组织蛋白酶与动脉粥样硬化性脑血管病.doc

组织蛋白酶S与动脉粥样硬化性脑病张 敏 刘亚民 张 波 【摘要】组织蛋白酶S（Cathepsin S）是广泛分布在人体各种组织细胞溶酶体中的一类蛋白水解酶中的一种，它使酶失活、蛋白质降解，失衡后促进炎症反应、促进动脉粥样硬化、诱发糖尿病和肥胖等。近年来的研究表明，组织蛋白酶S与血管危险因素和动脉粥样硬化脑血管病之间均存在一定的相关性。【关键词】组织蛋白酶；组织蛋白酶S,亚单位；脑缺血；动脉粥样硬化； 危险因素CathepsinS and atherosclerotic cerebrovascular diseasesZHANG Min LIU Ya-min ZHANG Bo Department of Cerebral Vessels, Frist Affiliated Hospital of Medical College, Xian Jiaotong University, Xian 710061, Shanxi, ChinaCorreponding author: Liu Ya-min, Emial: 【Abstruct】 Cathepsin S is one of the Cathepsins that distributes generally at lysosomes of histiocyte in humans body. It has variety of actions when it is unbalancing, including promote inflammation, atherosclerosis, diabetes and obesity, etc. Studies in recent years have demonstrated that there are certain correlations of adiponectin with vascular risk factor and cerebrovascular disease.【Key words】 Cathepsins; Cathepsin S, Subunit; Brain Ischemia; Atherosclerosis; Risk Factors 动脉粥样硬化脑血管病具有发病率高、致残率高、死亡率和复发率高等“四高”特点，并成为我国国民第一位的死亡原因。目前认为，针对动脉粥样硬化脑血管病危险因素的防治更为重要，人们始终在努力探寻动脉粥样硬化脑血管病的各种危险因素，希望通过控制危险因素达到对动脉粥样硬化脑血管病的一级预防。通过12年的追踪和临床观察，最近人们发现组织蛋白酶S可预警心血管的风险和死亡率1，而动脉粥样硬化脑血管病和心血管病有着共同的危险因素，发病机制也相似，所以组织蛋白酶S亦可能与动脉粥样硬化脑血管病有关。1.组织蛋白酶S的生物学特性组织蛋白酶（Cathepsins）是一类组织蛋白水解酶，它们广泛地分布在人体各种细胞和组织的溶酶体中。它可以水解体内各种酶和蛋白质，使酶失活，蛋白质降解，从而调节人体内各种生理和病理生理反应。Cathepsins依其活性成分中氨基酸的不同，可以分为丝氨酸、天门冬氨酸、半胱氨酸等几大类，现有A、B、C、D、E、F、G、K、L、V、S等20多种。Cathepsin S只是其中的一种，属于半氨酸蛋白酶类。组织蛋白酶S基因位于第l号染色体q214。人类基因组中共561个基因被证实编码蛋白酶，其中148个编码半胱氨酸蛋白酶2。CathepsinS于1975年由Kirschke等首先从牛淋巴结中提取出来，主要分布在脾脏、淋巴结、心脏和抗原呈递细胞,分子质量为28 kDa3 。Cao等4在CathepsinS基因的启动子区内核苷酸-25处发现了GA等位基因改变。由于CathepsinS在动脉粥样硬化中起着重要的作用，而且-25GA多态又位于启动子区，可能在基因转录调控中发挥重要作用。所以，有学者把该位点作为与动脉粥样硬化发生有关的候选基因多态位点5。CatS能够降解ECM分子如层黏连蛋白、胶原蛋白、弹力蛋白及硫酸软骨素。在体内组织蛋白酶多以无活性前体形式存在，切除前体N-端的前肽，则被激活。此外，体内还有相应的内源性的蛋白酶抑制剂（Cystatins）存在，其中Cystatins C可以抑制Cathepsin S的活性。因此，在体内Cathepsin /Cystatin之间平衡调节，可能是实现组织蛋白酶生理和病理功能的基础。由于组织蛋白酶可以降解细胞内外多种酶和蛋白质，包括细胞外基质（如胶原蛋白、粘连蛋白、弹性纤维、硫酸软骨素等）、变性蛋白、凝血因子、代谢和转换酶、肽类激素等等6，因此，它在体内炎症免疫、抗原提呈、血管生成、细胞增殖、凋亡、粘附、浸润、迁移、内呑、自噬、细胞外基质重塑、损伤修复反应中都起着重要作用。此外它还可能作为“Transcriptional Activatotors”，参与体内多种基因的表达调节。CathepsinS作为一种半胱氨酸蛋白酶，参与了导致心血管疾病、癌症的旁路，一项前瞻性的数据分析中表明循环中CathepsinS水平与人死亡率可能存在着某种关系, 该研究发现在老年人群中较高的血清CathepsinS水平伴随着死亡率的升高，但仍需更多的研究证实CathepsinS在这一过程中的作用，以及这一指标是否具有临床实际意义1。2. Cathepsin S与动脉粥样硬化2.1 组织蛋白酶S与动脉粥样硬化炎症反应 组织蛋白酶S（Cathepsin S）与动脉粥样硬化炎症反应有密切关系。研究表明，低密度脂蛋白、炎症因子等均能促进血管平滑肌细胞（VSMC）、内皮细胞（EC）对CatS的分泌与表达，降解细胞外弹性蛋白及胶原蛋白，易于血管平滑肌细胞（VSMC）迁移和增殖，参与血管重塑与动脉硬化斑块形成7。CatS及CysC在AS形成的全过程中均起作用, CatS由巨噬细胞、细胞因子刺激的SMC及EC产生8。人类AS病变处CatSmRNA和其蛋白的水平比正常动脉处显著增加,CatS能够降解弹力蛋白和胶原蛋白，但CysC的表达显著下降,而正常动脉中膜的SMC和EC则可表达丰富的CysC9、10,提示与正常血管比较,AS的炎症过程损伤的动脉壁存在CatS与CysC的失衡,可导致动脉ECM破坏。CatS通过与人类CD40-CD40L信号系统之间的联系间接参与动脉粥样硬化炎症反应。人类CD40-CD40L信号途径通过在受损血管内皮细胞表面相互作用导致内皮细胞、平滑肌细胞活化，表达多种粘附分子如E-选择素、血管细胞粘附分子-1(vasculer adhesion molecule1-1，VCAM-1)、细胞间粘附分-1(inter cellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，在动脉粥样硬化形成的初期阶段发挥重要作用11。有研究表明，在冠心病患者血清中可检测到升高的CatS mRNA水平，并伴随着血清CD40 mRNA水平的升高，表明CatS在动脉粥样硬化中的活动与CD40高表达有某种关系12。此外，Jobs, E 等发现在体重正常的老年人群中血清CatS与CRP、IL-6有密切联系，并参与炎症反应，且CatS与炎症反应之间的关系独立于肥胖这一项危险因素13。以上说明CatS与动脉粥样硬化炎症反应有着密切关系，并有可能通过免疫反应在动脉粥样硬化中起到作用。2.2 Cathepsin S在动脉粥样硬化斑块中的分布 CathepsinS在内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞中均有表达，细胞外基质，包括弹力蛋白、胶原蛋白，都可被CathepsinS及其它组织蛋白酶降解，CathepsinS促进了泡沫细胞的形成。甚至可以导致斑块的破裂，并且和CathepsinF共同通过减少胆固醇逆向转运促进了泡沫细胞的形成14见图1。免疫组化染色研究显示,人类正常动脉很少表达CatS,人类早期的AS病变、脂纹处内膜和中膜的SMC表达CatS；在进展期的AS斑块, CatS主要表达于AS病变肩部区域中的巨噬细胞、纤维帽的SMC及断裂的内弹力板,提示CatS参与了血管壁弹力板的降解,有助于SMC迁移,并通过降解纤维帽的胶原蛋白使AS斑块不稳定8。因此,通过抑制CatS减少ECM降解对于AS的形成具有保护作用。2.3 Cathepsin S与动脉粥样硬化斑块易损性及病变程度 CatS基因敲除鼠模型的获得为体内研究组织蛋白酶及其抑制剂在AS中的作用提供了可能。Kenneth J15发现与年龄、性别、品种相匹配的单纯ApoE（-/-）小鼠相比，喂食致肥胖的ApoE/CatS双基因敲除小鼠头臂动脉粥样硬化急性破裂斑块少了73%,且体积减小了46%。将斑块大小标准化后，ApoE/CatS双基因敲除小鼠急性斑块破裂率减少了72%，作为象征不稳定斑块类型的纤维层的数量，在双基因敲除小鼠中也减少了67%。将半胱氨酸蛋白酶抑制剂，例如white cystain，作为组织蛋白酶生物素定位探针，在提取出的人颈动脉斑块中也选择性的检测出了CathepsinS。de Nooijer R16认为白细胞CatS缺乏导致了斑块形态学的改变，凋亡的减少，平滑肌细胞（SMC）含量和胶原蛋白降解的减少。给CatS(-/-)小鼠和CatS(-/-)嵌合体小鼠均喂食高脂饲料后，其大动脉根部损害面积未探测到明显区别，然而白细胞CatS缺乏的小鼠斑块形态学发生了显著变化，导致了斑块坏死核心区减少了77%以及丰富的泡沫细胞的大量减少。CatS(-/-)嵌合体小鼠斑块内含有17%多的巨噬细胞，不足62%的平滑肌细胞和少于33%内膜胶原蛋白，后两者可归结为弹力纤维层的减少。而且白细胞CatS缺乏的小鼠斑块巨噬细胞凋亡减少了60%。体外研究还发现，CatS参与了胆固醇代谢和胶原蛋白、纤维蛋白基质中巨噬细胞的凋亡。另有研究报道17,动脉粥样硬化病人的血清CatS水平显著升高,当血清CatS水平高于0.42 nmol/L时，提示病人存在较严重的动脉粥样硬化或预示病人有发生缺血性临床事件的可能性，其可能与动脉粥样硬化斑块的稳定性及血栓形成密切相关。因此，Cathepsin S在斑块稳定性中起到了重要作用，并与动脉粥样硬化病损程度呈正相关。3.Cathepsin S动脉粥样硬化的危险因素3.1 Cathepsin S与糖尿病 动脉粥样硬化和糖尿病互相密切联系并都参于了大动脉弹力纤维降解。在糖尿病动物模型体内大动脉弹力蛋白降解伴随着增高的弹力蛋白酶的活动18。在人动脉粥样硬化区可以证实增高的具有弹力蛋白降解作用的组织蛋白酶S（CathepsinS）以及降低的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（CystatinC），证明在人动脉粥样硬化或者糖尿病过程中存在着血清CatS和CysC的失衡交替6、19。通过对107名动脉粥样硬化患者和103名糖尿病患者及30名无以上两种疾病者进行血清CatS和CysC的ELISA测定，发现在修正CysC水平、吸烟、血糖、肾功能、肌酐等因素后动脉粥样硬化狭窄者或糖尿病患者血清CatS水平均较高，而且，急性心梗、陈旧性心梗或者不稳定性心绞痛的患者在修正CysC水平、吸烟、血糖、肌酐等因素后血清CatS水平也有提高。不同的是，修正年龄、吸烟、肾功能等因素后糖尿病患者血清CysC水平高于正常对照组，而动脉粥样硬化者血清CysC水平的升高伴随着肌酐水平增高及肾功能不全，血清CysC水平的增高对动脉粥样硬化没有显著意义。因此升高的血清CatS可能是这两种疾病的一个生物标志物20。CatS在I型糖尿病（IDDM）的发生、发展中也起到重要作用，CatS（-/-）非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠发生糖尿病的时间推迟至4.5-5.5月龄，而野生行NOD小鼠发生I型糖尿病（IDDM）的平均时间为3.9月龄，缺乏CatS基因纯合子的NOD小鼠与野生型NOD小鼠相比，糖尿病发生率减少了33%21。3.2 肾素-血管紧张素（RA）系统和组织蛋白酶促进了动脉粥样硬化的发展 肾素-血管紧张素（RA）系统参与了高血压病的发病机制并维持血压高水平。血管紧张素II受体，作为肾素-血管紧张素（RA）系统的主要效应器，通过两种血浆胞膜受体1和受体2调节了血管内环境稳态，RA系统和组织蛋白酶一同促进了动脉粥样硬化的发展及斑块的易损性22。通过研究血管紧张素II受体1（AT1）拮抗剂-奥美沙坦，对头臂动脉粥样硬化斑块中Cathepsin S水平的影响，发现：喂食高脂饲料的apoE缺乏小鼠，每天以3mg/kg奥美沙坦处理，可维持高水平胶原蛋白、弹力蛋白及减轻斑块发展及减少动脉粥样硬化斑块中CatS水平。免疫组化染色显示奥美沙坦的使用抑制了斑块中巨噬细胞的聚集，在巨噬细胞内可观察到CatS和AT1的免疫反应，暴露于血管紧张素II的培养的巨噬细胞中CatS的mRNA含量和巨噬细胞介导的胶原蛋白、弹力蛋白降解活动大大提高，而这些影响可被奥美沙坦和NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素减弱。说明了巨噬细胞来源的CatS参与了动脉粥样硬化斑块的易损性，而AT1抑制剂通过抑制巨噬细胞内CatS活动维持了斑块的稳定性23。因此推测临床服用ARB类降压药物可能通过RA系统抑制Cathepsin S活动，进而减缓或抑制动脉粥样硬化的发生及发展。Aikawa E24发现50%的慢性肾脏病患者（CRD）最终死于心血管疾病，包括严重的大动脉管壁钙化及冠心病，其主要原因为体内CatS的显著促弹性蛋白降解作用促进了CRD患者动脉及大动脉管壁钙化，这为心血管钙化的病理生理过程提供了新的视角。肾素-血管紧张素（RA）系统和细胞外基质酶（ECM）包括组织蛋白酶和MMPs显著的参与了动脉粥样硬化易损斑块的机制，抑制RA系统和AT1拮抗剂的应用可能是一种治疗动脉硬化及稳定斑块的临床措施。 3.3 Cathepsin S与肥胖 在过去的10年，我们对与脂肪组织的观点发生了重要的改变，新的观念认为，脂肪组织在与肥胖并存的代谢性和血管性疾病的病理机制中扮演着重要作用，肥胖人群中脂肪组织的扩大并不仅仅意味着体内脂肪累积的升高，还可以自己分泌一些生物分子，包括炎症因子(IL-6, IL-1, MCP-1)和血栓调节因子(PAI-1)，肥胖人群血浆中这些因子都有升高25-27。因此肥胖是动脉粥样硬化的一项高危因素，有研究通过大量的转录分析发现CathepsinS在肥胖的发生发展中也起到作用。肥胖人群分解的脂肪组中比非肥胖对照组的脂肪组织过高表达了240种基因，CathepsinS基因是第一个被发现命名，且与体重指数（BMI）高度相关的基因。尽管肥胖人群脂肪组中还高表达了其他组织蛋白酶家族成员，例如CathepsinK、CathepsinL等，但在肥胖人群减重后，血清CathepsinK、CathepsinL与减重前无明显变化，与之相比，肥胖使脂肪组织和循环中CathepsinS浓度升高，减轻体重能降低血清CathepsinS浓度，这说明降低的血清CathepsinS浓度与脂肪减少相比，更多的与能量摄入降低相关，CathepsinS与CathepsinK、CathepsinL相比更容易被影响人类代谢的能量平衡影响，说明CathepsinS是与人类肥胖具有临床相关性的组织蛋白酶28。Naour, N发现肥胖人群脂肪组织中Cathepsin S的mRNA含量较体重正常人群中明显增高，认为Cathepsin S比CathepsinK、CathepsinL更能影响脂肪组织和循环中的能量平衡，推测通过选择性组织蛋白酶抑制剂的应用或许可以降低心血管疾病的发病风险以及改善肥胖人群的代谢状态29。他还发现在血清cystatin C在肥胖人群两性中均升高，cystatin C mRNA在皮下和网膜脂肪组中表达高于非脂肪组织2倍多，说明肥胖促使了血清cystatin C升高，并强烈支持扩大的脂肪组织是cystatin C表达增高的来源，因为cystatin C可通过局部或系统性的抑制组织蛋白酶调节脂肪组织和血管内稳态的作用，推测其可能与CathepsinS共同通过肥胖人群的内分泌系统在肥胖及其并发症的发生中起到调节作用30。5. 小结综上所述，Cathepsin S在动脉粥样硬化的发生、发展中起到关键作用，并通过ECM降解贯穿动脉粥样硬化性疾病始终。Cathepsin S不但参与动脉粥样硬化，还可以调节糖尿病、高血压、肥胖、RA系统等AS危险因素，在心脑血管疾病的发病过程中起到非常重要的作用，Cathepsin S不仅在以上这些人群中的组织中高表达，在血清中也可以检测到其含量的升高，一方面Cathepsin S参与动脉粥样硬化性血管病发病过程，另一方面又可以在应激时促进新生血管形成，可能也是闭塞动脉侧枝循环形成的机制，因此，通过研发Cathepsin S的临床检测手段及安全有效的Cathepsin S临床抑制剂，是否能指导心脑血管事件的一级预防仍需进一步研究。参考文献1. Elisabeth Jobs,Erik Ingelsson,Ulf Riserus,Elisabet Nerpin,Magnus Jobs,Johan Sundstrom,Samar Basu,Anders Larsson,Lars Lind,Johan Arnlov, Association Between Serum Cathepsin S and Mortality in Older AdultsJ. JAMA. 2011;306(10):1113-1121 2. CHAPMAN H A.Endosomal proteases in antigen resentationJ. Curr Opin Immunol,2008,18:78-843. ChengXW, KuzuyaM, NakamuraK,etal. Localization of cysteine protease, cathepsinS,to the Surface of vascular smooth muscle cells by association with integrin3 J.Am J Pathol, 2006, 168(2): 685-694. Cao HN，Robert A，HegeleHuman C鸭s gene(CTSS)promoter- 25GA polymorphismJ Hum Genet，2000，45：94-95 5. Tang ZHRussell PTCandidate genes and confirmed genetic poly morphisms associated with cardiovascular diseases： a tabular as$gmentJournal of Thrombosis and Thrombolysis,2001,ll:49-816. Bengtsson E, Nilsson J, Jovinge S. Cystatin C and cathepsins in cardiovascular diseaseJ. Frontiers in Bioscience.2008,13(5):5780-5786 7. 吴建芳，金沂，李国元. 组织蛋白酶K、S与动脉粥样硬化及其斑块不稳定性的关系J.临床心血管病杂志.2008,24(11):867-869.8. LutgensE, Lutgens SP, FaberBC,etal. Disruption of the cathepsin K gene reduces atherosclerosis progression and induces plaque fibrosis but accelerates macrophage foam cell formationJ.Circulation, 2006, 113(1): 98-107.9. Liu J, SukhovaGK, Sun JS,etal. Lysosomal cysteine proteases in atherosclerosisJ.ArteriosclerThromb Vasc Biol, 2004, 24(8):1359-136610. Abdul-Hussien H, Soekhoe RGV, Weber E, von der Thusen JH, Kleemann R, Mulder A, van Bockel JH, Hanemaaijer R, Lindeman JHN. Collagen degradation in the abdominal aneurysm-A conspiracy of matrix metalloproteinase and cysteine collagenasesJ.AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY.2007,170(3):809-817.11. Kleemann R, Zadelaar S KooistraT. Cytokines and atheroselerosis: a comprehensive review of studies in mice. Cardiovas Res,2008,79(3): 360-37612. Cerne D,Stern I,Marc J,Cerne A,Zorman D,Krzisnik-Zorman S,Kranjec I. CTSS activation coexists with CD40 activation in human atheroma: Evidence from plasma mRNA analysisJ.Clinical Biochemistry ,2011, 44 (5-6): 438-44013. Jobs E, Riserus U, Ingelsson E, Helmersso J, Nerpin E, Jobs M, Sundstrom J, Lind L, Larsson A, Basu S, Arnlov J. Serum Cathepsin S Is Associated with Serum C-Reactive Protein and Interleukin-6 Independently of Obesity in Elderly MenJ. JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY & METABOLISM. 2010,95(9): 4460-4464 14. Suzanne P. M. Lutgens, Kitty B. J. M. Cleutjens, Mat J. A. P. Daemen,Sylvia Heeneman1，Cathepsin cysteine proteases in cardiovascular diseaseJ。FASEB J. 2007,21(12):3029-3041 15. Kenneth J. Rodgers, Deborah J. Watkins, Alastair L. Miller,Peter Y. Chan, Sharada Karanam,William H. Brissette, Clive J. Long,Christopher L. Jackson. Destabilizing Role of Cathepsin S in Murine Atherosclerotic PlaquesJ.Arterioscler Thromb Vasc Biol.2006; 26(4):851-856 .16. de Nooijer R, Bot I, von der Thusen JH, Leeuwenburgh MA,Overkleeft H.S, Kraaijeveld A.O, Dorland R, van Santbrink P.J, van Heiningen S.H,Westra M.M, Kovanen P.T, Jukema J.W, van der Wall E.E, van Berkel Th.J. C, Shi G.P, Biessen E.A.L.Leukocyte Cathepsin S Is a Potent Regulator of Both Cell and Matrix Turnover in Advanced Atherosclerosis J. ARTERIOSCLEROSIS THROMBOSIS AND VASCULAR BIOLOGY. 2009, 29(2): 188-19417. 刘玉胜，鹿庆华，蒋卫东，杜贻盟，王永梅，张华岩，王欣，徐冬玲，郝琳，盛林，王群，秦爱琼. 血清组织蛋白酶S、胱抑素C水平与冠状动脉粥样硬化病变严重程度相关性的研究J.新医学，2008,39(4):219-22118. Thomas O. McDonald, Ross G. Gerrity, Christy Jen, Hao-Ji Chen, Kathleen Wark, Thomas N. Wight, Alan Chait, Kevin D. OBrien.Diabetes and Arterial Extracellular Matrix Changes in a Porcine Model of AtherosclerosisJ. Journal of Histochemistry and ytochemistry.2012,60(7):1149-115719. Lijnen HR. Extracellular proteolysis in the development and progression of atherosclerosisJ. Biochem Soc Trans.2002 ；30(2):163-167.20. Jian Liu, Likun M, Jintian Yang, An Ren, Zimin Sun, Gengxing Yan, Jiusong Sun, Huanxian Fu, Weihua Xu, Chengcheng Hu, Guo-Ping Shi,Increased serum cathepsin S in patients with atherosclerosis and diabetesJ. Atherosclerosis. 2006,186(2):411-41921. Lianne C. Hsing , Elizabeth A. Kirk , Timothy S. McMillen , Shuo-Hung Hsiao , Mark Caldwell,Barbara Houston, Alexander Y. Rudensky, Renee C. LeBoeuf. Roles for cathepsins S, L, and B in insulitis and diabetes in the NOD mouseJ.Journal of Autoimmunity.2010,34(2):96-10422. Fliser D, Buchholz K, Haller H. European Trial on Olmesartan and Pravastatin in Inflammation and Atherosclerosis (EUTOPIA) Investigators. 1. Antiinflammatory effects of angiotensin II subtype1 receptor blockade in hypertensive patients with micro inflammation. Circulation.2004,110:1103-1107.23. Takeshi Sasaki, Masafumi Kuzuya, Kae Nakamura, Xian Wu Cheng, Taiju Hayashi, Haizhen Song, Lina Hu, Kenji Okumura, Toyoaki Murohara, Akihisa Iguchi, Kohji Sato.AT1 blockade attenuates atherosclerotic plaque destabilization accompanied by the suppression of cathepsin S activity in apoE-deficient miceJ.Atherosclerosis 2010,210 (1): 430-43724. Aikawa E,Aikawa M, Libby P, Figueiredo JL, Rusanescu G,Iwamoto Y,Kohler RH, Shi GP, Jaffer FA, Weissleder R.Arterial and Aortic Valve Calcification Abolished