非典型肺炎病例标本中新型冠状病毒的分离与鉴定.doc

1非典型肺炎病例标本中新型冠状病毒的分离与鉴定祝庆余* 秦鄂德 王翠娥 于曼 司炳银 范宝昌 常国辉 彭文明 杨保安 姜涛 李豫川 邓永强 刘洪 甘永华 摘要摘要 目的目的 对非典型肺炎的病原体进行分离鉴定，为该病的诊断、预防和治疗提供依据。方法方法 采用细胞培养和乳鼠接种法，从非典型肺炎病例标本中分离致病病原体，通过电镜形态学、血清学和动物致病性观察及 RT-PCR 扩增与部分基因序列分析，对分离的病原体进行鉴定。结果结果 成功地从死亡病例尸解的肺组织标本和患者鼻咽拭子标本中采用细胞培养法分离出病原体。通过电镜在病变细胞及其培养上清中观察到大量冠状病毒样颗粒。免疫荧光染色检测非典型肺炎患者血清，表明分离的病毒与此次流行的非典型肺炎密切相关。分离的病毒可对乳鼠致病，并在发病乳鼠的肺组织标本中通过电镜同样观察到冠状病毒样颗粒。从非典型肺炎病例尸解肺组织、传代发病小鼠肺组织及分离物感染的细胞培养物中，通过 RT-PCR 可分别扩增出冠状病毒的 cDNA 片段，测序结果显示其核苷酸序列与已知冠状病毒的同源性在 60左右。结论结论 从非典型肺炎病例标本中已成功分离出一种新的冠状病毒，它与此次流行的非典型肺炎密切相关，很可能是此次流行的非典型肺炎的主要病原体。 关键词关键词非典型肺炎；病原体；冠状病毒；分离鉴定；序列分析Isolation and identification of a novel coronavirus from patients with SARSZhu Qing-yu, Qin E-de, Wang Cui-E, Yu Man, Si Bing-yin, Fan Bao-Cang, Chang Guo-hui, Peng Wen-ming, Yang Bao-an, Jiang Tao, Li yu-chuan, Deng yong-qiang, Liu Hong, Gan Yong-huaInstitute of Microbiology and Epidemiology, Beijing, China, 100071.Abstract Objective To isolate and identify the microbial pathogen of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS ), thus to lay the foundation for the diagnosis, prevention and treatment of the SARS. Methods Cell Cultures and suckling mice were inoculated by the samples from patients with SARS and autoptical tissues. The isolates were identified by morphology, serology, animal experiment, and RT-PCR amplification and partial sequence analysis. The causative association between the isolates and SARS was determined. Results A possible pathogen of SARS was isolated from the lung tissue of autopsy sample and nasal/throat swabs of the patients with SARS. The isolated microbial agents could cause cytopathic effects on Vero-E6 cells and a large quantity of coronavirus-like particles could be observed in the infected cells and 2supernatants under transmission electron microcope (TEM). Twenty-three of 26 serum samples from patients with SARS were tested positive by immunofluorescence assay, while 31 of the control serum kept all negative, indicating that the isolated virus was clearly associated with current SARS epidemics. The isolated virus was pathogenic to suckling mice, and coronavirus-like particles could also be seen under TEM. cDNA fragments specific to coronavirus could be amplified by RT-PCR from lung tissues of died patients with SARS, lung tissues of infected mice and cell cultures infected by the isolates, and sequence analysis showed that the homology of the amplified cDNA fragments to the previously known coronaviruses was about 60-70%. Conclusion A coronavirus was isolated from the SARS patients. The isolated coronavirus was clearly associated with the current SARS epidemics, and was possibly the key causative agent of SARS. The isolated virus was possibly a noval coronavirus.Key wordsAtypical pneumonia, Pathogen, Coronavirus, Isolation and Identification, Sequence analysis这次流行的非典型肺炎是一种急性呼吸道传染病，国外称其为重症急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS） ，主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播，起病急、传播快，病死率高达 3.5。目前涉及到世界近30 个国家和地区，全球患者已达 2270 多例，且发病人数仍有不断增加的趋势1。非典型肺炎病原的分离和确证，对于该病的临床诊断、治疗及预防至关重要。通过近几个月对非典型肺炎病原体的研究、分析，目前世界上相关实验室的研究目标已集中在副粘液病毒、衣原体样颗粒和冠状病毒等病原体上。本实验室围绕该病病原体的分离和鉴定开展了研究工作，已从广东和北京地区非典型肺炎病例的尸解肺组织和鼻咽拭子等标本中分离到冠状病毒。现将结果报告如下。 材料与方法材料与方法一、材料1标本：肺组织标本 2 份，分别来自广州地区和北京地区“非典型肺炎”死亡病例；鼻咽拭子标本，采自北京地区住院“非典型肺炎”患者。2细胞：Vero-E6、MDCK、Hep -2、Hela、BHK-21 和 LLC-MK-2 等传代3细胞系，均为本所细胞库保存的细胞株。 3培养基： RPIM 1640、DMEM， Gibco/BRL 公司产品；小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司产品；青霉素、链霉素：为华北制药厂产品。 4实验动物：BALB/C 和昆明种小白鼠乳鼠：35 日龄，均为本院实验动物中心繁殖供应。5RT-PCR 和扩增产物纯化试剂、引物：用于 RNA 制备的 RNeasy Mini Kit，购于 QIAGEN 公司；反转录酶 SuperScript II，Taq DNA 聚合酶购自Invitrogen 公司；核酸凝胶回收试剂盒 QIAquick Gel Extraction Kit 购自QIAGEN 公司。引物由北京三博远志生物技术公司合成：2Bp：5-TCA CA(CT) TT(AT) GGA TA(AG) TCC CA-3和 4BM：5-ACT CA(AG) (AT)T(AG) AAT (CT)T(AGTC) AAA TA(CT) GC-3；CV1：5-CAG AGC CAT GCC TAA CAT G-3和CV2：5-AAT GTT TAC GCA GGT AAG CG-3；及 BLF+ 5-TGA TGG GAT GGG ACT ATC CTA AGT GTG A-3，BLF- 5-TTG CAT CAC CAC TAG TTG TGC CAC CAG GTT-3。这三对引物所扩增的片段均位于冠状病毒属聚合酶基因的高保守区2，3。二、方法1标本处理：病人组织标本：取尸解肺组织标本，在预冷的乳钵中研成匀浆，加入适量的病毒稀释液（含 500/ml 青霉素、500ml 链霉素的 1640 培养基，pH 7.0） ， 3000rpm 离心 20min，取上清用于接种细胞培和动物。血液标本：病人血液凝块在预冷的乳钵中研磨成匀浆，加入适量的病毒稀释液，使之研磨成 10-20的悬液，2000rpm 离心 20min，上清液用于接种；鼻咽拭子标本：按1000u/ml 青霉素、1000g/ml 链霉素加入标本中，4过夜，3000rpm 离心30min，上清液用于接种。2病原体分离培养：乳鼠接种法：选择健康的 35 日龄乳鼠，在无菌条件下，用 0.25mL 的微4量注射器脑内接种，每份样品接种一窝（至少只） ，每只乳鼠脑内接种0.02mL，或同时腹腔接种 0.03mL/只。每日观测小鼠的发病情况，一般观察714 天。观察期内若未出现乳鼠发病，将乳鼠解剖取脑、肺组织，研磨成的组织悬液，接种乳鼠，连续盲传代。细胞培养法：将处理好的标本接种于长成单层细胞的 10mL 细胞培养瓶中，每份标本接种两瓶，37吸附h，然后吸出标本液、加含有小牛血清的细胞维持液，置 37 CO2 培养箱培养。每天观察细胞变化，连续观察 10 天。若不出现 CPE 进行盲传，连续盲传代。 3电镜形态观察 电镜负染色检查：收集分离病原体感染的 Vero-E6 细胞培养液，以 6.1% 、pH 7.2 的戊二醛固定液与培养液按 1:1 比例混合固定后，以 3%磷钨酸溶液负染色，透射电镜观察。超微结构检查：取感染乳鼠肺组织、肺组织标本和尸解肺组织标本感染的 Vero-E6 细胞，用 3.1%、 pH 7.2 戊二醛固定，1/15molL, pH7.2 磷酸盐等渗缓冲液洗涤 3 次，1%锇酸固定后，梯度乙醇脱水，Epon812包埋，常规超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色，透射电镜观察。4间接免疫荧光染色分离物感染细胞片的制备：将培养成单层的 VERO-E6 细胞用 Hanks 液洗一次，然后接种分离物细胞培养悬液，放 37孵箱中吸附 1h，加入细胞维持液，1 mL瓶，放 37继续培养。待细胞刚刚出现病变时，取感染细胞滴片，将滴好的玻片放 37 CO2 孵箱中继续培养 8h 使细胞贴壁。取出玻片，放入 0.005M pH7.2 PBS 中漂洗，除去未贴壁的悬浮细胞，凉干。放入冷丙酮内，-20固定30min，凉干，-20密封保存备用。间接免疫荧光抗体染色方法：将病人血清标本 1：10 稀释后，56作用 30min，然后再适当稀释后分别滴加到细胞抗原片上，置 37湿盒中作用 30min（若检测 IgM 抗体则作用 90min） ，冲洗，PBS振荡洗 3 次，凉干。然后加羊抗人 FITC 标记荧光抗体，置 37湿盒中作用30min，冲洗同前，凉干，在荧光显微镜下观察染色结果。 5RT-PCR 扩增待检标本中总 RNA 的制备，按 RNeasy Mini Kit 试剂盒说明书，由非典型肺炎患者的尸解肺组织、感染小鼠肺组织及其肝脾等脏器混合物，以及鼻咽拭5子接种的 Vero E-6 细胞及其培养上清中提取总 RNA。首先进行反转录，在管中加入 5L 总 RNA，1L Superscript II 反转录酶（200u） ，1L 引物 4Bm2（或 CV2,3） ，4l 5反应缓冲液，1L RNA 酶抑制剂和 1L10mM dNTP 以及 2L 0.1M DTT，最后用不含 RNase 的水补足体积至20L。于 42反应 60min 后，95灭活 5min。然后进行 PCR 扩增，反应系统包括：5l 10PCR 反应缓冲液，1L10mM dNTP，2L25mM MgCl2，1L TaqDNA 聚合酶（2.5u） ，上下游引物各 1L（10M） ，用水补足至 50L。用2Bp4Bm、CV1CV2 和 BLF+BLF-引物对分别扩增 40 和 35 个循环。反应完毕，将产物经 1琼脂糖凝胶电泳观察结果。6序列测定、同源性比较和进化树分析：将 RT-PCR 产物纯化后，由军事医学科学院生物工程研究所中心仪器室测序；也可将纯化的片段克隆至 T-easy 载体，筛选阳性克隆测序。所测序列进行Blast 同源性比较，根据 Genbank 登记的目前已知冠状病毒基因序列，使用DNAstar 软件的 MegAlign 模块，采用 Jotun Hein 法进行多株冠状病毒相应序列比较并绘制系统发生树。结结 果果一、病原体分离培养细胞培养分离：选择了Vero-E6、MDCK、Hep-2 、Hela 和BHK-21等5株传代细胞株接种病例标本，进行非典型肺炎病原体分离。利用Vero-E6、MDCK细胞分别从广州地区和北京地区尸解的肺组织及北京地区采集的鼻咽拭子标本中分离出病原体（表1） 。标本接种Vero-E6细胞培养后3天出现明显的细胞病变(CPE)（图1） ，并且能够稳定传代，稳定传7代的分离物已作为毒种保存。在MDCK细胞上也观察到了明显的CPE，但出现的时间较晚，需要5天。用另外3株细胞没能分离出病原体。另外，我们还用Vero-E6分离的病原体接种LLC-MK-2 细胞，在LLC-MK-2 细胞上分离的病原体也能生长，但出现CPE的时间要到接种后7天。目前，我们已分别从广州地区尸解肺组织标本和北京地区的尸解肺组织标本、 尸解淋巴结与肝组织混合标本及鼻咽拭子标本中分离到 4 株病原体。6 2利用乳鼠分离 利用乳鼠进行病原体分离，脑内接种后第一代有乳鼠发病、死亡，但发病不规律。取发病的鼠脑继续传代，目前乳鼠仍能不规律地发病。二、 病原体的电镜形态学观察电镜负染色检查：广州和北京地区尸解肺组织标本接种的 Vero-E6细胞培养液中，负染均查见病毒颗粒，多呈圆形，外周有冠状排列的纤突，病毒直径在 80-120nm 之间（图 2a） ；超微结构检查：在广州 14 号血液标本接种发病的乳鼠肺上皮细胞中查见病毒颗粒，病毒散在分布于细胞浆中，呈圆形，直径多在 90nm 左右(图 2b)。感染病毒的细胞线粒体肿胀，部分线粒体外膜或嵴溶解。在广州地区和北京地区的尸解肺组织标本感染的 Vero-E6细胞中均查见大量的病毒颗粒，多呈圆形，直径在 80nm 左右。病毒颗粒主要分布在胞浆的内质网池、胞浆空泡内和细胞外（图 2c、图 2d） ，多聚集成堆。感染病毒的细胞可见内质网扩张，线粒体肿胀、嵴溶解，细胞核染色质凝聚，边集。 三、患者血液标本的血清学检测为了证实分离的病原体与流行的非典型肺炎的关系，我们将分离的病毒感染 Vero-E6 细胞，制备成感染细胞抗原片，用以检测病人血清中是否存在抗分离的病毒的抗体。从北京和广州地区采集了 26 份临床诊断为非典型肺炎的患者血清，间接免疫荧光染色证明 23 份患者血清标本中存在抗分离的病毒的抗体（图 3） ，而 30 份正常人血清全部阴性。血清抗体阳性率为 88.5，显示分离的病毒与这次流行的非典型肺炎关系密切。四、RT-PCR 扩增与序列分析从广州和北京的两例非典型肺炎病例的尸解肺组织标本中分离的病原体感染的细胞培养物中，用冠状病毒属的简并引物（2Bp4Bm）2 ，通过 RT-PCR扩增可获得一条单一的约 250bp 的 DNA 条带，其大小与预期一致。对该扩增片段核苷酸序列的测定结果表明，其与人冠状病毒 OC43 型同源性为 67，与禽传染性支气管冠状病毒和鼠肺炎冠状病毒的同源性分别为 70和 69。 用另外两对冠状病毒聚合酶基因保守区的引物3，同样从分离的病原体中扩增出与预期大小相同的 DNA 片段，长度分别为 289bp 和 207bp。其中 289bp 片段与冠状病毒科中人冠状病毒的同源性为 53.3%，而与牛冠状病毒同源性为3 34 4767.3%；207bp 片段与人冠状病毒同源性为 53.6%，而与鼠肝炎病毒同源性为60。对其序列测定的结果表明，广州和北京非典型肺炎病例肺组织中分离的病原体的这段序列是相同的，提示两地引起非典型肺炎流行的可能是相同的病毒株。与此同时，采用上述引物直接从两例非典型肺炎尸解肺组织进行 RT-PCR扩增，可同样扩增出预期大小及核苷酸序列完全相同的 DNA 片段。结果表明，我们分离的病原体确实来自尸解肺组织。从北京地区非典型肺炎患者鼻咽拭子接种的 Vero E-6 细胞分离的病原体中，采用上述引物，同样均分别扩增出相应的、大小与序列都相同的 DNA 片段。根据 Genbank 中目前已登记的冠状病毒基因序列，采用 Jotun Hein 法绘制系统发生树图，表明所分离的病毒，无论是与人冠状病毒还是与动物冠状病毒的亲缘关系均较远，其同源性均不超过 70。因此，所分离的病毒可能是一种新的、已发生变异的冠状病毒。讨讨 论论由这次非典型肺炎病例标本中分离到的病原体，从形态学和分子生物学的证据均证明其为冠状病毒。用分离的病毒作为抗原，采用血清学方法，对 26 份临床诊断为非典型肺炎患者血清和 31 份正常人血清的检测发现，患者血清对此病毒的抗体阳性率为 88.5，而正常人血清中无一份检测出相应抗体，提示分离的冠状病毒可能是此次流行的非典型肺炎的主要病原体。由于从北京和广东地区病例标本中分离的冠状病毒，生物学性状及扩增片段核酸序列均相同，提示两地引起非典型肺炎流行的可能是相同的病毒株。但要弄清由致病微生物引起的新传染病的病因，需要微生物学、免疫学、分子生物学、流行病学和临床医学等多学科领域的相关研究、互相印证，是一件复杂而难度和大的工作。因此，最终明确确定这次非典型肺炎的病因还有很多工作要做。 对于导致这次非典型肺炎流行的病原体的确证，我们首先采用 RT-PCR 对所收集的临床标本进行相关病毒病原的检测，先后排除流感病毒 A 和 B、副粘液病毒、呼吸道合胞病毒、肺型汉坦病毒、甲病毒属、黄病毒属和布尼雅病毒8属成员。此后，我们又先后设计合成了 15 对冠状病毒特异引物进行 RT-PCR 扩增，发现其中 3 对引物（含冠状病毒属简并引物） ，可从非典型性肺炎患者尸解肺和传代小鼠肺组织、感染的细胞及其培养上清中扩增出大小一致的片段。由于采用的 3 对冠状病毒特异引物所扩增的 DNA 片段均位于聚合酶基因，并且这些序列间有相互交叉，可将其排列成一个 514bp 的大片段。核酸同源性分析显示，所分离的冠状病毒的这段 514bp 的基因片段与目前已知的人肺炎相关冠状病毒或动物冠状病毒的同源性为 6070。通过绘制系统进化发生树分析，分离的冠状病毒接近冠状病毒抗原组 2 组。该型包括鼠肝炎病毒和牛冠状病毒等。由于冠状病毒基因组为单链 RNA，在该病毒科中不同病毒间易发生异源重组，对我们分离的毒株的进一步遗传学性状分析，尚需进行基因组其它区段的序列比较。从生物学、遗传学和临床数据综合分析表明，这种新分离的冠状病毒并不属于目前已知的两型人冠状病毒的任何一型4。因此，分离的病原体可能是一种新的冠状病毒。对所分离的冠状病毒基因组全序列测定完成之后，将会更清楚地了解与其生物学和遗传特性特，别是导致致病性增强的分子基础的一些重要信息。常见的呼吸道冠状病毒是普通感冒的病原体之一，通常引起的临床症状并不严重，致死率低于 1。而此次流行的非典型肺炎起病急、传染性强，病死率高达 3.5。同时，在病毒的分离培养特性上，以往常见的冠状病毒分离培养较难，在人组织细胞培养中，33生长较好，超过 35生长就受影响。本研究分离的冠状病毒在绿猴肾传代细胞 Vero-E6 上，37生长良好，细胞致病性强、传代稳定。同时，序列测定结果和进化树分析显示，新分离的冠状病毒与已知的冠状病毒三个抗原组都存在一定的差异，与 2 组的关系最近。上述这些差异说明，我们分离的冠状病毒可能是一种新型的冠状病毒。致谢：感谢曹务春、陈德惠研究员对本研究工作的支持与帮助；感谢解放军 309 医院、302 医院、广州军区总医院和第一军医大学提供标本。9参考文献：1WHO, Cumulative number of reported cases (SARS). Available at /csr/ sarscountry / 2003-04-032Poutanen SM, Low DE, Henry B, Finkelstein S, Rose D, Green K, Tellier R, Draker R, Adachi D, Ayers M, Chan AK, Skowronski DM, Salit I,Simor AE, Slutsky AS, Doyle PW, Krajden M, Petric M, Brunham RC , and McGeer AJ. Identification of severe acute respiratory syndrome in Canada. N Engl J Med. Low-1low-11(at on March 31,2003)3Stephensen CB, CaseBolt DB, and Gangopadhyay NN. Phylogenetic analysis of a highly conserved region of the polymerase gene from 11 coronaviruses and development of a consensus polymerase chain reaction assay. Virus Res. 1999, 60: 181-1894Vabret A, Mouthon F, Mourez T, Gouarin S, Petitjean J, and Freymuth F. Direct diagnosis of human respiratory coronaviruses 229E and OC 43 by the polymerase chain reaction. J Virol Methods. 2001,97:59-6610表 1、细胞培养分离病原体结果 标标 本本1 Vero-E6 MDCK Hep -2 Hela BHK-21 1 + + 2 + + 3 + + 11 号为广州地区死者尸解肺组织；2 号为北京地区死者尸解肺组织; 3 号为北京地区患者鼻咽拭子标本。11 图 1a. 正常 Vero-E6 细胞 图 1b. 肺组织标本接种 3 天的 Vero-E6 细胞 12图 2a. 北京地区死亡病例尸解肺组织标本接种 Vero-E6 细胞培养液中的病毒颗粒 负染色 Bar=100nm图 2b. 广州地区 14 号标本感染乳鼠肺组织中的病毒颗粒 超薄切片 Bar=100nm 图 2c. 北京地区死亡病例尸解肺组织标本感染 Vero 细胞中的病毒颗粒 Bar=100nm 图 2d. 广州地区死亡病例尸解肺组织标本感染 Vero 细胞中的病毒颗粒 Bar=200nm C.C.D.D.A.A.B.B.13图 3. 非典型肺炎患者血清与分离的病毒免疫荧光染色反应14 A:5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN