钙蛋白酶10基因多态性与体重和胰岛素抵抗的相关性.doc

钙蛋白酶10基因多态性与体重和胰岛素抵抗的相关性摘要：目的 探讨钙蛋白酶10（CAPN10）基因SNP-19与体重和胰岛素抵抗（IR）的关系。方法：用PCR-RFLP法检测132名非超重肥胖和80名超重肥胖者的CAPN10基因SNP-19的基因型，测定身高、体重、空腹血糖（FPG）、血脂、胰岛素水平（FINS），计算体重指数（BMI）、腰臀比（WHR），用HOMA-IR法评价IR，并进行分析。结果：（1）BMI25kg/m2的个体有较高的FPG、WHR、TG和IR水平（p0.01），CAPN10基因SNP-19的22基因型和等位基因2的频率在BMI25kg/m2的个体明显升高（p0.05）；（2）携带基因型22的个体较基因型为11和12的个体有较高的FINS、BMI和IR水平。结论：CAPN10基因SNP-19基因型22可能与江苏地区人群超重肥胖的的发生有关。 关键词：钙蛋白酶10基因；单核苷酸多态性；体重指数；胰岛素抵抗； Relations among the CAPN10 gene and BMI, HOMA-IRAbstract: Objective: To explore the relations among SNP-19 of Calpain 10 gene and body mass index(BMI), insulin resistance(IR). Methods: Polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism( PCR-RFLP )was used to detected the genotype of site SNP-19 in calpain 10 gene. Fasting plasma glucose(FPG), insulin and IR were also studied. The people being tested include 132 non-overweight and obesity and 80 overweight and obesity. Results: (1) Higher FPG、WHR、TG and IR are found in the individuals with BMI25kg/m2 ,The frequency of 2 allele and 22 genotype of site SNP-19 in the individuals with BMI25kg/m2 was significantly higher than that in the controls with BMI25kg/m2; (p0.05). (2) Higher FINS、BMI and IR were found in the individuals with SNP-19 genotype 22 than those of individuals with genotype 11 and 12(p0.05). Conclusion: Polymorphism of site SNP19 of Calpain10 gene was related with overweight and obesity .There exited insulin resistance among the individuals with genotype 22 of SNP-19,which may be one of the genetic factors contributing to the occurrence of overweight and obesity. Keywords: Calpain 10 gene; Body mass index; Insulin resistance; single nucleotide polymorphism 钙蛋白酶10(CAPN10)基因是第一个被定位克隆的2型糖尿病的易感基因，国内外学者大多致力于其与2型糖尿病关系方面的研究。鉴于2型糖尿病与超重肥胖常伴随发生，且都是多基因遗传病，有共同的发病基础胰岛素抵抗，本文对钙蛋白酶10基因SNP-19位点的多态性与超重肥胖、胰岛素抵抗的关系进行了研究。一. 研究对象与方法1 . 研究对象 随机抽取在江苏大学附属医院体检的健康查体者及门诊就诊的2型糖尿病患者共212例，按照1997年WHO标准体重指数(BMI)25kg/m2为超重及肥胖（80例），BMI25kg/m2为非超重肥胖（132例），所有研究对象均常住江苏。2 . 研究方法2. 1 临床及生化指标测定 所有对象测身高、体重及腰围，计算体重指数(BMI)、腰臀比（WHR）; 取空腹静脉血,采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)、血脂，酶联免疫吸附实验(ELISA)法测空腹胰岛素，稳态模式评估公式计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR=空腹血糖空腹胰岛素/22.5）。2. 2 基因型分析 使用TaKaRa-DNA提取试剂盒（购自宝生物工程大连有限公司）从全血中提取样品DNA,采用 PCR-RFLP法,检测CAPN10基因SNP-19基因型。引物序列为 F 5-CTCTGCCTGCCGAAGTGA-3 R 5-GGGAAAGCCGCTGTTGTT -3 ；PCR反应体系：总反应体积为20l，其中10Buffer 2l，dNTP 1.6 l，Taq聚合酶0.1l，模板DNA 2l，上游引物、下游引物各0.4l，25MmMgcl2 1.6 l。PCR反应条件：94.0预变性1min；94.0变性30s, 61.2退火30s，72.0延伸30s，共35个循环；最后，72.0延伸10min。扩增产物以DNA Marker 1(广州东盛生物科技有限公司)作标准参照，2.5%琼脂糖凝胶电泳后，再置于溴化乙锭液中染色20分钟，最后于紫外线透射仪下观察结果，等位基因1为372bp的片段，等位基因2为404bp的片段，3种基因型谱带见图1。每种带型选2个样本送上海生工生物工程有限公司进行纯化测序, 结果与电泳筛选一致。2. 3 统计方法 采用SPSS11.5软件进行数据统计分析。所有资料先进行正态分布的检验，不成正态分布的变量进行对数变换。计量资料以（s）表示，组间资料比较采用t检验,计数资料采用2检验，用Hardy-Weinberg平衡原理估测样本的群体代表性。二. 结果2.1 两组研究对象临床特征比较 两组年龄和性别分布无差异。超重肥胖组较非超重肥胖的对照组有较高的FPG、BMI、WHR、TG和HOMA-IR水平（p0.01），见表1。2.2 两组研究对象基因型和等位基因分布比较钙蛋白酶10 SNP-19基因型分布为：非超重肥胖组11型15.9%、12型40.9%、22型43.2%，超重肥胖组11型11.3%.、12型27.5%、22型61.3%，超重肥胖组基因型22明显升高，差异有统计学意义(P=0.038)，该组等位基因2频率为75.0%， 亦显著升高（P=0.015)，见表2。2.3 钙蛋白酶10 SNP-19不同基因型临床特征比较 携带基因型11和12的个体临床特征比较无明显差异，因此将之合并为一组与携带基因型22的个体进行比较，发现基因型22个体有较高的FINS、BMI和HOMA-IR水平，见表3。 三. 讨论钙蛋白酶10基因定位于染色体2q37.3，其编码产物钙蛋白酶10是一种非典型的钙蛋白酶，广泛表达于人体胰腺、骨骼肌、脂肪组织和肝脏等多种组织，参与机体多种细胞内过程，如凋亡、缺血、增生等， and obesity in the Japanese general population. Inother racial groups, SNP-19 was also reported toaffect insulin sensitivity in Caucasian with NorthernEuropean ancestry 14. 14 Elbein SC, ChuW, Ren Q, Hemphill C, Schay J, Cox NJ, et al.Role of calpain-10 gene variants in familial type 2 diabetes inCaucasians. J Clin Endocrinol Metab 2002;87:650 4.The mechanism by which SNP-19 in CAPN10affects glucose metabolism remains undeterminedfrom this study.It is possible that SNP-19polymorphism also influences calpain-10 mRNA levelbecause the number of tandem repeats affectstranscription and protein expression levels 16. (1)脂蛋白脂酶(LPL)：脂蛋白脂酶由体内脂肪细胞合成，然后释放到血液中附着在毛细血管的表面。其功能是将与其接触的乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的三酰甘油(甘油三酯)水解成游离脂肪酸和-磷酸甘油。前者进入脂肪细胞内，与磷酸甘油结合生成三酰甘油。由于人类脂肪细胞合成脂肪酸的能力很弱，因此在脂蛋白脂酶作用下所产生的游离脂肪酸就成为体内脂肪细胞合成三酰甘油所需要游离脂肪酸的主要来源。因此脂蛋白脂酶在调节人体局部脂肪沉积上发挥着一定的功能。脂蛋白脂酶的活性受机体营养状况及相关激素的调节，空腹及营养不良时其活性降低，进食后其活性增高。胰岛素可以增加脂蛋白脂酶的合成，而脂解激素则使脂蛋白脂酶活性受到抑制。 (2)胰岛素：胰岛素可以通过降低脂肪细胞内cAMP的浓度来抑制三酰甘油脂肪酶活性，减少三酰甘油的水解，促进水解后的游离脂肪酸再酯化。胰岛素是体内主要的抗脂解激素。当胰岛，素水平下降时，体内脂肪组织的脂解过程加快，血中游离脂肪酸和磷酸甘油浓度增高。在这一系列的水解过程中，催化由甘油三酯水解生成甘油二酯的甘油三酯脂肪酶是脂动员的限速酶，其活性受许多激素的调节称为激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase，HSL)。胰高血糖素、肾上腺素和去甲肾上腺素与脂肪细胞膜受体作用，激活腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP水平升高，进而激活cAMP依赖蛋白激酶，将HSL磷酸化而活化之，促进甘油三酯水解，这些可以促进脂动员的激素称为脂解激素(lipolytic hormones)。胰岛素和前列腺素等与上述激素作用相反，可抑制脂动员，称为抗脂解激素(antilipolytic hormones)(见图5-8)。图5-8激素影响甘油三酯脂肪酶活性的作用机理5 胰岛素抵抗与游离脂肪酸代谢目前研究发现，游离脂肪酸（FFA）的代谢异常在胰岛素抵抗的发病过程中起着非常重要的作用。20世纪80年代Randle at al首先提出了经典的葡萄糖-脂肪酸循环17：血中游离脂肪酸浓度升高，肌肉利用FFA增加，导致肌肉内乙酰辅酶A（coA）及柠檬酸含量增加，乙酰coA可抑制丙酮酸脱氢酶，柠檬酸可抑制磷酸果糖激酶-1，从而降低了葡萄糖的氧化。以后的研究进一步证实了FFA水平升高可抑制胰岛素介导的肌肉及肝脏组织对葡萄糖的摄取，但发生于脂肪灌注4小时后18，机制可能是FFA抑制了葡萄糖的转运和磷酸化以及肌肉糖原合成19。同时FFA可抑制肝脏对胰岛素的清除，这可能由于FFA及FFA的氧化产物增加了肝脏细胞胰岛素受体的内化速率以及降低了受体重循环速率来减少细胞表面受体数量20，导致高胰岛素血症。这种FFA升高导致的胰岛素抵抗在机体缺乏葡萄糖的情况下如饥饿，长时间运动起着重要的作用，这有利于保存葡萄糖以供给中枢神经系统。但在肥胖者，这种作用依然存在，但却造成了有害的作用。其次，体外试验发现FFA升高可促进肝糖异生，主要与FFA氧化产生的ATP和NADH以及乙酰CoA增多使丙酮酸羧化酶活性增高有关，但在体内试验未得到明确的证实，因应用降低血浆中FFA的药物如尼烟酸，阿西莫斯等，可使肝糖生成（HGP）或减少21，或增多22，或不变23。近年来研究认为FFA对胰岛素信号传递通路可能有影响，其导致的胰岛素刺激的葡萄糖代谢下降可能与以下因素有关24：1.胰岛素刺激的胰岛素受体底物-1（IRS-1）相关的磷酸肌醇-3激酶（PI3K）活性下降。2.胰岛素刺激的IRS酪氨酸磷酸化减弱。3.膜结合的有活性的蛋白激酶C-（PKC-）活性的升高。因此综上所述，FFA升高时，组织细胞内长链脂酰coA增加，导致二酰甘油浓度升高，而二酰甘油可能是PKC-的激活剂25，PKC-激活后可诱导肌肉IRS-1与肝脏IRS-2丝氨酸的磷酸化，干扰其酪氨酸磷酸化，导致PI3K活性下降，而PI3K是胰岛素信号传导的重要介质，在胰岛素刺激的葡萄糖转运及糖原合成方面发挥者重要作用。6 胰岛素抵抗与脂蛋白脂酶（LPL）LPL在富含TG的脂蛋白代谢中发挥着关键的作用。现已普遍认为在胰岛素缺乏的状态下，LPL活性下降，但在胰岛素抵抗的状态下LPL活性改变还没有定论。有研究发现胰岛素抵抗越明显，注射肝素后血浆LPL活性及脂肪组织中LPLmRNA水平越低26，而组织中的TG含量则明显升高。目前研究已证实骨骼肌，肝脏及胰腺中TG含量增多与胰岛素抵抗有强相关性。Jason.K等27利用转基因的方法，使得LPL基因在老鼠骨骼肌与肝脏上特异性的表达，结果发现：肌肉及肝脏LPL过度表达可分别导致肌肉与肝脏组织的胰岛素抵抗，其组织中TG含量高出正常对照组3-4倍，并认为LPL过度表达所引起的胰岛素作用缺陷发生于胰岛素信号传导通路上胰岛素受体底物水平（IRS-1，IRS-2）。综上所述，胰岛素抵抗与脂质代谢紊乱具有重要的关系，两者相互影响，相辅相成。严重的脂质代谢紊乱可加重原发病，促进疾病并发症的出现和发展，因此进一步研究两者之间的相互作用，控制胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱，对于糖尿病及相关疾病的治疗意义十分重大。 .4胰岛素的生理效应 1.4.2脂代谢（1）抑制脂肪分解：抑制甘油三酯脂肪酶活性。（2）促进脂肪合成：增强柠檬酸裂合酶活性，促进乙酰CoA由线粒体内向外转移，提供原料。（3）降低血脂：增强脂蛋白脂肪酶的活性，促进分解。二 对脂肪代谢的作用胰岛素既可以促进肝合成脂肪酸，然后转运到脂肪细胞中储存起来，又可使脂肪细胞直接合成脂肪酸。胰岛素还可以促进葡萄糖进入脂肪细胞转化成磷酸甘油，再与脂肪酸形成甘油三酯储存在脂肪细胞中。此外，胰岛素能抑制对激素敏感的脂解酶的活性，故能抑制脂肪的分解。1.1 胰岛素抵抗 IR 是指机体对一定量胰岛素生物学作用低于于预计正常水平，表现为胰岛素的靶器官或靶组织，主要是肝脏、肌肉、脂肪组织对胰岛素敏感性及反应性降低。 2型糖尿病多见于40岁以上的中老年人,大多数病人肥胖或超重,或存在体脂分布异常,例如腹部或内脏脂肪增加肥胖或内脏型肥胖,李光伟认为中国人肥胖的诊断标准以BMI27为宜,BMI2527可视为超重胖但亚洲人的肥胖标准与欧美不同,更倾向于腹型111 临床资料 本文2型糖尿病患者193例,按2000年国际肥胖特别工作组提出的亚洲成年人BMI亚洲人的肥胖标准与欧美不同,更倾向于腹部肥胖或内脏型肥胖1 随BMI的增高而加重脂代谢紊乱的特点以高TG血症为主,同时伴有HDL的降低和轻度的CH升高与文献报道一致132产生高TG血症的主要原因可能是由于肥胖引起IR而导致脂肪和肌肉中的脂蛋白脂酶(LPL)活性降低,极低密度脂蛋白(VLDL)和TG分解受阻21李光伟等.谈中国人肥胖的诊断标准.实用糖尿病杂志 2000;8(3):64.方法： 采用稳态模式胰岛素抵抗指数（） 评价胰岛素抵抗 腹型肥胖者更倾向于导致 的机理 可能与以下几个方面有关： （） 内脏脂肪代谢活跃、转换率高， 内脏脂肪对胰岛素抑制脂肪分解的作用相对抵抗， 而其 肾上腺素能受体与儿茶酚胺的亲和力高， 对脂解作用敏感， 因而内脏脂肪在基础状态和肾上腺素能激发后有更高的脂肪分解率， 所释放的游离脂肪酸大量直接进入门静脉循环， 到达肝脏和其他外周组织， 抑制肝糖原利用， 形成肝胰岛素抵抗，同时使外周组织葡萄糖氧化利用减少， 形成外周胰岛素抵抗； （）腹型肥胖者体内脂肪细胞肥大、增生，组织细胞上胰岛素受体数目减少， 活性减低， 致使对胰岛素敏感性下降； （） 腹型肥胖者体内皮质醇、儿茶酚胺等增加， 具有拮抗胰岛素的作用，。 腹型肥胖者由于存在 ， 细胞为克服 ， 代偿性分泌增多， 常导致高胰岛素血症， 当出现失代偿时， 就会产生糖代谢紊乱， 继而发展为糖耐量低减和糖尿病。腹部肥胖和胰岛素抵抗可能是同一缺陷引发的两个不同方面的表现3 （3 潘长玉,尹士男.胰岛素抵抗-型糠尿病发病机制的重要因素J.中华内分泌代谢杂志,2000,16(1):57）临床流行病学研究表明，2型糖尿病与肥胖常合并存在，2型糖尿病患者有80%肥胖或既往肥胖。1 研究对象与方法1.1 研究对象 按照WHO（1999）诊断标准随机抽取在江苏大学附属医院确诊的、新近发现的、彼此间无亲缘关系的2型糖尿病患者100例，根据腰围（WC）分为两组，男性WC85cm，女性80 cm为肥胖组（B组），共50例（男-例，女-例，年龄-岁），反之为非肥胖组（C组），共50例（男-例，女-例，年龄-岁），正常对照组（A组）100例（男-例，女-例，年龄-岁），为在同一医院体检的非糖尿病和肥胖的健康查体者，所有研究对象均常住江苏。1.2 研究方法1.2.1 临床及生化指标测定 所有对象测身高、体重及腰围，计算体重指数(BMI); 取空腹静脉血,采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)、血脂，酶联免疫吸附实验(ELISA)法测空腹胰岛素，稳态模式评估公式计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR=空腹血糖空腹胰岛素/22.5,评价胰岛素抵抗状态。1.2.2 基因型分析 使用DNA提取试剂盒（购自宝生物工程大连有限公司）从全血中提取样品DNA,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP),检测Calpain10基因SNP-19基因型, 引物序列-,PCR反应体系：总反应体积为20l，其中10Buffer 2l，dNTP 1.6 l，Taq聚合酶0.1l，模板DNA 2l，上游引物、下游引物各0.4l，25MmMgcl2 1.6 l。PCR反应条件：94.0预变性1min；94.0变性30s, 61.2退火30s，72.0延伸30s，共35个循环；最后，72.0延伸10min。扩增产物以DNA Marker 1(