《纳米抗病毒药》word版.doc

第3章 纳米抗病毒药3.1概述3.1.1病毒感染的危害性据报道，6065%流行性传染病是由病毒感染引起的，国际病毒分类委员会于2005年5月提出的第8份报告，已发现的病毒超过6000种，分为3个目，73科，9个亚科，287属及1938种。使人类致病的病毒有1200多种，若包括病毒亚型及病毒变异株，其总数已超过10000多种。随着艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎等危害性大、发病率高、难于治愈的病毒性疾病在全球广泛蔓延，以及流感病毒、冠状病毒等呼吸道病毒基因的变异所出现新的变种病毒或病毒变异株, 多次暴发全球局部区域大范围流行，迫切需要新的预防和治疗药物，使抗病毒药物的研制成为世界医药市场令人关注的领域。3.1.2 抗病毒药物的研究现状对病毒性疾病的治疗，目前仍缺乏专属性强的药物。临床上常用的药物有：1、抑制病毒复制的抗病毒药;2、增强机体免疫功能的免疫调节药;3、针对临床症状的止咳、镇痛、退热和消炎等对症治疗药;4、防止继发感染的抗感染药;5、预防病毒感染的疫苗;6、阻断病毒传播的消毒药等。其中抗病毒药和免疫调节药能直接干预病毒的复制，是本文论述的重点。自1962年至2005年底，经世界各国批准使用的合成抗病毒药共56个品种，其中广谱抗病毒药1个，抗艾滋病病毒（HIV）药21个，抗疱疹病毒药22个，抗人乳头瘤状病毒药1个，抗呼吸道病毒药5个，抗肝炎病毒药3个，其他类别3个。我国抗病毒药物的研究与开发起步较晚，至今获得生产批文的抗病毒药有25个，其中广谱抗病毒药1个，抗HIV药6个，抗疱疹病毒药11个，抗人乳头瘤状病毒药1个，抗呼吸道病毒药3个，抗肝炎病毒药1个，其他类别2个，有近40的品种是国外早已淘汰的或年产仅几公斤的外用药1。3.1.3纳米载药、释药系统在抗病毒药物新制剂研制中的应用 纳米是指直径在11000nm数量级的微小分子颗粒。各种抗病毒药物的纳米载药、释药系统研制目前尚处于临床前的研究阶段，正在研制的纳米载药、释药系统新制剂有如下几种类型：1、 纳米裸粒子用超临界溶剂法可将抗病毒药物制成纯药物纳米粒子（即纳米裸粒子），或在滚轴器中，加入超低粘度羟丙基纤维素水溶液作表面活性剂，用硬质氧化锆研磨剂，旋转研磨45天可得粒径为127240 nm的纳米粒。这种药物纳米裸粒子的稳定性较差，在室温下放置易产生凝聚作用使分子颗粒增大。尚未见对抗病毒药物的纳米裸粒子进行药理性能研究的报道。2、 自乳化释药系统（SEDDS）自乳化释药系统是在没有水相存在的情况下，将疏水性抗病毒药物加入适当脂质和非离子表面活性物质形成热力学稳定的均一乳液，分装于软胶囊中，制成自乳化药物制剂，口服后在胃液水相中受胃蠕动和乳化剂的作用，即可形成透明状的小油珠，其粒径为100nm300nm、油珠的体积可小于50nm3，这种载药、释药系统称为SEDDS，能提高疏水性药物的口服生物利用度，已有4个HIV蛋白酶抑制剂制成自乳化制剂制，装入明胶软胶囊，获美国FDA批准临床使用。3、药质体（Phamacosomes）药质体是将抗病毒药物与脂质如甘油脂、磷脂等共价结合成两亲性脂质前体，并在水中自组装成高分散性的有序的聚集体，如囊泡。它属于一种自组装药物释药药系统（self-assembled drug delivery systems SADDS）。药质体中脂质前药的两亲性使其对生物膜有很好的亲和性和透过性，高度分散特性又使其在体内有靶向性和黏附性，是一种高效的新载药系统。4、纳米脂质体(lipid nanoparticle，LN)纳米脂质体是一种定向药物载体，用磷脂、胆固醇等为膜材包合纳米粒，形成脂质体双分子层，囊泡中央和各层之间被水相隔开，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性，从而提高药物的治疗指数。脂质体纳米粒对淋巴结也有靶向作用，适用于水溶性差、口服生物利用度低的药物作为释药系统。5、 固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticle，SLN)固体脂质纳米粒以天然或人工合成的固体脂质（如卵磷脂、脂肪酸甘油酯等）为载体将抗病毒药物包裹于脂质核中制成的纳米给药体系，可控制药物的释放，避免药物降解，并具有良好的靶向性等。6、前体脂质体纳米粒(proliposomes nanoparticle)前体脂质体亦称重建脂质体，系脂质体的前体形式，具有脂质体制剂的全部特性，有固体和液体两种形态。固体前体脂质体是具有良好流动性能的粉末，应用前与水水合即可分散或溶解成脂质体；液体前体脂质体系将抗病毒药物接上长链脂肪酸链制成前体药物，再将其包封于类脂质双分子层（厚度约4 nm）内而形成的微型囊泡。水溶性药物包封于双分子层的亲水基团夹层中，而脂溶性药物则分散于双分子层疏水基团的夹层中。前体脂质体可解决脂质体以混悬液形式贮存的一系列稳定性问题，如药物渗漏、粒子聚集、磷脂氧化和降解等，利于脂质体制剂的产业化和商品化。7、抗坏血酸棕榈酸酯脂质体（aspasomes）载药纳米囊 抗坏血酸棕榈酸酯是稳定性良好的亲脂性化合物，兼有抗氧化作用和透皮性能，用溶剂蒸发法将其与胆固醇和磷酸双十六烷基酯制成脂质薄片，再分散于含药的磷酸缓冲溶液中，可制成载药 aspasomes 脂质体纳米囊泡或纳米乳，用于释药制剂。上述各种类型纳米载药、释药系统新制剂在抗病毒药物应用的实例将在下述各类药物详细论述。研究表明，多种纳米载药、释药系统可使药物的药效与体内过程发生很大的变化，能增强药效，降低不良反应；对于难溶性抗病毒药物有望增大表面积增加溶解度，提高粘附性，从而改善吸收率、提高口服生物利用度或增强皮肤和眼内局部给药的浓度和延长药物作用时间;某些纳米靶向载药、释药制剂可将药物输送到特定的靶器官，改变药物在体内的分布，提高靶器官的药物浓度，利于透过血脑屏障，可用于治疗某些特定器官如肝脏、脑部及中枢神经系统的病毒感染；并可调节药物的体内循环时间和控制药物的释放速度，达到缓释或控释效果，使药物作用时间延长；对于某些核苷、核苷酸、多肽或拟肽类的抗病毒药物在体内易受酶的作用而失活，纳米载药、释药系统可起到一定的保护作用，提高其在消化道内的稳定性，用于提供新的给药途径。抗病毒药纳米载药、释药系统可能赋予传统常用制型许多新的特征，对药物的药效学和药物代谢动力学的影响已引起医药界的广泛重视，至今的研究成果已充分显示抗病毒药纳米载药、释药系统对新药的研究与开发有重要的意义2。3.2 广谱抗病毒药：广谱抗病毒药是指对人体多种RNA及DNA致病性病毒均有特异性抑制作用的药物。迄今，仅利巴韦林（ribavirin）在国内外批准临床使用。在研的药物有利巴韦林左旋异构体（levovirin）及其前药韦拉米定（viramidine），均处在期临床试验阶段，预计20072008年可投入临床使用。3.2.1 利巴韦林（三氮唑核苷、病毒唑）：1、一般特性利巴韦林为白色结晶状粉末，无臭、无味。在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚或氯仿中不溶，2 %水溶液pH 4.06.5。利巴韦林有广谱抗病毒作用。在细胞培养内抗RNA病毒作用较强，甲型、乙型流感病毒最敏感，最小抑制浓度（MIC）为0.052.5mg/L；对呼吸道合胞病毒、副流感病毒、麻疹病毒、汉坦病毒、拉萨热病毒、甲型肝炎病毒（HAV）和丙型肝炎病毒（HCV）等均有抑制作用。对DNA病毒敏感性较差，抑制疱疹病毒、腺病毒的MIC为1001000mg/L。动物试验对小鼠流感病毒肺炎、家兔疱疹及痘苗病毒角膜炎，猴感染拉萨热病毒均有治疗作用。利巴韦林难于越过血脑屏障，对小鼠乙型脑炎病毒感染无效，口服生物利用度约45。2、 研究概况1986年美国FDA首次批准在气雾罩内治疗小儿合胞病毒感染。1994年扩大适应症，单用或与重组基因-2a、-2b干扰素合用治疗丙型病毒性肝炎；我国于1973年研制成功，1980年鉴定投产。至今，已开发了注射剂、冻干粉针剂、葡萄糖注射液、氯化钠注射液、片剂、含片、分散片、胶囊、颗粒剂、泡腾颗粒剂、口服液、滴眼液、眼膏、滴鼻液；至今，已开发了注射剂、冻干粉针剂、葡萄糖注射液、氯化钠注射液、片剂、含片、分散片、胶囊、颗粒剂、泡腾颗粒剂、口服液、滴眼液、眼膏、滴鼻液和气雾喷雾剂等54个规格15种制剂；在研的还有吸入粉雾剂、注射用复方粉针剂、缓释颗粒、缓释胶囊、缓释片、口腔速崩片、脂质体口服乳、软膏、眼凝胶等等。临床上用静脉滴注早期治疗流感、副流感病毒性肺炎、小儿腺病毒肺炎、流行性肾出血热综合症和拉萨热等可减轻症状，减少并发症；口服可治疗甲型肝炎、带状疱疹、皮肤单疱病毒感染、麻疹及上呼吸道病毒感染；滴鼻加含片治疗甲、乙型流感可退热，缩短病程；滴眼剂可治疗流行性结膜炎、单疱病毒角膜炎和痘苗病毒角膜炎；乳膏剂可治疗带状疱疹和生殖器疱疹；气雾喷雾剂可治疗呼吸道病毒引起的鼻炎、咽峡炎和咽结膜热。3、利巴韦林缓释微丸陶秀梅3等采用离心造粒粉末层析法制备利巴韦林含药素丸，再用丙烯酸树酯水分散体包衣，得到利巴韦林缓释微丸，粒径650750m，收率90.1，载药量72.5，其释药动力学受渗透压驱动。4、利巴韦林前体脂质体于海翔等4-5以大豆磷脂为原料，加入胆固醇和维生素E,混匀后得乳白色脂质体微囊泡乳状液，经薄膜蒸发得利巴韦林前体脂质体，其形态为不规则的乳白色球体，偶见有谈黄色条块状或葡萄串样未充分分散开的磷脂聚集体及长条状的胆固醇结晶，其扫描电镜图如图3-1所示。图3-1利巴韦林前体脂质体固体形态的扫描电镜图（20000）利巴韦林前体脂质体水化后得脂质体乳液，其平均粒径为300.8nm，粒度分布较均匀，99.8粒子的粒径范围都在500nm以下，有少数粒径为2m以上的粒子；水化后的包封率约22，电位为-30.623mV；用差示扫描量热计(DSC)测得前体脂质体的相转变温度为-31.19；水化后脂质体的pH为5.20，在25时粘度为1.2mPs。脂质体乳液对肝脏有较强的靶向性，而鼻腔给药，能提高药物在肺部的分布，但对于药物穿透血脑屏障无促进作用；急性毒性试验6表明，腹腔注射LD50为1592.31119.02mg/kg，与利巴韦林水溶液比较无统计学差异；局部刺激性试验，脂质体乳液不增加鼻粘膜的刺激性。大鼠灌胃给予利巴韦林脂质体口服乳900mg/kg，与市售的利巴韦林口服液比较，脂质体乳液释药更平缓，在体内滞留时间长于市售的口服液，达峰时间（Tmax）为8.0小时，口服液为2.0小时；药物浓度峰值（Cmax）为31.0g/mL，AUC为1112.6gh/mL，消除速率常数k值为0.6 L/h，而口服液为0.046 L/h；相对生物利用度为121.3，与口服液等效。大鼠灌胃给予利巴韦林脂质体口服乳与市售口服液的药代动力学参数如表3-1所示。利巴韦林脂质体口服乳液已完成临床前试验研究，正在申报临床试验。表3-1 大鼠灌胃给予利巴韦林脂质体口服乳与市售口服液的药代动力学参数比较5参数市售口服液脂质体口服乳Tmax（h）2.08.0Cmax（g/mL）49.231.0AUC（S0）（gh/mL）917.51112.6AUMC(S1)21933.824016.0AUMC(S2)971330.2835953.2MRT（h）13.921.6VRT（h2）487.2285.4k0.0460.063.3 抗人免疫缺陷病毒药物人免疫缺陷病毒（HIV）所致获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome），简称艾滋病（AIDS）是危害性极大、死亡率很高的传染病, 据2004年12月世界卫生组（WHO）和联合国艾滋病规划署联合公布的全球艾滋病流行报告，全世界现有AIDS患者和HIV携带者人数为3940万，2004年新增感染者490万，死亡310万。自20世纪80年代初发现第一批病例，至今累计死于AIDS 的总人数已经超过3000万；中国现有HIV感染者约84万人；其中，AIDS病人约8万例，已死亡近10万人。若不加以有效地控制，至2010年HIV感染人数可能达到600万例，AIDS患者120万例，将造成严重的社会、经济问题。抗HIV药物近20多年来发展较迅速，至2005年底国外已批准上市的抗HIV药物21个品种，另有5个固定处方的复方制剂，其中抗HIV逆转录酶抑制剂11个，抗HIV蛋白酶抑制剂9个，HIV受体细胞融合抑制剂1个；我国批准生产的有6个品种。国外2005年在研的有119个品种，已进入III期临床研究的有10个品种，预计在20062008年可能上市的有非核苷类逆转录酶抑制药卡帕韦林（capravirine）和HIV CCR5受体抑制药马雷韦罗（maraviroc）；已批准上市的阿德福韦酯（adefovir dipivoxil）也可能扩大适应症用于治疗艾滋病。3.3.1 抗HIV逆转录酶抑制药 HIV逆转录酶（RT）是HIV pol基因编码的多功能酶蛋白，在HIV复制周期中起关键作用；有3种功能，即以HIV RNA为模板催化负链DNA合成；发挥RNase H 作用，降解RNA-DNA杂交链中RNA模板；以病毒负链DNA合成正链DNA，生成双链DNA原病毒。逆转录酶是理想的药物作用靶点，也是第一个用于筛选抗HIV药物的体外靶酶模型。已批准上市的抗HIV逆转录酶抑制剂共11个品种，其中核苷类HIV逆转录酶抑制药有8个：齐多夫定（zidovudine）、去羟肌苷(didanosine)、扎西他滨（zalcitabine）、司他夫定（stavudine）、拉米夫定 (lamivudine)、阿巴卡韦（abacavir）、替诺福韦酯（tenofovir disoproxil fumanrate）和恩曲他滨（emtricitabine）；非核苷类HIV逆转录酶抑制剂有3个：奈韦拉平（nevirapine）、地拉韦定（delavirdine）和依非韦伦（efavirenz）；复方制剂有4个：combivir（齐多夫定300mg+拉米夫定150mg）、trizivir（齐多夫定300mg+拉米夫定150mg+阿巴卡韦300vmg）、Epzicom（拉米夫定300mg+阿巴卡韦600vmg）和Truvada（恩曲他滨200mg+替诺福韦酯300mg）。目前对现有的HIV逆转录酶抑制剂研究其纳米载药、释药系统的品种有齐多夫定、司他夫定、去羟肌苷和扎西他滨等4种药物，拉米夫定的纳米载药、释药系统主要是研究其肝靶向性，用于治疗乙型病毒性肝炎，将在抗肝炎病毒药论述。1、齐多夫定（zidovudine、AZT）(1) 一般特性 AZT为白色或谈黄色结晶，在25水中溶解度为20.1mg/ml；能选择性抑制HIV逆转录酶，阻断病毒DNA链的延伸而不干扰宿主细胞聚合酶；在细胞内抗HIV-病毒病变的半数抑制浓度(ID50)为0.013g/ml，抗HIV-为0.015g/ml。AZT的口服生物利用度约65，食物对AUC可降低50%以上。成人口服200mg，达峰时间（tmax）为0.51.5小时，血药浓度峰值（Cmax）为2.355.50g/ml。在体内分布广泛，稳态分布容积（Vd）为1.6L/kg，血浆蛋白结合率为3438，易通过血脑屏障，脑脊液与血清药浓比值为0.6，唾液内药浓为血浓的67，乳汁药浓接近血药浓度；AZT吸收迅速，可通过胎盘分布至胎儿组织。口服给药半衰期(t1/2) 约1.1小时，进入细胞后经胸苷激酶磷酸化为活性成分三磷酸齐多夫定的t1/2为3小时；AZT主要由肝细胞代谢，生成无活性吡喃葡糖胸苷代谢物，经肾脏排泄；另有少量3氨基代谢物有细胞毒性，约18以原形药经肾。主要的不良反应为骨髓抑制，使中性粒细胞减少及贫血。(2) 研究概况美国FDA于1987年3月首次批准用于CD4细胞计数低于200mm3的成人晚期艾滋病综合症（ARC）和AIDS患者，口服200mg，一日6次；其后扩大适应症用于CD4细胞计数低于500mm3的成人及12岁以下儿童HIV感染者和.预防HIV阳性孕妇母婴垂直传播。成人口服200mg，一日3次；3个月至12岁儿童，按体表面积算，口服90180mg/m2；孕期14周以上的孕妇口服100mg，一日5次，分娩时改用静脉滴注2mg/kg，一小时滴完后剂量减半，直至脐带结扎；新生儿分4次口服糖浆2mg/kg，至出生后6周。国外批准的制剂有胶囊、片剂、静脉注射剂及糖浆剂；我国2003年批准生产原料药及上述4种制剂以及我国自行研制的静脉注射冻干粉针剂，也批准英国和加拿大进口胶囊剂。(3) 聚合物载齐多夫定纳米粒子Dembri7等用乳化聚合法制备3H标记的齐多夫定聚氰基丙烯酸异己酯纳米粒(AZT-PIHCA-NPs),并研究其对大鼠胃肠道和相关淋巴组织的靶向作用，3HAZT-PIHCA-NPs平均粒径25020nm，载药量8，包封率50，电位-235mV。此纳米粒在体外释药速度取决于介质含生物酶的性质和数量。在水中和含胃蛋白酶的胃液中快速释出35AZT，其后平缓释放，8小时后累计释出40AZT；而在胰酶的介质中快速释出60AZT，其后8小时累计释出80AZT，这与胰酶中含有酯水解酶，使聚合物发生降解有关。大鼠分别给予胶体状纳米混悬液和AZT水溶液0.25mg/100kg（1.4微居里），30及90分钟后，AZT水溶液被迅速吸收并从尿液排泄，而纳米混悬液在胃肠道中有较长的滞留时间，其AZT的含量分别为给药量的67及64，比AZT水溶液的15和11高出4.45.9倍，两组药物在血液和、肝、脾、肺、肾等其它器官的AZT含量不足5；测量两组药物在各个组织的放射性浓度，胃和肠道放射性浓度最高，在30分钟时，分别是水溶液的4和28倍；在90分钟时分别是水溶液的5.5和5.3倍。Lobenberg等8-10用乳化聚合法制备14C标记的齐多夫定聚氰基丙烯酸正己酯纳米粒(AZT-PHCA-NPs)，平均粒径23020nm，载药量为4855，电位-51.63mV。纳米粒用聚山梨酯80包裹，对电位无明显影响。大鼠分别灌胃或尾静脉注射，一次给予AZT纳米粒溶液或AZT对照溶液3.3mg/kg，灌胃给药组的血药浓度曲线如图3-2所示，前30分钟AZT对照组14C-AZT浓度达到最高值，并高于纳米粒组，而在60分钟后，纳米粒组在血中的14C-AZT浓度均高于对照组。除骨髓和淋巴结之外，其它器官14C-AZT浓度有类似结果和趋势；由于纳米粒对胃有生物黏附性，使AZT延迟释放的；但纳米粒的14C-AZT在肝脏的AUC比对照组高30，有助于改善生物利用度；静脉注射纳米粒给药组在肝脏的14C-AZT浓度是对照溶液的2.518倍，AUC增加5.5倍，差距随时间的延长而增大，脾脏和肺部有类似的结果，纳米粒组在骨髓及淋巴组织中的药物浓度也比对照组高，但变化趋势不同。AZT纳米粒注射5分钟后，RES组织中富集23药物，对照组仅9；8小时后，60AZT靶向RES组织，对照组仅12，表明纳米粒载药系统有良好的被动靶向性。对照组有94.00.7 AZT经肾脏排泄，纳米粒组71.05.6经肾脏排泄，另有28.05.85经粪便排泄。用聚山梨醇80修饰载AZT的纳米粒，静脉注射给药后15及60分钟，AZT的浓度较未修饰的纳米粒升高；1小时后,肝脏对药物的摄取量较未修饰的纳米粒显著降低。脑中AZT摄取量明显增加，药物浓度比未修饰的纳米粒高出35，较对照组高出45，有显著性差异，表明载药纳米粒可增大AZT对血脑屏障的穿透力。用AZT纳米粒给大鼠灌胃10，与AZT水溶液比较，AUC升高20，血药浓度达峰时间（tpeak）为1小时，而AZT水溶液组为30分钟；纳米粒在肝脏的分布与对照组比较也有显著性差异，AUC较水溶液组高30；其它RES也比对照组高，但无统计学差异；脑中AZT的药浓比对照组高33。口服AZT溶液，96.02.8经肾脏排泄，纳米粒组有62.03.7由粪便排出，可能体内对纳米载药系统中的药物吸收不完全，或改变排泄途径。AZT结合到纳米粒子后能选择性被富含巨噬细胞的器官所吸收，而巨噬细胞是HIV感染过程最重要的靶细胞之一，将抗HIV药物制成纳米载药制剂有利于提高抗HIV的疗效。图3-2大鼠灌胃给予AZT纳米粒溶液或AZT对照溶液的血浓曲线(4) 可降解聚合物载齐多夫定纳米球Callender等11将AZT包封于50：50聚乙交酯-丙交脂共聚物poly(lactide-co-glycolide)纳米球中，比较家兔灌胃及胃肠外给药的药代动力学特性。纳米球呈白色粉未状，载药量为19.4。将其悬浮于生理盐水中，按10mg/kg剂量灌胃或静脉注射给药。静注后10分钟，血药浓度峰值为4.4mol（3.7-5.7mol），迅速从血中消除，平均t1/2为1.2小时，清除率（C L）为6.1L/h（3.7-7.3 L/h），平均分布容积(Vss)为7.3 L/kg（5.4-8.4 L/kg）；灌胃给予常规AZT糖浆剂，吸收迅速，一小时后达到血药浓度峰值, 6小时后血药浓度1M，24小时0.1M；而给予添加黏附剂的纳米球悬浮液有缓释作用，能维持较高的血药浓度及增加口服生物利用度，其它药代动力学参数如表3-3所示。表3-3新西兰白兔静注及口服AZT微球混悬液与常规AZT糖浆药代动力学参数比较剂 型给药途径剂 量AUC(molh)生物利用度F（）Cmax（M）纳米球生理盐水悬浮注射液i.v.10mg/kg6.8（5.1-10.0）/常规AZT糖浆剂p.o.10mg/kg6.6（4.7-9.6）973.6（2.0-4.8）纳米球悬浮液加黏附剂辅料p.o.10mg/kg5.7（3.5-9.1）842.6（1.5-3.4）纳米球悬浮液加黏附剂辅料p.o.50mg/kg25.6（14-32）764.7（2.8-6.6）纳米球悬浮液不加黏附剂辅料p.o.50mg/kg18.5（11-26）554.8（3.3-6.3） (5) 载齐多夫定固体纳米脂质体Hashem12等用高压乳匀法将不同比例的三月桂酸甘油酯(TL)和磷脂(PL)制成SLN的核粒，加入表面活性剂二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）或DPPC与二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱甘油（DMPG）的混合物，使SLN成中性或带负电荷，再将齐多夫定棕榈酸酯前药（AZT-P）吸附于SLN，得到载药固体纳米脂质体(AZT-P-SLN)，AZT-P-SLN的包封率达90；带负电荷的AZT-P-SLN的载药量高于中性AZT-P-SLN，磷脂的用量对载药量有较大影响,如图3-3所示。而齐多夫定在中性或带电荷固体脂质体（AZT-SLN）的包封率不到1.0。脂质和表面活性剂的比例对AZT-P-SLN的粒径和载药量影响不大，增加表面活性剂的比例对电位有一定的的影响，脂质和表面活性剂的比例对AZT-P-SLN的粒径、载药量和电位影响如表3-2所示。选用适宜的稳定剂，经高压灭菌、冷冻干燥后再重新水化分散，AZT-P-SLN的粒径、电位和药物的包封率无明显变化。图3-3磷脂的用量和SLN的电荷对AZT-P的载药量的影响注：SLN用200ngTL制成SLNs核，中性SLN用DPPC，负电荷SLN用DPPC：DMPG为95：5作表面活性剂处理表3-2脂质和表面活性剂的比例对AZT-P-SLN的粒径、载药量和电位影响PL与DPPC/ DMPG克分子比粒径（nm）电位（mV）AZT-P的载药量（）95/529432-15431790/1020129-27431880/2028137-39637670/30315-506367注：SLN用200 mg TL和20mg PL制备，数据为三批试验平均值S.D.由60mg PL和200 mg TL制成载AZT-P和不载药的SLN形态呈乳白色球状颗粒，TL核外壳包裹着3-4层双层PL，厚度约25nm，载AZT-P的SLN不改变物理结构，其冻干切片电镜扫描如图3.4所示。 图3-4（a）载带负电荷AZT-P-SLN电镜扫描图 图3-4(b) 带负电荷SLNs电镜扫描图Hashem13等的另一项研究将上述带负电荷的SLNs用二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-N-（聚乙二醇）2000（PE-PEG）包裹，考察其在50牛血请培养液的稳定性；并将SLN与3H-AZT-P结合，研究其在小鼠体内的生物分布。结果表明SLN用PE-PEG包裹不影响AZT-P的载药量，两者均为982；SLNs分散在Hepes缓冲液和牛血请培养液中，对粒径也无明显变化，均在152-183nm26-48nm，但电位有明显下降，从-22mV，下降至-5mV; 载AZT-P的SLN及SLN- PE-PEG在不同介质中物理稳定性良好，均未观察到颗粒凝聚现象。在37的Hepes缓冲液中，反相透析实验表明，磷脂的相变导致不同的体外释药特征。大鼠尾静脉注射AZT-PHCA-NPs，药物从血液消除呈二室模型，并降低在肾脏的排泄，增加在肝脏的分布，表明AZT-P-SLN可增加药物对PES的靶向性，减弱巨噬细胞对纳米载药系统的快速摄取，提高血液中药物的浓度。CD-1小鼠外侧尾静脉注射02 ml AZT-P、AZT-P-SLN和AZT-P-SLN-PE-PEG，SLN和SLN-PE-PEG在血液中AZT-P的放射性强度均大于AZT-P对照组。其血药浓度曲线及在各个组织的分布如图3-5及图3-6所示。图3-5小鼠尾静脉注射AZT-P、AZT-P-SLN及AZT-P-SLN-PE-PEG的血药浓度曲线注：SLN、SLN-PE-PEG均为载AZT-P，数据为三批试验平均值S.D图3-6小鼠尾静脉注射AZT-P、AZT-P-SLN及AZT-P-SLN-PE-PEG在各个组织药物浓度分布注：SLN、SLN-PE-PEG均为载AZT-P，数据为三批试验平均值S.D.三种制剂的AZT-P从血液中消除呈二室模型，多数通过肾脏的排泄，极少量药物与血请蛋白结合，注射后一小时，对照组有42AZT-P从尿液排出，而AZT-P-SLN及AZT-P-SLN-PE-PEG肾脏的排泄明显减缓，但在肝脏的分布高于AZT-P对照组，AZT-P-SLN-PE-PEG的AZT-P的浓度最高，比对照组高6倍，表明AZT-P-SLN-PE-PEG增加了药物对PES的靶向性。(6) 载齐多夫定抗坏血酸棕榈酸酯脂质体（aspasomes）纳米囊 Gopinath等14制备AZT的抗坏血酸棕榈酸酯（ASP）脂质体（aspasomes）纳米囊，并研究其在体外释药性能。纯抗坏血酸棕榈酸酯脂质体薄膜水化后不能生成纳米囊泡，加入胆固醇（CHOL）可生成纳米囊泡，但极不稳定，只有与带负电荷磷酸双-十六烷基酯(DCP)结合后，经超声水化，才能得到稳定的载AZT双分子层脂质体纳米囊泡。胆固醇的含量为18-72所得的纳米囊泡呈球状，绝大数为多层结构，极少量为单层较大的囊泡。加入不同比例的ASP、CHOL和DCP ，对纳米囊的粒径、电位和AZT的包封率的影响如表3-3所示，ASP：CHOL：DCP的克分子比为45：45：10所得aspasomes脂质体载AZT纳米囊形态显微图如图3-7所示。aspasomes脂质体载AZT纳米囊在体外有缓释作用，双分子层结构中所含胆固醇的比例对AZT的释放速度有一定的影响，含量为45的AZT纳米囊释放速度最慢，但胆固醇含量与释放速度并不形成线性关系。离体大鼠透皮试验比较AZT水溶液、AZT-ASP分散液和aspasomes脂质体载AZT纳米囊溶液的透皮率，结果表明aspasomes脂质体载AZT纳米囊溶液的透皮率最高，其次是AZT-ASP分散液，AZT水溶液最低，三种溶液在各个时间点的透皮率比较有统计学差异。兼有抗氧化作用和透皮性能的aspasomes脂质体载药纳米囊有待进一步研究，是否能用于透皮释药制剂。图3-7AZT aspasomes纳米囊显微图（1500）注：ASP：CHOL：DCP （45：45：10mol）未经超声乳化表3-3 aspasomes组分对纳米囊的大小、电位和AZT的包封率的影响组成（mol）ASP：CHOL：DCP粒径（nm）(平均值S.D)电位（mV）(平均值S.D)包封率(平均值S.D)72:18:10467.917.5-42.90.523.902.3054:36:10940.818.2-45.91.326.321.5645:45:10341.65.1-64.92.930.582.7236:54:10350.76.3-57.70.929.271.9127:63:10327.214.3-60.32.319.102.6618:72:101363.621.6-76.32.617.993.052、 司他夫定（stavudine、d4T）(1) 一般特性与研究概况司他夫定为白色或类白色结晶，在25水中溶解度为8.3mg/ml。体外试验，在不同细胞培养内，抑制HIV-1及HIV-2的IC50为0.0094.1mol/L。d4T口服吸收迅速，能越过血脑屏障，生物利用度为86。抗HIV的作用机制与AZT相同，其活性代谢物d4T三磷酸能竞争性抑制HIV逆转录酶，,终止病毒DNA链的延伸；d4T也抑制细胞DNA聚合酶及，并明显降低线粒体DNA的合成。主要不良反应为复发性外周神经炎，发生率与剂量有关，并使肝转氨酶轻度上升。1994年6月美国FDA首次批准单用或与其他抗HIV药联用，治疗AIDS和HIV感染者，2003年8月欧盟专利药品评审委员会批准扩大适应证，可用于3岁以下HIV感染患儿的治疗。制剂有胶囊、口服液2种剂型。我国有4家企业获准生产原料药和胶囊、片剂及口服液等3种制剂，也批准美国BMS公司进口胶囊剂。（2）聚合物载司他夫定纳米粒Yung-Chih Kuo 15用乳化催化法合成聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒（PBCA-NPs）及用游离基催化聚合法制备甲基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸磺基丙酯共聚物的纳米粒（MMA-SPM-NPs），再将d4T吸附于聚合物纳米粒的表面，经冷冻干燥获得载药纳米粒。聚合反应的搅拌速率、介质的PH值、反应时间和单体的浓度等对聚合物纳米粒的粒径有较大影响。0.1（v/v）BCA单体加0.1dextran7000作稳定剂，以750rpm转速，25反应3.5小时，PBCA-NPs的平均粒径为114.2nm，聚合物多分散性系数为0103。0.05SPM（w/v）与MMA（v/v）加入0.33（w/v）过硫酸氨，以400rpm转速，78反应24小时，MMA-SPM-NPs的平均粒径为65.4nm，聚合物多分散性系数为0105。延长反应时间，加大搅拌转速，这2种聚合物纳米粒的平均粒径增大，PH值为2.12.3，PBCA-NPs平均粒径最小，而MMA-SPM-NPs平均粒径增大。d4T吸附于上述2种纳米载体的粒径和载药量与反应过程和存储条件密切相关，经冷冻干燥，d4T载药量升高，而在4存放6周后，载药量轻微下降，在PH值7.2范围内，d4T载药量最高，MMA-SPM-NPs为73，高于PBCA-NPs的5.7。d4T-MMA-SPM-NPs载药纳米粒适合口服给药，而PBCA-NPs载药纳米粒较适合于静脉给药，这2种纳米载药系统可使d4T穿过脑微血管表皮细胞，有利于持久越过血脑屏障，进一的研究正在进行中。（3）司他夫定缓释微球 阿布拉默维茨等16用微晶纤维素作成球剂，硬脂酸镁作稳定剂，采用挤出-成球技术制备司他夫定缓释微球，并包覆聚甲基丙烯酸甲酯密封涂层，缓释微球呈乳白色。粒径800nn，载药量为33-67。此微球4小时的释药量约40，其余在12-20小时释放；装入明胶硬胶囊，100mg/粒，一日1次，其生物利用度相当于常规胶囊，一次40mg，一日服2次。此技术也可用于制备其他抗HIV药物，如去羟肌苷或茚地那韦等，在中国申请专利已获授权。3、去羟肌苷（Didanosine、ddI）(1) 一般特性与研究概况去羟肌苷为白色结晶粉末，在25水中的溶解度为27.3mg/ml；体外抑制HIV-1及HIV-2活性相似，在外周淋巴细部培养内IC50为2.510.0mol/L，在单核/巨噬细胞培养内IC50为0.010.1mol/L。ddI对酸不稳定，制剂需添加枸橼酸钠作缓冲剂，片剂的生物利用度为36，粉剂水溶液为1116，食物可降低55生物利用度，故需在餐前或餐后服药。口服125mg375mg，一日2次，Cmax为0.252.79mg/L，AUC为1.253.9mg/Lh，t1/2为1.6小时，蛋白结合率小于5，3060以原型药从肾脏排出。1991年10月美国FDA批准口服液（10mg）、可咀嚼、可分散的片剂（25mg、50mg、100mg、150mg和200mg）上市，2000年10月又批准缓释胶囊（125mg、200mg、250mg和400mg）上市。成人体重60kg，口服片剂200mg，一日2次，或肠溶胶囊400mg，一日1次。体重60kg，口服片剂125mg，一日2次，或肠溶胶囊250mg，一日1次。我国已能生产原料药及分散片、咀嚼片、肠溶胶囊、颗粒剂和散剂等5种制剂。(2) 去羟肌苷前药药质体艾萍等17用溶剂注入法制备了去羟肌苷的两亲性胆固醇基琥珀酰基前药的药质体（CS-ddI），并研究其在大鼠体内药动学，CS-ddI不加表面活性物质泊洛沙姆P188的平均粒径为12115nm，加P188的平均粒径为200nm；在透射电子显微镜（TEM）下观察，其形态呈球状，随着CS-ddI浓度增大，变成带状（管状），除去有机溶剂后，带状粒子断裂为棒状（见图3-8）。大鼠尾静脉注射CS-ddI 40 mg/kg，很快从血浆中消除，分布到单核-巨噬细胞系统，分布相半衰期（t1/2）为7.642.69min，消除相半衰期（t1/2）为26130.412min，AUC为9.7883393mg/Lmin，清除率（CL）为0.960.29mL/min，分布容积（V）为9.740.57 mL。CS-ddI对肝脏有显著的靶相性，进入细胞后，在酯酶的作用下降解为原型药，发挥抗HIV作用，CS-ddI在靶组织中清除较缓慢，t1/2长达10天，而心、肾和脑等组织无药物分布，肺脏在注射后7天也低于检测限量。图3-8去羟肌苷前药药质体透射电子显微镜图4、扎西他滨（Zalcitabine、ddC）(1) 一般特性与研究概况扎西他滨为白色或类白色结晶粉未，25在水中溶解度为76.1mg/ml；体外抗HIV活性较强，在不同细胞培养内，抑制HIV实验株及临床分离株的IC50及IC90分别为0.030.50mol/L及0.11.0mol/L。ddC口服生物利用度约85，抗HIV的作用机制与AZT相同，其活性代谢物三磷酸ddC能竞争性抑制HIV,终止DNA链的延伸，但细胞毒性比AZT大10倍，主要的不良反应为复发性外周神经炎，发生频率与剂量有关，停药后可恢复。1992年8月在美国FDA首次批准与其他抗HIV药联用，治疗AIDS和HIV感染者，批准的制剂只有片剂一种剂型。推荐剂量为口服0.75mg，一日3次。此品种尚未批准进口，我国正在研制，已申报临床试验。 (2) 聚合物载扎西他滨纳米粒Bender等18用乳化聚合法合成ddC聚氰基丙烯酸正己酯纳米粒(ddC-PHCA-NPs)，并研究其在细胞培养液中对HIV的抑制作用。ddC-PHCA-NPs的平均粒径为200nm，多分散性系数为0.22。在人单核细胞/巨噬细胞（Mo/Mac）培养液中，HIV感染细胞之前24小时加入ddC-PHCA-NP制成的乳剂和ddC水溶液，培养17天后，细胞培养基的上请液可检测到HIV抗原产生，表明HIV恢复复制，经计算，IC50为11780nMol/L，而未包裹的ddC溶液IC50为91.548nMol/L，作者此项研究表明，聚氰基丙烯酸正己酯扎西他滨纳米粒载药系统并未显示出明显的优越性。3.3.2 抗HIV蛋白酶抑制药HIV蛋白酶是由两个99个氨基酸单体组成的二聚体，属天冬胺酰蛋白酶类。HIV基因组中gag和gag/pol基因各编码一个多蛋白前体（p55及p160），均需病毒蛋白酶进行酶解，加工为成熟的结构蛋白和功能蛋白，在HIV复制周期中起关键作用，HIV蛋白酶一旦受到抑制，可防止病毒前体多肽裂解为蛋白酶，阻止HIV的子代病毒成熟，成为不具有感染性的病毒颗粒。HIV蛋白酶和HIV逆转录酶都是HIV复制必需的酶，也是筛选抗HIV药物重要的体外靶酶模型。已批准上市的抗HIV蛋白酶抑制剂共有9个品种：沙喹那韦（saquinavir）、茚地那韦（indinavir）、利托那韦 ritonavir) 、奈非那韦（nelfinavir、）、氨普那韦（amprenavir）、洛匹那韦（lopinavir）、氨普那韦前药（fosamprenavir）、阿扎那韦（atazanavir）和替拉那韦（tipranavir）；其中洛匹那韦是与利托那韦组成固定处方制剂KaletrasTM供临床使用，内含洛匹那韦133.3mg及利托那韦33.3mg。对现有的HIV蛋白酶抑制剂研究其纳米载药、释药系统的品种有：沙喹那韦、利托那韦、洛匹那韦、茚地那韦、氨普那韦和替拉那韦等6个品种。另有Novartis公司研制的HIV蛋白酶抑制剂CGP-5781319和Merck公司的L-68950220曾分别制备聚乳酸纳米乳或脂质体纳米粒。小鼠尾静脉注射20mg/kg CGP-57813聚乳酸纳米乳，与CGP-57813水液溶对照比较，t1/2从13分钟增加到61分钟，AUC从4.8mol/L增至11mol/L，分布容积也从1.7L/kg增加到3.6 L/kg，表明纳米乳有缓释作用；L-689502脂质体纳米粒抑制H9淋巴细胞感染HIV-1的IC90下降2.94.5倍。上述这2种HIV蛋白酶抑制剂经期临床试后,因肝毒性较大，疗效不佳已停止开发。1、沙喹那韦（saquinavir、SQV）(1) 一般特性与研究概况沙喹那韦为白色或类白色结晶粉未，在25水中的溶解度为2.22mg/ml。SQV是羟乙基胺拟肽类衍生物，能竞争性抑制HIV蛋白酶介导的gag和gag/pol多蛋白前体的切割，从而抑制HIV蛋白酶的活性，在外周血淋巴细胞培养内抑制HIV-1和HIV-2的IC50为1.030.0 nmol/L，细胞毒性（TD50）为5100mol/L。1995年12月美国FDA首次批准甲磺酸沙喹那韦硬胶囊（Invirase TM，200mg/粒）用于治疗AIDS和HIV感染者，可单用或与其他抗HIV药联用；其后于1997年11月及2004年12月相继批准软胶囊（FortovaseTM，200mg/粒）和甲磺酸沙喹那韦片剂（Invirase TM，500mg/片）用于上述适应症。甲磺酸盐单次口服600mg，生物利用度仅为4， Tpeak为34小时，Cmax为35.5127.0g/L，多次给药，稳态Tpeak为2小时，Cmax 为242.3g/L，AUC为667.2g/Lh，口服后88由粪便排出，1经肾脏排出；推荐剂量为600mg，一日3次。软胶囊口服生物利用度可提高3倍，推荐剂量为400mg，一日3次。单用沙喹那韦治疗易产生耐药性，现作为高效抗逆转录病度疗法（HAART）药物处方之一，与其他抗HIV药物交替用药。我国正在研制甲磺酸沙奎那韦及胶囊，已批准甲磺酸沙奎那韦胶囊及胶丸剂进口。(2) 沙喹那韦纳米粒Bausch21-22等用超临界溶剂法小批量制备SQV纳米粒子（100nm1000nm），在如图3-9所示的特制的容器中，将SQV溶于加压的二氧化碳和二甲谜溶液中，于25，加入表面修饰剂聚氧乙烯油醇醚（Brij 96TM）或气溶胶（Aerosol OT），通过阀门将高压溶液喷射至另一个高压容器，利用体积变化引起压力差变化所产生的膨胀力，使药物微粉化，其平均粒径为100nm900nm。粒径的分布与起始反应的压力（50200大气压、喷射时间（90180分钟）和表面修饰剂的性质有关。注：1回路侧管，2流速调节泵，3、8耐压容器， 5烧结板9喷射口，7、10调压开关，11流量计，6温度和压力测量仪图3-9 超临界溶剂喷射制备沙喹那韦纳米粒设备图(3) 聚合物载沙喹那韦纳米粒Bender等18用乳化聚合法合成沙喹那韦聚氰基丙烯酸正己酯纳米粒(SQV-PHCA-NPs)，平均粒径475nm，多分散性系数为0.05。在人单核细胞/巨噬（Mo/Ma）细胞培养液急性感染HIV，纳米粒0.1 nMol/L能明显降低HIV抗原滴度，1.0 nmol/L 对HIV复制有抑制作用，其IC50为.0390.23 n mol/L；而沙喹那韦水溶液1.0 nmol/L仅有轻度的抑制，IC50为4.230.15nmol/L。HIV与Mo/Mac细胞培养液共同孵化25天，病毒的复制达到最大值，24小时后HIV抗原为15ng/ml，SQV溶液100nmol/L不能抑制HIV的复制，纳米粒能使HIV抗原滴度下降35。Boudad等23将沙喹那韦包裹于羟丙基-环糊精制成包合物（SQV-HPCD），然后将其吸附于聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒(PIBCA-NPs)或聚氰基丙烯酸异己酯纳米粒(PIHCA-NPs)；SQV环糊精包合物在pH 7及2.0的水溶液中，溶解度分别为15.8mg/mL及9.3mg/mL，比SQV增大400倍及240倍。载SQV的PIBCA-NPs及PIHCA-NPs的粒径为250350nm，SQV-PIBCA-NP及SQV-PIHCA-NP的电位分别为-36.9 mV 及-37.1 mV，而SQV环糊精包合物的2种载药纳米粒略带正电荷，分别为+3.5mV和+15mV；SQV-HP