转基因小鼠大脑中tau疾病的传播与蔓延.doc

转基因小鼠大脑中tau疾病的传播与蔓延过度磷酸化的tau蛋白在几种神经退行性疾病的细胞中形成了纤维状的细胞内夹物，包括阿尔茨海默氏症。在疾病发展过程中，神经元tau蛋白夹杂物首先出现在脑反式嗅皮质并且似乎从那里蔓延到大脑左侧海马回区组织和大脑皮层。当夹杂物发展到海马回时认知功能发生明显缺陷，阿尔茨海默病的病理学上的特点为： 大量的具有tau蛋白夹杂物的新皮层 丰富的细胞外-淀粉样蛋白沉积。Pick病，进行性核上性麻痹，皮质基底节变性等疾病的特点是tou蛋白夹杂物丰富，缺乏-淀粉样蛋白沉积。Tau突变导致家族性的额颞叶痴呆，肯定该tau蛋白的功能失调足以引起神经退行性疾病和老年痴呆。因此，转基因小鼠对人类神经细胞tau蛋白表达变异（例如，P301S），是一些蛋白病的基本特征，包括神经退行性疾病和由过度磷酸化tau蛋白组成的丰富的纤维状物质。相反，小鼠型线表明野生型tau蛋白单体异构不会产生纤维状tau蛋白或显示神经退行性疾病。在这里，我们使用了tau蛋白表达线来研究tau疾病是否可以传播。我们证实，将tau蛋白P301S突变表达小鼠的脑抽提物注入到野生型tau蛋白表达的动物脑中可诱导人类tau蛋白组装成丝状并将这种病理现象从注射区扩散到邻近的大脑区域。转基因鼠系ALZ17和P301S的Tau蛋白被用来做实验。ALZ17家系的小鼠，能表达人脑中最长的tau蛋白异构体（长达441个氨基酸）但不使tau蛋白聚合成纤维状（补充资料，图S1a）。相比之下， 在P301S鼠系中，p301S基因能表达383个氨基酸的人类tau蛋白异构体，p301s突变导致遗传性额颞叶痴呆，生成大量的tau蛋白纤维状夹杂物（补充资料，图S1a）图1 ALZ17小鼠对注射的tau蛋白的病理学感应，注射物为人P301S tau蛋白的转基因小鼠大脑抽提物。 （a）将18个月大的 ALZ17系小鼠的海马回CA3区用抗tau蛋白的抗体AT8染色，或Gallyas-Braak银染或抗tau抗体AT100染色。非注射（左），注射非转基因小鼠的大脑抽提物18个月后的对照组（中）注射六个月大的人P301S tau蛋白的转基因小鼠大脑抽提物15个月后的实验组（右）。各部分用苏木精染色不褪色。，比例尺，50微米（所有小组倍率相同）。（b）免疫电镜观察ALZ17小鼠大脑中的抽提纤维，在注射了人P301S tau蛋白的转基因小鼠大脑抽提物15个月后。用抗tau蛋白血清134，189和304，及抗体AT100标记。比例尺，100纳米（c）在没有纤维状tau蛋白病症的ALZ17小鼠体内注射tau蛋白免疫耗竭的人tau蛋白P301S大脑提取物。左上面板显示抗tau蛋白的抗体HT7的免疫印迹，HT7是（线1）后和（线2）免疫衰竭前从P301S系小鼠大脑中提取的。右上方和下方的板显示的是ALZ17系小鼠用tau蛋白免疫耗竭的P301S系小鼠大脑提取物注射6个月后用Gallyas-Braak染色的齿状回，海马伞和脑下脚。各部分都有复杂的苏木，比例尺，50微米（所有小组倍率相同）。完整扫描免疫印迹数据在的补充资料中，图。S7。383个氨基酸和441氨基酸的tau蛋白异构体都包含4个聚合的微管重复，但它们在氨基末端两个可选的29个氨基酸的插入不同。为了研究tau蛋白聚合是否可以传播，我们提取6月大的人类tau蛋白P301S小鼠脑组织进行匀浆并注射的到三个月大的ALZ17系小鼠的海马回和覆大脑皮层。注射前，将匀进行浆免疫印迹和免疫电镜分析。人类tau蛋白可由免疫印迹法检测为55,000-64,000蛋白带（55 - 64K）（补充资料，图。S1b）。最慢的迁移tau蛋白的种类是免疫反应性的抗体AT100（补充资料，图。S1b）和其他磷酸化依赖抗tau蛋白抗体。（未显示数据）免疫电镜显示，组织提取物中观察到tau蛋白纤维（补充资料，图。S1c）。注射人类tau蛋白P301S小鼠脑提取物能诱导ALZ17小鼠tau蛋白聚合的病理现象，如由Gallyas- Braak银染染色现象（图1a）和由免疫电镜观察到tau蛋白纤维丝的存在（图1b）所示。将注射脑提取物液6个月，12个月和15个月后（每组五个平行）细胞内观察Gallyas-Braak染色现象。除了银染阳性神经细胞体和程序，注射 tau蛋白P301S系小鼠脑提取物会导致抗体AT100免疫反应的出现（图1a），这种反应是受tau蛋白指示。相比之下，没有银染阳性病变的则观测到的相应水平的十八个月大的未注射ALZ17系小鼠的海马回（补充资料，图18。S2A）或注射非转基因对照组小鼠大脑提取物15个月后的ALZ17系小鼠得海马回（图1a）。 图2在注射部位ALZ17小鼠的Gallyas-Braak染色阳性结构数目暂时性增加（注射部位距离前囟-2.5毫米）。 （a）银染阳性结构在统计学上的显着增加，在6至12个月及12至15个月的海马回可以观察到。在12至15个月可观察到大脑皮层显着增加。结果表示为平均值 s.e.m. （5个）; * P0.05。（b）在6至12个月，12至15个月的海马回，可观察到显着增加的神经毡细丝和卷曲小体。12至15个月中可观察到神经原纤维缠结显着增加。结果表示为平均值 s.e.m. （5个）; * P0.05，* P0.001; * P0.0001。（c）Gallyas-Braak染色的ALZ17小鼠海马区（CA1区，辐射层和脑下脚），分别在ALZ17小鼠在注射人P301S tau蛋白脑提取物注射第6个月上旬，第12个月中旬和第15个月下旬。 各部分用苏木精染色不褪色。比例尺，50微米（所有小组倍率相同）。用在P301S提取的免疫耗竭的tau蛋白注射ALZ17动物6个月后没有发现任何Gallyas染色或AT100阳性结构（图1C）证明了tau蛋白的存在对于P301S提取物诱导tau蛋白纤维状疾病是必要的。18个月大的ALZ17小鼠在海马回中的AT8免疫反应（反映tau过度磷酸化），但不被AT100染色，就像前面报道的。 将人tau蛋白转基因P301S系小鼠大脑提取物注射后，AT8免疫反应（反映tau过度磷酸化）变得更加普遍，tau蛋白过度磷酸化也变得普遍（图1a）。在ALZ17系小鼠的不同细胞类型中注射P301Stau蛋白，其诱导产生纤维状的tau蛋白的病理不同。ALZ17 mice (Supplementary Information, Fig. S2b).人类中发现的tau蛋白疾病中银染阳性结构形态难以区分，在被注射的ALZ17系小鼠大脑中很明显（补充资料，图。S2b）。它们包括神经纤维缠结（小组1和2中的箭头标记），神经毡细丝（小组1和2的箭头方向）和少突神经胶质细胞卷曲小体（小组3和4中的箭头）。银染阳性结构也对tau蛋白过度磷酸化具有免疫反应（补充资料，图。S2b小组2和3）。从被注射的大脑提取丝上装饰着磷酸化依赖的抗tau抗体及具体的N -端插入的tau亚型抗体（图1b），。因此，人野生型441个氨基酸的tau蛋白异构体在ALZ17系小鼠中表达形成了纤维丝而不是由注射材料产生。这个结论也被另一个实验发现支持，即用P301S系小鼠大脑提取物注射ALZ17系小鼠生成的夹杂物与N端插入的tau蛋白的特异性抗体会产生免疫反应（补充资料，图。三）。注射P301Stau蛋白大脑提取液的ALZ17系小鼠，一天后没有观察到被银染色（未显示数据）。 在观察ALZ17小鼠注射P301S tau蛋白脑提取物15个月后，对比未注射的ALZ17动物而言它都没有神经元的损失，星形胶质细胞增生，炎症，轴索损害或髓鞘崩溃的迹象（补充资料，图。四）。在ALZ17系小鼠中tau蛋白纤维状的诱导是时间和大脑区域的依赖。 海马回定量评估表明，注射后6个月，12个月和15个月的在银染阳性的病变数量显着增加，（图2A条，三）。 神经毡细丝是最丰富，其次是卷曲小体和神经纤维缠结（图2b）。大脑皮层同样符合这个事实，虽然这里会逐渐发展成为少银阳性结构（图2a）。银染的阳性现象没有局限于注射区域，但波及到邻近大脑区域，如可视化三个冠状大脑部分包括注射部位和前水平1.7毫米和1.3毫米后的注射部位（图3，表1）。在注射层，丰富的银染出现在海马，穹隆，视束和丘脑，在更远的区域有较少的不正常的结构，如内侧丘系，未定带和大脑脚。下丘脑是纤维状tau蛋白病理发展最遥远的区域，（距离注射部腹侧4毫米;一成年小鼠的大脑注射高度约为5.5毫米，长度13毫米）。在注射层面前部约2mm的位置，纤维状tau蛋白病理在穹隆，丘脑，内囊，尾壳，躯体感觉皮层，下丘脑，以及从注射人P301Stau蛋白提取物15个月后的小鼠的杏仁体中被发现（表1头鼠;补充资料，图。S5a）。注射部位的后方大于1毫米的区域15个月后，大脑脚，海马回，上丘，黑质，内嗅皮层，深脑核和脑桥核显示出纤维丝状的病变，注射丝状病变（表1，补充资料，图。S5b）。中度纤维状tau蛋白病理在对侧大脑部分区域，非注射半球可以观察到（补充资料，图。S5c）。为了确定哪种tau蛋白负责在ALZ17诱导小鼠聚集tau蛋白，将P301S提取物分为含有可溶性和含有不溶性的tau蛋白分别注入ALZ17小鼠。不溶性tau蛋白注射在ALZ17动物（补充资料，图。六）中引发了Gallyas-Braak阳性结构，类似于粗提取P301S后，注射提取物的观察现象。此外，随着时间的推移纤维状的tau蛋白的病理有一个类似的增长和扩散，（数据未显示）。注射可溶性tau蛋白与注射不溶性tau蛋白相比诱导Gallyas-Braak阳性结构大打折扣（40; *CA1，CA2，CA3区，齿状回和下托，1，2 注射位点。注射人类tau蛋白P301S转基因小鼠的大脑提取物15个月后的ALZ17小鼠缺乏神经退行性变化的明显的迹象，与tau蛋白P301S系小鼠神经细胞损失特点形成对比。这表明，负责传输和负责神经毒性的tau蛋白分子是不相同的，这还有待观察神经退行性改变，是否在以后的时间点出现。一个神经元和神经胶质组合的tau蛋白病理现象是将野生型四聚体tau蛋白亚基组装成纤维状的大部分人类神经退行性疾病的特点。它们包括进行性核上性麻痹，皮质变性，嗜银颗粒疾病。 相反，在Pick病三聚的tau蛋白亚型是在神经包裹发现，在阿尔茨海默氏症，包括三，四聚的tau蛋白异构体组成神经纤维缠结。 此外，tau蛋白纤维的形态在不同的tau蛋白疾病中有很大的差距。加上这里报告的调查结果显示的传输和蔓延纤维状的tau蛋白病理，这很容易使人联想哺乳动物和酵母朊病毒，为此，不同菌株已对组装蛋白随变生物的独立生存的基础做出描述。 我们很容易推测，不同的tau蛋白株可能有不同基础的偶发tau蛋白疾病发病机制。现在这一假设可以由向ALZ17小鼠注射偶发性的tau蛋白疾病患者大脑提取物实验与来检测。从随着时间的推移增加的银染阳性结构推知，它很可能是神经细胞的过程和少突胶质细胞是诱导纤维丝的主要地点。 这些发现以前和使用小鼠朊病毒疾病，-淀粉样蛋白沉积和一些周边amyloidoses模型的工作具有可比性。但是，不像其他疾病中等纤维的位置在细胞外的，tau蛋白的夹杂物在细内胞。因此，必须存在的机制，其中tau蛋白聚合物既可以进入细胞内或从外面级联诱导激活。细胞内，tau蛋白聚合物能发挥作为转基因野生型有序组装人类tau蛋白成银染阳性和AT100阳性纤维状沉积的种子。细胞内纤维状tau蛋白病理现象也可由细胞外tau蛋白聚合物诱导。 先前的工作确实表现出因为在人类tau18，19的转基因小鼠突变体中-淀粉样蛋白聚集使细胞外tau蛋白病理现象的增强的效应，但是，观察野生型人类tau23转基因小鼠，却没有这样的效果。有人建议，由动力神经元分泌的错误折叠的超氧化物歧化酶，造成了严重家族形式的肌萎缩性脊髓侧索硬化症的子集。如此类推，tau蛋白的病理传播也可能导致神经细胞和神经胶质细胞受影响使聚集物释放。 这将是判断是否存在错误折叠tau蛋白的重要的调查机制。在单个脑细胞形成了tau蛋白聚集物及其随后的传播，有可能是偶发性的tau蛋白疾病来源。因此，tau蛋白聚集在细胞外空间的存在将是导致疾病事件强制性的一步。免疫接种策略可能防止这种进程。目前的结果表明了转基因小鼠系之间的演示，并描述了实验系统中，调查tau疾病传播蔓延病理和tau蛋白的菌株存在。 识别分子tau蛋白种类，诱导传输，汇聚和传播的能力将是重要的。类似的机制也可以依据的帕金森氏症和路易体引起的痴呆症，其中- 核蛋白的病理似乎从脑干区域蔓延到中脑和大脑皮层。 此外，那些接受胎儿脑细胞移植的帕金森病的病人丝状-突触核蛋白病理现象似乎从受影响宿主组织蔓延到移植神经元。与朊病毒疾病相反，人类tau蛋白疾病不认为是传染病，现在这里的这种类型的实验模型系统描述有可能研究和分析tau蛋白疾病和朊病毒疾病的异同。关于细胞生物学文献的一些思考：1，该文献先是分析了产生神经退行性疾病的特点： -淀粉样蛋白沉积 tau蛋白夹杂物在最后的分析中也没有忽略细胞外-淀粉样蛋白沉积对产生神经退行性疾病的作用，但其研究的重点是关于tau蛋白夹杂物的来源以及它会不会传播。2，实验过程简图： P301系tau蛋白提取物 注射野生型 诱导成纤维丝并扩散ALZ17家系小鼠 表达最长tau蛋白异够体但不聚合成纤维丝ALZ17家系小鼠 注射P301系Tau蛋白提取物ALZ17家系出现tau蛋白聚合成纤维状现象现象P301系免疫耗竭的tau蛋白 ALZ17系 未出现tau蛋白的纤维状聚合P301系tau注入ALZ17系中形成的纤维聚合物N端插入的tau蛋白特异性抗体免疫反应 可溶性P301STau蛋白提取物 ALZ17小鼠 不产生tau蛋白聚集物不溶性P301Stau蛋白提取物ALZ17小鼠 产生tau蛋白聚集物主要是不溶性的tau蛋白诱导tau蛋白聚集 tau蛋白P301S系小鼠的大