中药及其活性成分基因转录水平机理研究进展.doc

标签:标题1【关键词】 中药；活性成分；基因转录水平；机理研究；综述千百年来,在中医药理论指导下,无论单味还是复方中药,在临床实践中不断地得到验证是有良效的,且在临床适用的范围筛选出有显效的活性单体成分的事例也屡见不鲜。但中药的作用机理研究如同药效物质基础研究一样,是中药基础研究的一个瓶颈,其中一个重要原因是中药特别是中药复方的成分复杂,很难找到有效的研究手段。近年来,分子生物学技术的发展使得从基因转录水平研究中药的作用机理成为可能。笔者根据近10年来中药基因转录水平机理研究的文献报道,对这方面的国内外进展综述如下。1 中药活性成分基因转录水平机理研究 中药活性单体成分或有效部位由于成分较单一,便于实验及得出明确的结论等,有关的机理研究报道相对较多。如生物碱类的研究。川芎嗪是中药川芎的主要活性成分之一,史氏等1和Song Jianxin等2分别采用RNA印迹技术(Northern blot)研究其对心肌细胞缺氧缺糖损伤的保护作用和抗血栓机制,前者表明,川芎嗪可显著促进缺氧缺糖心肌细胞一氧化氮合酶(NOS)mRNA的表达,对心肌细胞缺氧缺糖损伤有较好的保护作用；后者显示,川芎嗪抑制内皮细胞基础的和脂多糖(LPS)诱导的纤溶酶原激活抑制因子表达,促进纤溶作用。此外,Li Zesong等3用自制的心血管疾病相关基因的低密度寡核苷酸微阵列来研究川芎嗪的分子机制,实验表明,川芎嗪使人脐静脉内皮细胞的钙-ATP酶基因、钠通道基因、细胞色素P450 c11基因表达上调,载脂蛋白C-基因下调,与反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的结果一致。对苷及苷元类的研究也有相关报道,曹氏等4-5通过斑点杂交法(dot blot)分别观察商陆块根的有效成分商陆皂苷辛(EH)和淫羊藿中的淫羊藿苷(ICA)对小鼠脾淋巴细胞白细胞介素(IL)-3 mRNA和IL-6 mRNA表达水平的影响,结果显示,EH和ICA都促进了伴刀豆球蛋白A诱导的小鼠脾淋巴细胞IL-3 mRNA及IL-6 mRNA表达,提示这些细胞因子基因转录水平提高进而表达产物增加是其免疫调节和提高造血功能的分子机制之一。Jia Hongxiao等6为了弄清细叶远志皂苷元改善淀粉样蛋白(A)诱导的大鼠模型的胆碱能功能减退的分子机制,采用RT-PCR和荧光共振能量转移等技术分别考察了对淀粉样前体蛋白(APP)mRNA表达和对-分泌酶蛋白水解活性的影响,结果是细叶远志皂苷元并没影响APP mRNA表达、全长APP合成或APP-分泌酶的分泌,而是在体外抑制了-分泌酶对其底物的蛋白水解活性,从而抑制A的分泌。Wang Hao等7应用RT-PCR考察了人参的活性成分之一人参醇对转染了人毒蕈碱(M)1亚型基因的中国仓鼠卵巢细胞的M1基因表达,结果显示,伴随升高的M1 mRNA水平,M1受体数呈浓度依赖式上调,从而人参醇有望代替化学合成的M1受体激动剂治疗阿尔茨海默病(AD)。对酚酸类化合物的研究报道有,Luo Wei-Bo等8用RT-PCR研究了丹酚酸B镁(MLB)对缺氧/复氧下的内皮细胞NOS表达水平的影响,结果表明,MLB抑制了缺氧/复氧诱导的内皮型NOS mRNA表达,刺激了诱导型NOS mRNA的表达和NO的释放,减轻了内皮细胞损伤,提示细胞损伤减轻与NO的释放增加有关。此外,对多糖的研究也有相关文献资料,陈氏等9应用RT-PCR观察了枸杞多糖对小鼠骨髓原癌基因c-myc表达的影响,结果显示,老年小鼠和衰老模型小鼠骨髓原癌基因c-myc表达量明显高于青年小鼠和正常对照小鼠,给药后则可明显得到抑制。因而,推测抑制原癌基因c-myc表达是枸杞多糖抗衰老分子机理之一。2 单味中药基因转录水平机理研究 单味中药的机理研究报道相对较少。韩氏等10应用Northern blot观察海风藤对人类神经母细胞瘤细胞系列-APP基因表达的抑制作用,结果发现,海风藤选择性地抑制-APP基因表达,为其防治AD提供了一定的依据。蔡氏等11通过用RT-PCR检测雌激素受体(ER)和mRNA表达量,考察了补肾阳中药淫羊藿和补肾阴中药女贞子对雄性大鼠杏仁核和皮质顶叶ER mRNA的调节表达差异,结果显示,两用药组大鼠杏仁核、皮质顶叶ERmRNA 表达量无明显变化,ERmRNA表达量都上调,且淫羊藿组高于女贞子组,说明补肾中药的作用机制之一可能是通过调节ER来发挥作用。王氏等12用自制的包含24个细胞周期相关基因的cDNA微阵列,对抑制肝癌细胞增殖的4种中药乌药、青蒿、紫草和黄芪的抗肿瘤分子机制研究表明,4种中药对细胞周期基因和损伤检测点基因均有不同程度改变,表现为部分上调,部分下调,为其治疗癌症的研究提供了可供参考的分子生物学依据。3 中药复方基因转录水平机理研究 李氏等13采用dot blot和原位杂交技术,研究血管通对动脉粥样硬化(AS)家兔血管壁血小板衍化生长因子(PDGF)-A、B及c-myc的基因表达水平,结果血管通组血管壁PDGF-A及c-myc的mRNA表达水平下降,初步说明血管通抑制血管平滑肌细胞增生、阻止AS形成的原因。四物汤是临床常用的经典补血方,郑氏等14应用dot blot研究了其对IL-6 mRNA表达的影响,实验表明,四物汤在0.011.00 ng/mL浓度内可使IL-6 mRNA的表达明显增加。保心丸有抗AS的作用,樊氏等15用dot blot研究其作用机制,考察内皮素(ET)和NOS在AS家兔主动脉壁的表达,表明保心丸组ET-1mRNA 的表达较模型组低,而NOS mRNA较模型组高,推测保心丸抗AS的作用机制之一可能是通过调节血管内源性NO和ET之间的平衡。王氏等16采用原位杂交技术,研究精制血府胶囊对心肌缺血密切相关的基因表达的影响,结果表明,精制血府胶囊组ET-1和内皮素转换酶(ECE)-1的mRNA表达较其它组明显减少,且心肌细胞损伤也较其它组显著减轻。因而,推测精制血府胶囊可能是通过抑制ET-1、ECE-1的基因表达,减少/zuixinfanwen.htmlET-1的生成,从而减轻其对心肌细胞的直接损伤,发挥保护心肌细胞的作用。KIM Su-Jin等17用RT-PCR研究Gumiganghwaltang(GMGHT)在小鼠腹膜巨噬细胞中的抗炎机制,实验显示,GMGHT以剂量依赖的方式降低了LPS诱导的TNF-、IL-6和环氧化酶-2 mRNA表达水平,推测这是GMGHT减少炎症的重要分子机制之一。郑氏等18应用RNA酶保护技术进行的补肾、活血复方对老年大鼠T细胞凋亡相关基因Fas、FasL转录影响的实验说明,老年大鼠T细胞的过量凋亡与Fas、FasL基因的高表达相关,而只有补肾复方具有下调T细胞FasL基因转录的作用,活血复方则没显示对两基因有影响,这可能是补肾复方下调老年大鼠T细胞过度凋亡的分子机理之一。钟氏等19采用RT-PCR化学发光定量法观察了补肾、健脾、活血三类复方分别对下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺(HPAT)轴受抑制模型的下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(CRT)mRNA表达的影响,结果只有补肾药可通过提高下丘脑CRT mRNA表达来保护HPAT轴免受外源性皮质酮的抑制,活血药对HPAT轴无任何影响,因此,从药物验证的角度确定药物对肾阳虚证的主要调节点在下丘脑。郑氏等20通过用RT-PCR考察二仙汤不同时间对肾阳虚大鼠垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)基因表达的影响,表明二仙汤可以上调垂体组织ACTH基因表达,且表达量随用药时间延长而增加,提示上调ACTH mRNA表达是二仙汤治疗肾阳虚证的作用机理之一。陈氏等21用RT-PCR完成的复方制剂通痹灵(TBL)对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞TNF-mRNA表达的研究表明,TBL能明显抑制大鼠滑膜细胞TNF-mRNA表达,使其趋于正常,提示TBL治疗类风湿性关节炎的作用机理之一可能是通过抑制滑膜细胞异常表达的TNF-mRNA,从而下调TNF-产生而实现的。易氏等22应用RT-PCR在益髓生血颗粒对-地中海贫血患者造血刺激因子干细胞因子(SCF)及人红细胞生成素受体(EPOR)mRNA表达的实验结果中显示,治疗后,外周血EPOR、SCF mRNA表达明显增强,因此,推测益髓生血颗粒可能是通过影响SCF以及EPOR mBNA表达来促进骨髓造血,提高血红蛋白、红细胞的水平,达到治疗-地中海贫血病的目的。周氏等23采用含2 048个基因的小鼠基因表达谱芯片检测黄连解毒汤及其成分黄芩苷和盐酸小檗碱对LPS造型的小鼠脾细胞基因表达的影响,结果复方的作用明显优于有效成分的作用,但对具体基因表达影响的分析存在一定难度。4 结语 由于中药的作用机理是联系病因病机和中药/中药复方的功能主治的纽带,而且这方面的研究还是追踪确定中药/中药复方的药效物质基础的必要途径。因此,对中药的作用机理研究不仅仅是用现代科学技术、语言对其功能主治的单纯解释,通过此方面研究,不仅有助于阐明中医药学的基础理论,如对补肾中药的机理研究有助于阐明肾本质；还可以改进方剂,发现新功效、扩大应用范围,确定相应的活性成分等。但中药的作用机理研究长久以来一直难有突破性进展,成为阻碍中药发展提高的重大难题。以分子生物学技术为代表的新技术的发展改变了这一困境。从以上对近年来采用分子生物学技术研究中药基因转录水平机理的报道来看,大部分中药及其活性成分对选定的相关基因转录水平是有影响的,因此,在研究中药的作用机理时非常有必要考察对相关基因转录的影响。 从已完成的研究看,目前除了为数不多但具有示范意义的系统研究以外,大多较零散,处于起步阶段,但无疑是一些有益的探索。中药基因转录水平的机理研究除了需要既往的积累,还与分子生物学技术发展水平和已明确的疾病相关基因的多寡密切相关,后两方面随着分子生物学技术等新技术的进步与完善、人类基因组计划的完成会逐步得到解决。总之,除了对中药基因转录水平的机理研究,再结合其它技术,对不同水平的作用机理进行系统研究,相信中药的疗效不再是“黑匣子”,而是有充分的科学依据,并会有更多的良药开发出来。【参考文献】 1 史大卓,陈可冀,钟 蓓,等.川芎嗪对缺氧缺糖培养心肌细胞蛋白质、RNA合成及一氧化氮合酶基因表达的影响J.中国药学杂志,1998,33 (12)：724726.2 Song JX,Ruan QR.Mechanism of ligustrazini against thrombosisJ. Chin Med J,2000,113(2)：136139.3 Li ZS,Li DL,Huang J,et al.Preparation of cardiovascular disease-related genes microarray and its application in exploring ligustrazine-induced changes in endothelial gene expressionJ. Pol J Pharmacol,2004,56(4)：427433.4 曹颖瑛,郑钦岳,姜远英,等.商陆皂甙辛对小鼠脾脏细胞产生IL-3和IL-6的影响J.上海免疫学杂志,2002,22(5)：334336.5 曹颖瑛,郑钦岳,张国庆,等.淫羊藿甙促进小鼠脾细胞IL-3 mRNA及IL-6 mRNA的表达J.第二军医大学学报,1998,19(2)：199200.6 Jia HX,Jiang Y,Ruan Y,et al.Tenuigenin treatment decreases secretion of the Alzheimers disease amyloid -protein in cultured cellsJ.Neuroscience Letters,2004,367(1)：123128.7 Wang H,Wu XJ,Cui YY,et al.Up-regulation of ML muscarinic receptors expressed in CHOmL cells by panaxynol via cAMP pathwayJ.Neuroscience Letters,2005,383(1-2)：121126.8 Luo WB,Dong L,Wang YP.Effect of magnesium lithospermate B on calcium and nitric oxide in endothelial cells upon hypoxia/ reoxygenationJ.Acta Pharmacol Sin,2002,23(10)：930936.9 陈智松,农志飞,吴志奎,等.枸杞多糖对衰老小鼠原癌基因c-myc表达的影响J.中成药,2001,23(5)：356359.10 韩恩吉,Rajiv J.海风藤抑制淀粉样前体蛋白基因表达的研究J.中国中药杂志,1998,23(11)：691694.11 蔡 晶,杜 建,曹治云.补肾中药对雄性大鼠杏仁核和皮质顶叶雌激素受体mRNA 表达的影响J.福建中医学院学报,2006,16(1)：3436.12 王广良,陈成彬,高建明,等.细胞周期相关基因微阵列在中药抑制肝癌细胞增殖作用机理研究中的应用J.中国中药杂志,2005,30(1)：5054.13 李 静,陈可冀,张靖溥,等.血管通对实验性动脉粥样硬化家兔血管壁血小板衍化生长因子A、B及c-myc基因表达的影响J.中国中西医结合杂志,1995,15(1)：3336.14 郑钦岳,曹尉尉,曹颖瑛,等.四物汤增加小鼠脾细胞分泌IL-6及促进IL-6 mRNA的表达J.第二军医大学学报,1998,19(3)：290292.15 樊永平,王绵之,王 伟,等.保心丸抗实验性动脉粥样硬化的机理探讨J.北京中医药大学学报,1997,20(1)：3334.16 王 伟,史大卓,陈可冀,等.精制血府胶囊对缺氧缺糖心肌细胞ET-1与ECE-1基因表达影响的研究J.中国医药学报,2000,15(4)：1720.17 Kim SJ,Jeong HJ,Moon PD,et al.Anti-inflammatory activity of Gumiganghwaltang through the inhibition of nuclear factor-B activa