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腺病毒载体的研究进展 高骞生物科学基地班2009113051 腺病毒载体的研究进展高骞（西北大学生命科学学院，西安，710069）摘要：腺病毒因具有易感染性、宿主范围广、毒性低、使用安全、容纳量大、非整合性等特点，使得腺病毒载体成为基因转移中最有前途的基因载体之一。但由于腺病毒载体在体内靶向性差、免疫原性强、半衰期短，限制了其在基因治疗中的作用。为解决上述问题，可对腺病毒载体的衣壳蛋白进行遗传改造或表面修饰。本文对腺病毒及腺病毒载体的研究进展做一简要综述，为进一步优化和改良腺病毒载体提供参考。关键词：腺病毒；腺病毒载体；研究进展 Advances in adenovirus vectorsAbstract: Adenovirus has a variety of merits: a vulnerability, a wide host range, a low toxity, a use of safety and non-integrity, which made adenovirus vectors become one of the most promising gene vector in the gene transfer. However, due to its poor targeting, strong immunogenicity and short half-life, limit its role in gene therapy. To resolve these problems metioned above, the capsid protein of adenovirus vectors can be operated for genetic or surface modification. The article bridfly reviewed recent progress in adenovirus and adenovirus vectors in a bid to offer references for further optimizing and improving adenovirus vectors. Keywords: adenovirus; adenovirus vectors; research progress 1953年，Rowe等从人的扁桃体组织中分离到一种病毒，后来人们又陆续从人和其他哺乳动物及禽类中分离到类似病毒。因为该病毒最初是从腺体组织中分离的，故名为腺病毒（adenovirus，Ad）。腺病毒分为2个属，即哺乳动物腺病毒属和禽类腺病毒属，分别感染哺乳动物和鸟类。迄今总共已发现有80多个血清型的腺病毒，其中已鉴定过的人腺病毒有50多个型。天然情况下，腺病毒可感染人的呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱、眼、肝脏等部位。感染人腺病毒可分为A、B、C、D4个组，用作重组腺病毒载体的主要为C组血清2型（Ad2）和5型（Ad5），这两种血清型均删除了腺病毒基因组中的E1区，可引起人呼吸道轻微感染，但不引发肿瘤。相比于其它病毒载体，腺病毒转导效率高，宿主范围广，可同时感染增殖性和非增殖性细胞，包装大量外源基因，易于制备纯化成高滴度的临床应用产品。2004年，重组人p53腺病毒注射液（今又生）在我国获批上市，成为全球首个获准上市的基因治疗药品。截止2011年3月1，已进入临床的1644项抗肿瘤基因治疗试验中，应用腺病毒作为基因载体的试验数量最多，达23.8%。1. 腺病毒的结构特征 腺病毒无囊膜，直径约70-90nm，呈二十面体立体对称2。腺病毒含有一个大小在36kb左右线形双链DNA分子（Ad-DNA），两端具有末端反向重复序列（inverted terminal repeat，ITR），长103-162bp。每一条单链的5端共价结合一种分子质量为5.5kDA的蛋白（TP）分子。当Ad-DNA从病毒颗粒中释放出来时，依赖5端共价结合蛋白自行环化。此外，当（Ad-DNA）变性后，在复性条件下会产生单链的柄-环结构。病毒衣壳有252个壳粒，其中240个壳粒各自与周围6个壳粒相邻，称为六邻体（hexon）。在病毒二十面体的12个顶角上，各有一个顶角壳粒，因它与周围的5个壳粒相邻，被称为五邻体（penton）。从每个顶角壳粒的基底部向外伸出一根纤维蛋白突起（fibre protruding），其C末端形成的结节（knob）可与细胞表面的病毒受体结合，介导病毒与细胞的识别与粘附过程。除了上述3种主要蛋白以外，还有一些辅助性小蛋白如p、p、p、p、pa2等起稳定腺病毒二十面体结构的作用。图1.腺病毒的衣壳结构2. 腺病毒的感染机理 病毒感染周期传统上分为两个阶段，第一阶段始于病毒与宿主细胞的相互作用：侵入细胞，运载病毒基因组到达细胞核；第二阶段是病毒基因的复制、转录和翻译过程。2.1 识别与粘附 腺病毒进入靶细胞的过程依赖于病毒和细胞表面的特异性配体和受体的相互识别。首先，衣壳表面的纤维蛋白与细胞表面的科萨基-腺病毒受体（coxsackie and adenovirus receptor， CAR）结合，介导腺病毒与细胞的粘附。接着，病毒五邻体基底蛋白的Arg-Gly-Asp（RGD）序列与细胞表面的整联蛋白V3和V5结合，介导腺病毒内吞进入细胞。内化后，腺病毒进入内涵体运输途径，避免了溶酶体的降解。腺病毒进入胞浆后，经外壳蛋白上的核定位信号入核，进行转录单位的表达3。2.2 基因组的转录 腺病毒的转录分为早期转录和晚期转录。早期转录包括E1A 、E1B 、E2A 、E2B 、E3、E4。E1A蛋白通过促进腺病毒转录并诱发细胞进入细胞周期的S期；E1B进一步调节细胞代谢从而使病毒复制在细胞内更容易。E2蛋白涉及腺病毒DNA复制，编码一系列与复制相关的蛋白。E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统，E4调节有效的晚期基因转录，参与病毒mRNA的转运、剪切，宿主蛋白合成物的修饰及细胞凋亡的调控。晚期转录包括L1-5、E1A 编码的转录因子与宿主细胞的转录因子协同作用激活其他早期基因，晚期蛋白主要是毒力成分和病毒包装蛋白。2.3 基因组复制 早期腺病毒基因的表达为病毒DNA的复制奠定了基础4。腺病毒DNA复制从基因组双螺旋的某一端开始，按半保留方式从5-3端延伸，该过程不涉及冈畸片段，末端蛋白起了引物的作用。复制中所涉及的病毒蛋白是80kd的前体末端蛋白（pTP）和140kd的DNA聚合酶（Ad-DNAp01）。腺病毒DNA复制的最独特之处是55kd的末端蛋白（TP）共价地连接到每个ITR3端的9-18位核苷酸上。特殊的TP/ITR结构起到了病毒DNA复制的起点作用，稳定了病毒DNA的复制并使其不依赖于细胞DNA的合成系统。图2.腺病毒基因组2.4 病毒颗粒的组装 Ad颗粒的组装通常被认为包括以下步骤：（1）形成壳体单位的主要结构(六邻体、五邻体壳粒和纤维蛋白)。（2）组装空的壳体。（3）将病毒DNA插入壳体中。（4）蛋白的成熟裂解。在以上过程中，病毒基因组包装入病毒颗粒之中是最关键的步骤4。3. 腺病毒载体 随着对腺病毒研究的不断深入，使人们认识到腺病毒可以作为一种优良的基因转移载体。在癌症的基因治疗、冠状动脉病人的晚期临床试验及转基因基础研究等方面发挥着重要作用。3.1 腺病毒载体的分类 根据是否复制，将腺病毒载体分为复制缺陷型和复制型两类5。3.1.1 复制型载体 最早的腺病毒载体是复制型的。其特点是将外源基因插入E3区，或者插入到腺病毒基因组的左右两端序列。由于保留了腺病毒E1区，因而病毒能够复制。 优点：长时间地反复刺激免疫系统从而诱导强烈、持久、全面的免疫反应。 缺点：安全性较差；载体自身的免疫原性较强。3.1.2 复制缺陷型载体 根据腺病毒基因组的缺失程度，可将腺病毒载体分为6： a.第一代腺病毒载体。第一代载体去除了El/E3基因表达盒，阻止了依赖E1区和E2区功能蛋白的转录与随后病毒DNA的复制及病毒外壳蛋白的产生。E1区缺失的腺病毒在能够反式提供E1区基因蛋白的细胞中得到增殖。如构建hAd5载体，首先要构建一个含有hAd5的DNA左侧序列（含有左侧的ITR、包装信号及E1A增强子序列）的质粒，将外源基因连接在质粒中腺病毒DNA 序列的下游。用Cla I消化质粒，将含有病毒左侧序列及外源基因的片段与经Cla I消化的hAd5的DNA大片段进行连接，将病毒E1A基因替换掉。再用连接产物转染293细胞，产生重组腺病毒3。 优点：宿主范围广，感染率高，容易制备高滴度病毒；稳定、高效率转导目的基因，致病性低，不整合入细胞基因组；不但可以转染分裂期细胞，而且可以转染静止期细胞。 缺点：容量有限，外源基因表达水平低；诱发机体产生免疫反应，使重复感染失效；潜在产生复制能力的腺病毒等。 b.第二代腺病毒载体。在E1、E3缺失的基础上进一步去除了E2区和（或）E4区，以减弱病毒蛋白的表达4。人们在E2区编码DNA结合蛋白的基因上进行了温度敏感型突变，从而使在非允许温度下不表达晚期基因产物，降低了炎症反应，使外源基因表达时间延长。通过建立E1、E4区互补的细胞系，人们发展了E1、E4缺失的腺病毒载体较E2A缺陷的腺病毒在外源基因的表达和安全性方面都有提高。 优点：较第一代先病毒载体毒性更小、更安全，因而更适于基因治疗。 缺点：基因转移和表达时间没有明显延长，且病毒载体滴度很低，只有第一代的1/1000-1/10；腺病毒载体上仍有许多病毒蛋白，不能完全消除腺病毒的免疫原性。c.第三代腺病毒载体。保留两端TR（Terminal Repeats）及包装信号共约500 bp的顺式作用元件，去除腺病毒基因组中全部编码序列（反式作用元件），其它功能由辅助病毒提供，这样的腺病毒载体就是第三代腺病毒载体即所谓空壳载体（Gutless/Gutted Adenovirus vectors 或Helper-Dependent Adenovirus vector ，HD-AD）6。1995年Mitani K等构建了最早的第三代腺病毒载体，他们用报告基因替换腺病毒基因组中Ll 、L2等必需区域，用野生型腺病毒做辅助病毒，成功包装出具有同样转导性的病毒，重组病毒结构稳定且可以扩增及纯化。 优点：外源基因装载容量大,最高可达37kb左右；缺失全部的腺病毒蛋白编码序列，感染后没有病毒蛋白表达，细胞毒性和免疫原性大幅减弱，目的基因的表达时间大大延长；没有改变病毒的外壳包装蛋白，保留了腺病毒天然的高感染性；可以采用不同血清型的辅助病毒实现血清型转换（Serotype Switching）。 缺点：辅助病毒产量很高，与重组腺病毒产量呈11的比例，分离困难。3.2 腺病毒载体的修饰 有几方面障碍限制了腺病毒载体在临床治疗的应用： a.由于CAR存在于多种组织细胞的表面，腺病毒的嗜向性就非常广泛。相反，在近50%的上皮细胞源性的肿瘤细胞表面CAR非常缺乏，甚至在血液肿瘤细胞表面几乎不表达，这就使腺病毒载体的特异靶向性不高。 b.肝脾部位的巨噬细胞、树突状细胞等抗原呈递细胞（APC）摄取腺病毒，产生促炎细胞因子，如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-等，从而导致免疫系统做出强烈的免疫反应。 c.人体中广泛存在大量抗腺病毒的中和性抗体，使腺病毒在体内的半衰期较短。要达到有效治疗剂量必须多次高剂量注射腺病毒，产生毒副作用。 为了克服上述问题，可对腺病毒载体的衣壳蛋白进行表面修饰或遗传改造，以进一步提升、优化腺病毒载体。目前对腺病毒载体衣壳蛋白质进行修饰的方法主要有两类7。第一类是化学方法，如采用低毒性的聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)等生物化学试剂包裹腺病毒，改变其天然嗜性，介导腺病毒高效靶向。第二类是通过分子生物学手段进行的遗传学修饰，即在腺病毒载体衣壳蛋白质结构中的纤维蛋白、六邻体蛋白、pIX等的DNA序列中嵌入外源小肽的DNA片段，使外源小肽与衣壳蛋白质融合表达于病毒颗粒表面；这些外源小肽可以提高腺病毒对细胞的靶向性及感染效率。3.2.1 表面修饰 对腺病毒进行表面修饰的修饰物有聚乙二醇（PEG），N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺聚合物（pHPMA）等物质。3.2.1.1 PEG化腺病毒 1999年，ORiordan等首次报道了PEG通过共价结合方式修饰腺病毒载体来降低其免疫性。经过修饰的腺病毒保持了病毒颗粒的完整性，同时覆盖了病毒载体的免疫结合位点，而PEG自身又无免疫原性，因此载体的免疫原性得到了有效的降低。体外实验表明，PEG修饰后的载体对CAR阳性的细胞的转染量下降了约99%，证实PEG修饰能有效阻断载体与细胞CAR结合7。 PEG有效地阻断CAR受体与腺病毒的结合，这就需要引入新的靶向结构来解决靶向性的问题。Ji等利用肿瘤细胞表皮生长因子受体（EGFR）较多的特点，以表皮生长因子（EGF）作为靶向材料，连接在PEG修饰的载体上。与不含EGF的载体相比，表达效率明显提升。经过EGF修饰的载体在含有EGFR细胞中的转染量比在不含EGFR细胞中转染量可高出约6倍，表现出了很好的靶向性。利用肿瘤细胞表面叶酸受体过表达这一特点，用用小分子叶酸为靶配体，连接在PEG修饰后的腺病毒载体末端，不仅降低了载体免疫原性，靶向性也显著提高。端粒逆转录酶是近年发展起来的治疗癌症的新靶点，有报道以端粒逆转录酶启动子作为靶配体连接在PEG修饰的腺病毒载体上，能够有效抑制转移肺癌细胞增值，且副作用较小8。3.2.1.2 pHPMA化腺病毒 N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺聚合物（pHPMA）是仅次于PEG的另一种常用于腺病毒表面修饰的聚合物。pHPMA具有生物相容性和亲水性，已作为药物载体应用超过10年。pHPMA的多个侧链末端为有氨基反应活性的基团，因此具有多价态，每个聚合物分子能够与病毒表面多个位点结合1。pHPMA和腺病毒简单混合，就可致密地覆盖到病毒表面。并且由于协同效应和部分屏障作用，腺病毒载体之间并不会发生交联。根据Fisher等的报道，pHPMA修饰的腺病毒不再被A549细胞摄取，表明pHPMA修饰阻断了腺病毒与细胞的CAR及整联蛋白结合途径。此外，在适宜的反应条件下，pHPMA上的反应位点仅部分与病毒衣壳蛋白结合，剩余的反应位点可用来连接靶向基团，较之PEG两端需要连接合适的活化基团来说更加便利。3.2.2 遗传改造 利用基因工程技术在病毒衣壳上加入一系列多肽配体，靶向特定的受体细胞。3.2.2.1 衣壳纤维C末端或HI环的修饰 衣壳纤维是由N末端的尾部（tail）、轴（shaft）和决定受体高亲合力以及腺病毒嗜性的C末端共同组成的同源同向三聚体。衣壳纤维的N末端尾部通过五邻体蛋白与衣壳表面连接，并向外延伸为轴结构，并在其C末端形成结节。衣壳纤维中结节的HI环和C末端暴露于腺病毒衣壳表面，是用于腺病毒遗传修饰和介导腺病毒感染的关键部位。 有大量研究表明，在腺病毒纤维的HI环或C末端插入某些特定的异源小肽可以提高腺病毒对肿瘤细胞的靶向性和感染效率9。如与肿瘤细胞内皮细胞表面CD13分子结合的NGR(Asn-Gly-Arg)序列；与靶细胞表面转铁蛋白受体结合的小肽；与肿瘤细胞表面某些分子结合的小肽。这些异源小肽具备保持其自身功能、避免破坏纤维三聚体结构以及无明显的胞质翻译后修饰等特点。3.2.2.2 不同血清型的衣壳纤维结节嵌合修饰 不同亚群的腺病毒与细胞结合的特异性存在一定的差异，其中A、C、D、E和F通过其结节与天然受体CAR作用而感染细胞。研究表明，人腺病毒中B1亚群（如Ad3、Ad7和Ad16）和B2亚群（如Ad11和Ad35）与细胞表面的CD46、CD80和CD86具高亲和力，而D亚群（如Ad37）与细胞表面CD46具有高亲和力7。实验证实，hAd5通过其结节与天然受体CAR作用而感染细胞，当用人腺病毒的其他血清型的衣壳纤维或结节替代hAd5的相应结构可使hAd5获得新的配体受体结合能力，使其通过非CAR依赖的途径感染细胞，从而提高其对CAR低表达靶细胞的感染效率。3.2.2.3 衣壳纤维替代修饰 用非病毒来源的三聚体结构替代腺病毒天然的衣壳纤维或结节，可以改变病毒的受体靶向性10。实验证实，如用具有三聚体特性的噬菌体T4纤维蛋白替代hAd5的结节和轴大部分区域后，再与CD40配体或IL-13受体a2链形成的含衣壳纤维嵌合体的腺病毒载体对CD40阳性树突状细胞（dendriticcell，DC）、脑胶质瘤细胞U87的感染效率明显提高，并且衣壳纤维嵌合体与天然的衣壳纤维最大不同在于：消除了三聚体结构及其结合CAR的能力。这样无需再考虑插入配体时所带来的结构不稳定性，使衣壳嵌入大分子量多肽作为靶细胞的配体成为可能，并扩大了多肽分子选择的范围，彻底改变了腺病毒的靶向性。3.2.2.4 六邻体蛋白的修饰 六邻体蛋白是腺病毒衣壳结构中最大且分布最多的蛋白质结构，其单聚体初级结构在人的血清型之间有高度的保守性，最主要的不同是六邻体蛋白分子突出区域所包含的7个超变区（hypervariable region，HVR）。而超变区5（hypervariable region 5，HVR5)是外源小肽段插入的有效位点。尽管六邻体蛋白不介导腺病毒进入细胞，但六邻体蛋白经过修饰的腺病毒载体对人血管平滑肌的转导明显增强10。并有资料表明，当细胞缺乏病毒天然受体CAR或人为阻断腺病毒附着以及内化步骤时，六邻体蛋白的遗传修饰也可能使病毒进人细胞6。因此深入研究此种修饰很可能帮助我们构建出特异靶向的腺病毒载体。3.2.2.5 五邻体蛋白的修饰 研究表明五邻体蛋白可和细胞表面整联蛋白相互作用直接引起转导作用，因而对此部位的遗传修饰可提高腺病毒对细胞的感染效率9。实验证明将线性的血凝素（hemagglutinin，HA）肽段融合到五邻体蛋白上后，所获得的病毒可感染表达人工血凝素识别受体的细胞系，而且对病毒的结构完整性并无影响。同时该实验表明，纤维并不完全阻碍五邻体蛋白与细胞受体间的相互作用，所以通过对五邻体蛋白的遗传修饰来提高腺病毒的感染效率是可行的。3.2.2.6 pIX蛋白的修饰 pIX蛋白的分子大小为14.3 kDa，是上述辅助性小蛋白质中分子量最小的，每个壳面存在12个拷贝，可稳定衣壳表面特定区域中六邻体蛋白间的相互作用，是病毒包装必需的成分。pIX的C末端暴露在腺病毒的衣壳表面，将外源小肽插入此位点后可增强载体的靶向性9。3.2.2.7 pIIIa蛋白的修饰 pIIIa蛋白位于病毒颗粒表面，是大小为63.5 kDa的单聚体，是用于腺病毒遗传修饰的潜在位点。实验表明将His6标签融合进pIIIa的N末端后，pIIIa仍可稳定存在于成熟的病毒颗粒中，但其是否能改变腺病毒嗜性以及提高腺病毒的靶向性还有待于进一步研究10。2. 对腺病毒改造的一些想法 对腺病毒的遗传改造和表面修饰能够在一定程度上克服腺病毒的缺点，但这些方法仍有缺陷：PEG化不易获得高滴度的病毒，不适合在体内应用，在实际应用中受到一定限制；遗传改造由于其本身方法的复杂性也进展缓慢。故需要新的方法、策略构建重组腺病毒载体。4.1 利用特定组织表达的特异蛋白质来调控外源基因的表达 利用组织表达的特异性蛋白质作为表达调控元件，来控制外来目的基因表达11。表达调控元件包括正常分化成熟细胞特有的蛋白基因调控元件和某些病理条件下过表达的基因调控元件。如癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，CEA）、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）等调控元件。CEA和AFP基因同属胚胎抗原，在正常人体组织表达量极低，但当细胞发生癌变时它们的表达开放，大量合成。4.2 利用外源诱导物特异启动或关闭外源基因表达 TetOff 系统基于四环素（tetracycline）调节的转激活子（transactivator，tTA）而起作用11。在无四环素存在时，tTA可以通过构建在CMV微启动子上游的四环素反应元件（tetracyclineresponseelement，TRE）来启动CMV下游基因的表达。tTA蛋白是一种融合蛋白, 由四环素抑制蛋白（tetracycline repressor protein，TetR）的1-207残基与来自HSV-VP16激活域的C末端127氨基酸残基融合, 可以将TetR从转录抑制子转为激活子。TRE序列由42bp的四环素操纵子序列（tetracycline operator sequence，tetO）的7个拷贝组成。故利用在反应体系中加入四环素可以抑制其下游基因的表达。 TetOn系统采用反义tTA，后者是改变TetR的4个氨基酸形成的，可以形成蛋白质rtTA（“reverse”tTA）11。rtTA与tetO健合后，在四环素存在情况下可以引起转基因的表达。故可以在反应体系中加入四环素来启动其下游基因的表达。4.3 利用病变组织特殊的物理、化学环境调控外源基因表达 利用肿瘤本身具有局部缺血、缺氧、低糖等特点，应用物理手段可有效诱导目的基因表达11。在腺病毒载体的目的基因上游构建HSP 70启动子，当加热此被腺病毒感染的细胞时，可以通过HSP70启动子来启动目的基因的表达。类似的方法可以利用葡萄糖调节蛋白（glucoseregulatedprotein，GRPs）、氧调节蛋白（oxygenregulated protein，ORGs）、红细胞生成素（erythropoietin）、血管内皮生成因子（vascular endothelial growth factors，VEGF）、基本纤维母细胞生成因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）等做为启动