核桃饼粕蛋白最佳酶解条件研究.doc

云南中医学院2014届攻读学士学位本科生毕业论文(设计) 核桃饼粕蛋白酶解工艺的初步研究学 院 中 药 学 院学生姓名 程 祥 云专 业 食品科学与工程实习单位 功能食品教研室导师姓名 赵声兰（教授）二0一四年六月十六号目 录摘 要31.引言32.仪器与试剂42.1 仪器42.2 试剂43.方法43.1 核桃蛋白酶解工艺优化43.1.1 酶解工艺流程43.1.2总蛋白质含量的测定凯氏定氮法原理：方法：53.1.3 酸溶蛋白氮含量的测定：53.1.4 游离氨基酸态氮（AN)的测定甲醛滴定法原理方法64.结果与讨论64.1 核桃蛋白酶解工艺的确定64.1.1单因素分析 超声时间对核桃水解作用的影响 最佳酶的选择 pH对酶解反应的影响 加酶量对酶解反应的影响 酶解温度对酶解反应的影响 酶解时间对酶解反应的影响94.1.2正交实验确定最佳酶解条件105.讨论12致 谢14核桃蛋白酶解工艺的初步研究实习学生：陈 菱（2011级食品科学与工程班)指导教师：赵声兰（教授、云南中医学院）摘 要：目的：研究超声时间对核桃蛋白提取的影响和核桃蛋白酶解的适宜工艺条件，为以后的核桃蛋白多肽的开发利用提供依据。方法：酶解工艺研究采用单因素法和正交实验法，游离氨基酸的测定采用甲醛滴定法，蛋白质的含量测定采用凯氏定氮法。结果：中性蛋白酶水解核桃蛋白的最适反应条件是：温度45，pH为8，加酶量为6500 u/g，底物浓度为1/20，反应时间为2h。结论：与普通提取法相比，超声波提取法对核桃蛋白的溶出率有一定提高，水解度与多肽含量影响不大；酶解法的效果比较明显，酶解法核桃蛋白的溶出率，水解度和多肽含量都有大幅度提升。所以核桃蛋白的水解方法以酶解法较好。关键词：酶解工艺；优化;核桃饼粕蛋白；多肽；游离氨基酸。 1.引言 核桃又名胡桃，羌桃，万岁子，系胡桃科核桃属植物，其使用部位为果实的仁，它与扁桃、腰果、榛子并列为世界四大干果。中国是世界上核桃产量最高的国家，2000年核桃栽培年产量达26万t1.核桃仁含有丰富的蛋白质，不饱和脂肪酸，维生素E和微量元素等，现代医学证明，核桃对各种不同年龄的人均有不同的医疗保健作用，因此，核桃是一种对人体有补气养血，温肠补肾，润肺止咳，乌发健脑作用的优良干果仁食物。核桃仁中的主要营养物质分为脂肪和蛋白质，8种人体必需脂肪酸构成合理，其中异亮氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸接近或超过WHO/FAO规定的氨基酸类人体必须量的标准值2-4。近来来科学研究发现，人类摄取蛋白质经消化酶作用后，并非主要以氨基酸形式吸收，而是以肽的形式吸收5。某些低肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，同时具有防病治病、调节人体机能等多种生理功能，有些原蛋白质或其组成氨基酸所没有的独特的生理机能，但水解为多肽后会具有活性，这也是生物活性肽引起当今食品学界广泛重视的重要原因。特别是活性肽的组成氨基酸并不一定是必需氨基酸，这就为人类更为充分利用蛋白质资源，尤其是那些原本认为生物价不高的蛋白质资源生产能更好满足人类健康需要的基料，提供了新的机遇6。目前国内对核桃蛋白质的研究很多，但是对多肽的进一步研究是少之又少。本文综合考虑蛋白质溶出率，水解度和多肽含量三个指标，研究核桃蛋白质的降解工艺，为核桃的进一步开发利用奠定基础。2.仪器与试剂2.1 仪器 电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司），电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），雷磁pHS-3C型pH计（上海精密科学仪器有限公司），KDY-12型消化炉（北京强盛分析仪器制造中心凯氏定氮仪），QSY系列凯氏定氮仪 （北京强盛分析仪器制造中心凯氏定氮仪），L-550型低速台式离心机（长沙湘仪离心机仪器系统有限公司），电热恒温水浴锅 （上海医疗器械五厂），超声仪（SK3300LH,上海科导超声仪器有限公司）79-2磁力加热搅拌器（常州国华电器有限公司），电烘箱（上海实验仪器厂有限公司）。2.2 试剂 硫酸（汕头市达濠区精细化学品有限公司），硫酸钾（北京化工厂），硫酸铜（成都化学试剂厂），硼酸（上海试剂四赫维化工有限公司），甲醛溶液（天津市致远化学试剂有限公司），30%过氧化氢（天津市申泰化学试剂有限公司），三氯乙酸（国药集团化学试剂有限公司），氢氧化钠（天津致远化学试剂有限公司），无水碳酸钠（上海虹光化工厂），以上试剂均为分析纯。试验中所用水均为纯净水。 甲基红（天津市化学试剂六厂三分厂），溴甲酚绿指示剂(上海试剂总厂第三分厂），酚酞指示剂（天津化学试剂厂），工作基准剂邻苯二甲酸氢钾（中国医药集团上海化学试剂公司）。 中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶均为5万u/g，纤维素酶为1500u/g。3 方法3.1 核桃蛋白酶解工艺优化3.1.1 酶解工艺流程7 核桃仁 去皮（碱液去皮法8） 磨浆 调pH 酶解 灭酶 （3mol/L柠檬酸，调pH4.04.5) 离心（3500r/min,20min） 除去沉淀与乳化层 清液。3.1.2 分析方法9核桃蛋白质溶出率液相中蛋白质的质量 多肽含量=（酸溶蛋白质含量-游离氨基酸含量）.1总蛋白质含量的测定凯氏定氮法10-.1原理：样品加入浓硫酸消化，其中的氮素与硫酸反应生成硫酸铵，加碱蒸馏，用硼酸溶液吸收蒸馏出的氨气，硫酸滴定蒸馏中得到的硼酸铵。根据硫酸的消耗量计算待测样品的蛋白质含量。化学反应试如下：2NH2(CH2)2COOH + 13H2SO4 (NH4)2SO4 +6CO2 + 12SO2 + 16H2O (NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4 2NH3 + 4H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5H2O (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O (NH4)2SO44H3BO4 .2步骤：取10ml清夜于洁净消化管中，加入0.10g硫酸铜，0.50g硫酸钾和10ml浓硫酸，于消化炉上消化至样液澄清透亮，取出，自然冷却，于凯氏定氮仪上蒸馏，用0.05mol/L的硫酸溶液滴定至终点，据硫酸标准溶液的消耗量，计算蛋白质含量。 计算公式：X为样品中蛋白质的含量; V1为样品消耗盐酸标准液的体积;C 为盐酸标准液的浓度; V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积;MN为氮的摩尔质量，14; W为样品的质量;K为氮换算为蛋白质的系数，6.25。 酸溶蛋白氮含量的测定：取清夜10ml，加入10%TCA（三氯乙酸）溶液10ml，混合均匀，静置3分钟。立即用滤纸过滤，直到滤液完全透明。取10ml滤液测定蛋白氮的含量，乘以2即为原液酸溶蛋白氮的含量。 游离氨基酸态氮（AN)的测定甲醛滴定法.1原理：氨基酸为两性电解质。在接近中性的水溶液中，全部解离为双极离子。当甲醛溶液加入后，与中性的氨基酸中的非解离型氨基反应，生成单羟甲基和二羟甲基诱导体，此反应完全定量进行。此时放出氢离子可用标准碱液滴定，根据碱液的消耗量，计算出氨基态氮的含量。.2步骤：（1）将酸度计接通电源，预热30min后，用pH6.86的 缓冲溶液矫正pH计。（2）吸取试样10ml于烧杯中，加5滴30%过氧化氢，将烧杯置于电磁搅拌器上，电极插入烧杯内试样中适当位置。如需要加适量蒸馏水。（3）开动磁力搅拌器，先用0.1mol/L氢氧化钠溶液慢慢中和试样中的有机酸。当pH达到7.5左右时，再用0.05mol/L氢氧化钠溶液调至pH8.1，并保持1min不变。然后慢慢加入10ml的中性甲醛溶液，1min后用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH8.1。记录消耗0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。（4）测定结果表示如下公式：C氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L;V1加入中性甲醛溶液后，消耗的氢氧化钠标准滴定溶液的体积，ml;V210ml空白所消耗的氢氧化钠标准滴定溶液的体积，ml；m样品的质量，g;141ml1N氢氧化钠标准滴定溶液相当于氮的毫克数。4.结果与讨论4.1 核桃蛋白酶解工艺的确定4.1.1单因素分析 其他固定条件不变，逐一改变pH，加酶量，温度，酶解时间这几个酶解参数进行试验，绘制出相应的酶解反应曲线。 超声时间对核桃水解作用的影响 以水解度和蛋白质溶出率为指标，超声不同时间后，在55下水解2h，研究不同超声时间对核桃蛋白质水解作用的影响，实验结果如图1。由图1可知，随着超声时间增长，蛋白质溶出率逐渐增大，但当超生时间到45min后，溶出率增加很缓慢。超声时间的长短对水解度影响不大，都很低。 酶的选择 以水解度，蛋白质溶出率与多肽含量为指标，研究中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶、碱性蛋白酶在加酶量为1500u/g,酶解时间为1h,温度为40，自然pH条件下对核桃蛋白酶解作用，实验结果如图2 由图2可知，四种酶对核桃蛋白水解能力有较大差别，综合溶出率，水解度和多肽含量三个指标，选择中性蛋白酶为以下实验用酶。 pH对酶解反应的影响 在底物浓度为1/20，加酶量为5200u/g ,酶解时间为1h , 温度为40的条件下，研究不同pH条件下中性蛋白酶对核桃酶解作用的影响，实验结果如图3： 由图3可知，当pH9时，随着pH增大，水解度与溶出率逐渐增大；但当pH9时，溶出率与水解度呈下降趋势，所以pH为9时为最适pH值。加酶量对酶解反应的影响 在底物浓度为1/20,pH值为9.0,酶解时间为1h , 温度为40的条件下，研究不同加酶量对核桃酶解反应的影响，实验结果如图4. 由图4可知，当底物浓度保持不变时，随着加酶量的增加，核桃蛋白的溶出率，水解读和多肽含量三个指标均逐渐提高，但当加酶量超过6500 u/g后，三者的增长趋势缓慢，选择6500u/g的加酶量进行以下实验。酶解温度对酶解反应的影响 在底物浓度为1/20，加酶量为6500u/g，pH值为9.0,酶解时间为1h的条件下，选择不同的酶解温度，得到的实验结果如图5： 由图5可得，蛋白质溶出率最高的点是55；多肽含量随温度的升高不断增大，但逐渐增加缓慢；水解度有呈下降的趋势，但是变化不大；所以选择55为最适温度。 酶解时间对酶解反应的影响 在底物浓度为1/20，加酶量为6500u/g,pH值为9.0,酶解温度为55的条件下，选择不同的酶解时间，实验结果如图6。由图6可知，蛋白溶出率，水解度和多肽含量三个指标都随着酶解时间的增长而提高，当酶解时间达到2h后，三个指标的增长速度已经很慢，为了节约时间，选择2h为正交实验的反应时间。4.1.2正交实验确定最佳酶解条件 正交实验中以水解度为指标研究较适宜的酶解工艺条件。影响酶解反应的几个主要因素pH值，温度，酶量，反应时间，根据以上单因素实验分析，决定采用底物浓度为1/20，反应时间为2h，进行pH值，温度，酶量的三因素三水平的正交实验，正交实验的因素水平选取如表：表1 正交设计L9(34） 因素 水平 A pH B 温度（） C 酶量（u/g) 1 8 45 5200 2 9 55 6500 3 10 60 7800表 2 实验及极差分析实验号ABCD（空）测试指标：水解度（%）重复I重复IITi1111133.905435.488969.39432122237.871339.808477.67533133343.387944.002487.39034212337.363638.129175.49275223145.411145.580990.9926231228.973629.091058.06467313243.505643.895287.40088321326.346128.738155.08429332136.148437.401373.5497T1234.4599232.2878182.5431233.936332.913342.1309675.0439T2224.5493223.7515226.7177223.1407T3216.0347219.0046265.7831217.9672X139.076738.714630.423938.9893X237.424937.291937.786337.1901X336.005836.500844.297236.3279R3.07092.21386.5109表3 方差分析 方差来源 离差平方和 自由度 均方和 F值 显著性 A 28.3448 2 13.3909 6.3751 * B 15.1024 2 7.5512 3.5950 C 578.1332 2 289.0666 137.6180 * * e 23.1056 11 2.1005F0.05(2,11)=3.98, F0.01(2,11)=7.21 由表2和表3可知，影响中性蛋白酶水解核桃蛋白质的主次因素为：加酶量pH温度，三个因素的最佳反应条件分别为A1,B1,C3,即中性蛋白酶水解核桃蛋白的最适反应条件是：温度45，pH为8，加酶量为6500 u/g，底物浓度为1/20，反应时间为2h。在此条件下，核桃蛋白的溶出率约为76%，水解度可达37%左右，多肽含量也可达60mg/g。5.讨论及结论5.1 实验采用了凯氏定氮法测定蛋白质，甲醛滴定法测定游离氨基酸发现凯氏定氮法误差较大，且操作过程复杂，花费时间长。甲醛滴定法相对来说比较简单。5.2虽然,凯氏定氮法为测定含氮量抽象算蛋白质的方法,测定结果的重复性和重现性都很好。但此法操作繁琐,试剂消耗量大,消化时排放的SO2 ，对人体健康造成直接危害,而且费时、费电、费水。5.3在蛋白质的消化过程中加入由硫酸铜和硫酸钾组成的加速剂能大大缩短消化时间;加浓硫酸的时候要小心喷出来;消化时温度要逐渐由低到高；滴定的时候要注意观察，不同的指示剂其滴定终点的颜色不同，应选择灵敏的指示剂。5.4 中性蛋白酶水解核桃蛋白的最适反应条件是：温度45，pH为8，加酶量为6500 u/g，底物浓度为1/20，反应时间为2h。参考文献：1 李月文，核桃资源的综合加工与利用，四川林业科技，2005.264，78832 张庆初、丁小雯、陈宗道、等。核桃蛋白质研究进展J.粮食与油脂，2003.（5）：21-243 Szctao KWC,Sathe SK. 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