。ND病毒可大量存在于肝、脾、脑的器官和呼吸道、消化道分泌物中并可在鸡胚上增殖，使鸡胚感染致死。感染胚液（病毒）可以凝集鸡等动物的红细胞，该凝集能力可以被特异抗体抑制。根据本病毒以上特征，采用鸡胚从疑似ND病鸡病料中分离增殖病毒，经HA、HI试验和人工发病试验等，可以鉴定本病毒，而对鸡新城疫作出确诊。3 实验路线病鸡的剖检与病料采取处理-病毒的分离培养-病毒的鉴定-实验结果-实验结论。4 实验主要用材4.1 ND血清，适量，HI效价为1：32，购自哈尔滨兽医研究所，冻结保存备用。4.2 疑似ND病鸡： 2只（死活各1），病鸡30日龄左右。10d龄曾以IV系弱毒疫苗饮水免疫，约28日龄开始发病，病鸡表现厌食、呼吸困难、嗉囔肿大、头冠紫黑等症状，死亡率达30%。发病后曾采用抗生素治疗效果不理想。4.3 病禽尸体剖检、病料采集与处理的用材：剖检盆、消毒剂、剪刀、毛巾、镊子、酒精棉、酒精灯；灭菌的研钵、棉签、西林瓶（若干）、PBS生理盐水（配方见4.6）、510ml注射器超滤器、离心管（若干）与离心机等。4.4 病毒分离增殖培养用材：10日龄健康鸡胚(来源于ND低免母鸡群)10只；恒温培养箱；1毫升注射器、打孔器、西林瓶等灭菌备用；酒精棉球、碘酊棉球、石蜡、暗室；普通冰箱等。4.5 病毒鉴定用材（HA、HI试验用材）：包括被检病毒、灭菌PBS生理盐水、1%红细胞悬浮液（配方见4.7）、25L 移液器，96孔V型反应板等。4.6 PBS的配制：按PBS配方准确称取试剂（NaCl 4g；Kcl 0.1g；Na2HPO4 1.45g；KH2PO4 0.1g）溶于400mL蒸馏水中过滤测试PH值高压灭菌备用。4.7 红细胞悬液配制(包括公鸡的采血) ：用5ml注射器吸取1 ml抗凝剂采取公禽血液4ml摇匀注入离心管加入PBS盐水洗涤3000rpm，15分钟，重复用PBS洗涤2次量取沉淀的红细胞加入99倍PBS稀释成1悬浮液48保存备用。5 实验方法5.1病鸡剖检与病料采取处理5.1.1 病鸡的剖检5.1.1.1 病禽的体表检查（包括天然孔、皮肤各关节及营养状态的检查）；5.1.1.2 体表的消毒：用消毒水将亲体羽毛浸湿，以防止病原扩散及避免羽毛飞扬；5.1.1.3 皮下打开与检查：用剪刀将股内侧连接腹侧的皮肤剪开，将两腿向外和下方翻压，直至股关节脱臼，使禽体被卧位平放于瓷盆上。横向剪开腹部皮肤，使切口与上述股侧皮肤切口相连，握住有游离皮肤，向前一直剥落到锁骨部，观察皮下肌肉有没有出血、失水等现象；5.1.1.4 体腔打开与检查：用点燃的酒精棉在以被打开的肌肉上充分消毒，横向剪开腹肌、腹膜，并沿胸骨的两侧，向前将各肋骨、锁骨剪断，抓住龙骨的后端，用力向前向上翻拉，暴露整个体腔的器官并作器官表面检查；5.1.1.5 内脏摘出与检查：将内脏器官小心摘除移至体腔外，依次观察检查体腔及其附着器官和摘除移出器官。5.1.1.6 头颈部与法氏囊的检查。5.1.2 病料采取处理5.1.2.1 病鸡（活）口腔拭子采取与处理：用灭菌棉签从病鸡口腔气管内拭取粘液折取拭子头部置于灭菌西林瓶内加入3-5ml PBS生理盐水（含适量庆大霉素）震荡置4-8待作无菌检验（样品简称拭子悬液）。5.1.2.2 病鸡(死)组织病料的采取与处理：于上述剖检过程病鸡打开体腔后，经无菌手续采取肝、脾、脑至研砵 充分研磨加15-20倍PBS生理盐水（含适量庆大霉素）震荡离心取上清液置4-8待作无菌检验（样品简称组织悬液）。5.1.2.3 病料上清液的无菌检验及超滤：用1ml注射器分别吸取拭子悬液及组织悬液0.2ml于营养肉汤培养基，作无菌检验（注意做好标记与记录）次日早上观察无菌检验结果并记录，剔除菌检不合格样品，合格样品待作接种鸡胚。5.2 病毒分离培养5.2.1 禽胚的准备(消毒与定位等)：准备约37温水适量加入适量福尔马林溶液配备消毒温水洗涤鸡胚在暗室中检查鸡胚健康情况，剔除不健康胚用蜡笔画出气室与接种部位继续孵化。5.2.2 病毒的接种：照胚，剔除不健康胚胚蛋气室与接种部位消毒病料的接种（0.2ml/只鸡胚，其中拭子悬液接种适量，组织悬液接种适量）封口继续孵化以后每天照胚2次（每次及时检出死胚置48保存待检），直至接种后72小时。5.3 病毒的鉴定5.3.1 感染鸡胚的剖检与胚液收集：鸡胚消毒剪开气室壳、膜剔除细菌污染胚刺破羊水膜检查鸡胚胚体病变每只胚分别收集胚液置疫苗瓶中记录胚液的具体来源（该胚接种液种类，死/活，污染与否），备作HA检测。5.3.2 胚液的HA检测：选择疑似病毒感染胚胚液作HA检测，其基本步骤如下述“1）7）”及表1：1）分装PBS生理盐水；（1-12孔，25ul）；2）第一孔加25ul被检病毒（胚液）；3）稀释被检病毒：1-11孔作倍比稀释；4）加入PBS生理盐水：（1-12孔，25ul）；5）加入红细胞悬液；（1-12孔，25ul）；6）静置15-20min7) 判定结果（读出各胚胚液HA效价并记录）表1 红细胞凝集（HA）试验（微量法） （单位：l）孔号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 122 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 PBS对照25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 弃2525 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 2525 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25被检病毒稀释倍数PBS盐水被检病毒PBS盐水1%红细胞悬液作用温度与时间振荡器上振荡混均约1min，放入37恒温箱中1530 min，反应结果举例 注“”：凝集。凝集反应者，凝集的红细胞呈薄膜状，均匀的复满孔底，有的似有红细胞沉积于中央。“”：不凝集。红细胞全部沉于孔底中央，周围无散在的红细胞