中药发酵的概况与关键技术.doc

现代中药发酵技术研究现状近年来，国际医药市场对传统药物及天然药物的需求量正快速增长，以传统药及天然药物资源开发创新药物和相关健康产品已成为当今世界药物研发的新趋势、国际医药学术界的研究热点和医药企业经济的快速增长点。我国作为中医药的发源地，拥有系统的中医药理论和极为丰富的天然药物资源，虽然面临着天然药物市场强劲增长的有利形势，但国际化步伐缓慢，其根本原因在于中药现代化水平仍较低。中药发酵技术是在继承中药炮制学发酵法的基础上，吸取微生态学研究成果，结合现代微生物工程而形成的高科技中药制药新技术，具有广阔的发展空间。!古代中药发酵技术应用历史我国人民远在多年前就学会利用发酵来酿酒，此后又相继利用发酵来生产酱、醋、豆豉和臭豆腐等食品。本草经疏曰：“古人用曲，即造酒之曲，其气味甘温，性专消导，行脾胃滞气，散脏腑风冷。”说明中药临床应用之曲是在酿酒业发展的基础上出现的，曲与酒相维系。后来人们在酒曲中加入其他药物制成专供药用的各类曲剂。本草纲目云：“古人用麴，多是造酒之麴。后医乃造神麴，专以供药，力更胜之。”可见古人早已将微生物发酵应用于中药炮制。即将药材与辅料拌和，一定温度和湿度下通过微生物的发酵达到提高药效、改变药性、降低毒副作用等目的。直到现在，临床仍在应用的发酵$制品%中药，如六神曲、淡豆豉、建曲、沉香曲、半夏曲、红曲、豆黄等，均是利用炮制环境中的野生微生物$多为霉菌、酵母、细菌等%进行多菌种固体发酵而成。发酵技术应用历史悠久，也是传统中药加工炮制的重要方法之一，一般主要是起到中药复合炮制的作用。不同的培养基经同样的发酵处理后会产生药性的差异，可利用该特性生产不同适应证的中药。例如，发酵淡豆豉时，以桑叶、青蒿发酵者，药性偏于寒凉，多用于风热感冒或热病胸中烦闷之症；以麻黄、紫苏发酵者，药性偏于辛温，多用于风寒感冒头痛之症。在清代，根据辅料中药及治疗功能的不同，又制出了皂角曲、竹沥曲、麻油曲、牛胆曲、开郁曲、海粉曲、覆天曲等!#种药曲。! #利用中药培养基发酵药用真菌菌物界估计逾十万种，可供药用的高等真菌约&#余种，利用潜力巨大。国内&#世纪#年代兴起深层培养$或发酵%，&#世纪(#年代中国医学科学院药物研究所进行的冬虫夏草大规模发酵培养研究，也仅是对菌类自身发酵的研究，如灵芝、冬虫夏草、香菇发酵等，且大多是单一发酵。目前对灵芝、云芝、冬虫夏草、灰树花、密环菌、金针菇、香菇、姬松茸、茯苓等很多菌种的发酵技术已日趋成熟) ! * !# +。庄毅曾提出了菌质的概念) ! * !& +，即用一定的药用菌菌种接种在一定的固体基质上，在一定环境条件下，经过一定时间发酵$发酵周期%，在特定的质量指标控制下达到发酵终点而产生菌质。可采用现代技术将有效真菌与中草药组成的不同发酵基质构成各种发酵组合，在一定条件下进行发酵，产生各种性质不同的菌质。可以利用中药作为培养基的组成部分，构建药性菌质，比较发酵前后中药相关成分的变化，为中药与药用真菌的结合寻找突破点，并开发具有良好功效的药物。王玉红等) !, +在发酵培养基中添加适量的黄芪以促进灵芝的生长和灵芝多糖的产生，结果其多糖的组分发生了变化，有可能产生了新的物质。尤建良等) ! +将中药抗癌复方“康复灵”$ 主要含党参、麦冬、薏苡仁、猪苓、淮山药等 % 以灵芝菌进行生物发酵，结果表明灵芝-中药制剂发酵液的抑瘤率达,. (/0，比单独的灵芝发酵液、单味中药制剂和灵芝发酵液-中药制剂混合液均有明显提高。! !利用微生物转化中药活性成分微生物转化的本质是利用微生物生长代谢过程中产生的酶对特定底物进行结构修饰的化学反应，利用微生物发酵炮制中药的过程实际上就是一种生物转化反应，中药成分的生物转化是研究开发新药的重要方面。微生物在生长过程中可以分泌几十种胞外酶于培养基中，其生命活动所产生的胞内酶更是成百上千，这些丰富而强大的酶系就可能成为中药发生化学反应的物质基础。由于微生物具有种类繁多、繁殖快等特点，所以微生物转化常被用来对天然产物的结构进行修饰，以获得一些结构更合理或活性更好的先导化合物。!）提高药物疗效：通过微生物与中药共发酵来进行中药炮制，微生物发酵的次生代谢物与药物成分发生协同作用可增强药效，从而获得药效更强的药物。王贞佐等) !1 +在培养基中加入中药$焦三仙、黄芪、当归、海马、柴胡%提取液，探索其对冬虫夏草生长及菌丝体中有效成分含量的影响，结果发现其对冬虫夏草菌丝体生长有药学专论!国家中医药管理局中医药科学技术研究专项，项目编号：# * #/23。中药发酵的概况与关键技术!傅超美，冷 静（成都中医药大学，四川 成都!#/1）摘要：中药发酵技术是在继承中药炮制学发酵法的基础上，吸取微生态学研究成果，结合现代微生物工程而形成的高科技中药制药新技术。发酵中药是目前中药研究的热点，该文对近!#年中药发酵的概况进行综述，并对其关键技术进行了探讨。关键词：中药；发酵；微生物；关键技术中图分类号：#$% &!文献标识码：文章编号：!() * +,-! .($ /!0 * (! * (-1232456 789:598;3 53 ?2A3;6;B82C 83 D24E239598;3 ;F GA832C2 H288356! #$%&()，*(+, -)+,. #$(+,/ 0+)1(23)45 &6 72%/)4)&+%8 #$)+(3( 9(/):)+(; #$(+,/; ?A B!#$%&$：45 678 9:;?8;9:C D8ED856:6?5 6875?C?AG ?B H758;8 D8E5:C I798E 678 8;8:7 8;JC6;5 D?8?C?AG :5E ?D958E I5 B8D856:6?5 85A5A ; : 58I 7D:8J6D8568E ?BH758;8 D8E5:C 7:; 98?D8 7?6;=?6 5 678;8:7 B8CE. L76C8 AG ?5 678 A858:C ;6J:6?5 ?B H758;8 D8ED856:6?5 CG : E8:E8 :5E E;J; ?5 6; N8G 6875?C?A8;.()* +,%-#：H758;8 D8ED856:6?5；D?98；N8G 6875?C?A8;中国药业!#$% &%(%)*+,#)%-.!#年第$%卷第$&期明显的刺激作用，且能显著提高虫草菌丝体中主要有效成分甘露醇的含量，对发酵液中多糖含量也有影响。任莉颖等 #$ %发现，经夏枯草芽孢杆菌&! #(发酵炮制的红花，抗氧化功效显著提高，可能是其中的一些有效成分经&! #(生物转化所致。!）产生新的药效物质和药理作用：微生物在代谢过程中分泌的胞外酶可将药物成分分解转化，形成新的化合物，某些中药的有效成分经发酵后可以产生新的药效更强的物质。李国红等 #) %用枯草芽孢杆菌对三七须根进行发酵，并对三七中的皂苷成分进行分离，得到了*个化合物，其中人参皂苷+,-在三七及三七原料药中均未被检测到，说明该化合物是通过发酵产生的。又如采用含有根霉菌和! 赖氨酸等物质的酵曲发酵进行五倍子发酵 #. %，发酵后可产生没食子酸，并产生了抗菌、抗病毒、抗真菌、抗肿瘤、抗过敏及利胆和扩张支气管等新的药理作用，而未发酵的五倍子却没有这些作用。(）转化有效成分：进入人体后不能直接被利用的药物有效活性组分，可利用发酵技术在体外完成转化而使之能被机体直接利用，迅速发挥应有效能。!/世纪0/年代初，小桥恭一 #0 %发现中草药成分番泻叶苷、芦荟苷可借助肠道细菌转化为致泻有效成分番泻苷元和芦荟大黄素，从而起到治疗作用。又有报道，在中药有效成分与细菌的生物转化过程中，许多苷类、黄酮类、黄酮醇、黄烷酮类、香豆素类等均经过肠道菌进行了化学修饰。田天丽等 !/ %利用能产生! 葡萄糖苷酶的一株根霉菌种与虎杖共发酵，将虎杖苷转化为白藜芦醇，同时将结合蒽醌苷转化为大黄素。薛慧玲等 !# %采用筛选获得的! 葡萄糖醛酸酶产生菌12 #/对黄芩中的主要前体物质黄芩苷进行发酵转化，产物确定为有效成分黄芩素（黄芩苷元），得率为(3 !$4，是原药材含量的*3 (倍。!中药发酵技术的优势中药发酵是现代中药研究的热点，其优点可概括为5 #）保护中药活性成分免遭破坏，使药物的有效组分、活性物质最大限度地得以提取、利用；!）提高中药药性，降低药物的毒副作用；(）所优选的人体有益菌种本身能补充或增强原有药物的功能；-）产生新的活性物质；*）为中药活性成分结构修饰提供新途径；$）节省药材资源，保护环境；)）是实现中药现代化、具有高科技水平的又一新技术，生产工艺可控，所得产物精确，制剂方便，便于与国际接轨。中药发酵技术中的关键技术目前中药发酵技术无论在基础理论方面还是在方法上的研究仍处于起步阶段，对单味药材发酵和传统复方发酵开发得都很少，故少有投入生产的发酵新药。同时中药发酵技术也面临一些问题，如中医药自身体系的模糊性、中药成分的复杂性、中药发酵机理的不明确性、微生物生长特性的多样性以及在中药发酵过程中如何贯彻中医理论的指导等。因此，对中药发酵关键技术的正确把握关系到其发展方向和前景，笔者认为，今后以下几方面的工作有待深入研究。#）中药发酵机理：目前微生物发酵中药的机理已有一些基础和推断，但由于中药化学成分的复杂性和作用机理的不明确性，中药的有效成分、一些非有效成分及特殊的基质环境与微生物的相互 作 用 尚 有 待 研究；针对具体的中药及复方，明确其发酵作用机理，揭示发酵中药的科学内涵，其发酵体系的特点和作用机理仍待进一步研究。!）中药发酵共性技术：加强对单味中药、中药提取物、中药复方发酵技术、微生物培养的系统研究，并进行成分的分离、鉴定和相关药理试验，明确微生物的性质以及变化过程，建立起统一的能应用于大多数中药发酵的通用方法与共性技术体系，为实现发酵中药的现代化、科学化、国际化提供新的途径和方法。(）优良菌种选育技术：菌种的选育是中药发酵的关键和基础。因此，应该加大发酵菌种的选育和评价工作，使更多优良的菌种能够最大限度作用于中药，从而为更多有价值的发酵中药产品的研制奠定基础。-）现代复合微生物发酵技术：多菌种发酵较单一菌种发酵具有更强的生物转化能力，但也是发酵研究的难点。传统中药发酵多是自然界混合菌种天然发酵的结果，因那时人们并不知道微生物和发酵的关系，从而很难人为控制发酵过程。如何应用现代微生物工程的相关技术，进行中药多菌种发酵，提高发酵生产的可控性、稳定性，提高发酵中药的有效性和安全性，是进行现代发酵中药研究的又一关键技术。*）发酵中药筛选模型和多维评价体系：中药具有品种多样性、化学成分复杂性、药效作用多向性的特点，中药复方具有整体性、系统性、复杂性、非加和性等特点。因此，中药及其复方在发酵过程中如何遵循中医药理论的指导，进行发酵后选用何种评价指标和评价模型，建立发酵中药筛选模型和多维评价体系，是发酵中药研究的又一技术难点。#结语中药现代化研究已是一个医药、生物等众多学科关心的课题。发酵中药是现代生物技术和中药研究的完美结合，在中药新药研究开发中占有越来越重要的位置。发酵中药也必将在中药现代化进程中表现出强大的生命力，为提高我国中药行业的国际竞争力，使中药走向世界，造福人类做出新的贡献。作者简介：傅超美（#0$! ），男，教授，博士生导师，主要从事中药新制剂、新工艺与新剂型的研究，6 电子信箱 78,9:;? #!$3 8:;；冷静（#0)0 ），女，博士研究生，研究方向为中药新制剂与新剂型，本文通讯作者，6 电话 7/!. $#./#$*$ 6电子信箱 7ABACDB=CD E=C93 8:;。参考文献： # %刘少琴，赵紫华，马彩霞，等3药用真菌液体发酵培养的研究进展F % 3中国现代中药，!/$，. 6 ) 7 5 !. (#，(*3 ! %孙东平，潘 锋，史小丽，等3灵芝菌发酵培养基的优化及灵芝胞外多糖的分离纯化F % 3中草药，!/，(# 6 #! 7：0-#3 ( %邓百万，陈文强3云芝液体培养及富集硒研究 F % 3氨基酸和生物资源，!/，! 6 - 7：!# !-3 - %李少萍，季 萍3天然发酵培养冬虫夏草中核苷类成分的含量及其变化F % 3药学学报，!/#，($ 6 $ 7：-($3 * %裘娟萍，孙培龙3灰树花深层发酵工艺的研究 F % 3微生物学通报，!/#，!. 6 ( 7：( (*3 $ %谭周进，谢达平，王 征，等3蜜环菌胞外多糖的发酵条件研究F % 3微生物学通报，!/!，!0 6 ( 7：( ()3 ) %胡斌杰，王方林，赵 平3金针菇深层培养获得多糖的最佳发酵条件研究F % 3安徽农业科学，!/)，(* 6 #/ 7 5 ! .-! ! .-(，! .*)3 . %林翔鹰，党俊梅，马凯峰，等3香菇液体菌种深层发酵的研究F % 3食用菌，!/$，!. 6 # 7 5 #- #$3 0 %陈 敏，蒋予箭，严燕姣，等3姬松茸液体发酵条件的研究F % 3浙江工商大学学报，!/$，(5 *) $/3药学专论中国药业!#$% &%(%)*+,#)%-.!#年第$%卷第$&期 #$ %李 羿，万德光，裴 瑾&茯苓液体发酵条件的研究 % &成都中医药大学学报，($)，(* + # ,：)( - )& # %庄 毅&菌质 中药的一个新领域% &中药新药与临床药理，#.(，* + ( , / 0.& #( %庄 毅&应用药用真菌新型固体发酵工程技术研制中药一类新药的建议 % &中药新药与临床药理，#.)，1 + 0 , / 0#& #! %王玉红，丁重阳，徐 鹏，等&中药黄芪对发酵生产灵芝多糖的影响 % &食品与生物技术学报，($)，(0（(）：!*& #0 %尤建良，赵景芳，章克昌，等&发酵型中药生物制剂“康复灵”抑瘤实验研究 % &实用临床医药杂志，($)，. + * ,：01 - 02& #) %王贞佐，呼海涛3张 锐，等&中药对冬虫夏草发酵的影响 % &食品科技，($1，!# + ( , / *& #1 %任莉颖，刘 康，李宏婧&发酵炮制对红花抗氧化活性的影响 % &中华临床医学杂志，($)，1（*）/ 02& #2 %李国红，沈月毛，王启方3等&发酵三七中的皂苷成分研究 % &中草药，($)，!1（0）/ 0.& #* %王和英&五倍子的发酵炮制 % &基层中药杂志，($，#0（0）/ 0$& #. %小桥恭一&中药有效成分与肠道细菌的关系 % &医学与哲学，#.)，#1（#）：).*& ($ %田天丽，王 嫱，王永宏3等&虎杖的微生物发酵转化及其发酵产物提取分离的研究 % &天然产物分离，($1，0 + 0 ,：# - 0& (# %薛慧玲，徐萌萌，阳 泰3等&黄芩微生物发酵产物的分离提取 % &天然产物分离3 ($)，! + ) ,：) - 2，#&!收稿日期：#$ % #& % # (蛇毒是一种具有不同生物活性的蛋白质和肽类的复杂混合物3相对分子质量在1 4 #$!5 #$ 4 #$!之间。蛇毒蛋白根据结构特点可归为以下几个蛋白质超家族：丝氨酸蛋白酶家族、金属蛋白酶家族、磷脂酶6(（786(）家族、凝集素家族、富含半胱氨酸蛋白质家族和三指毒素家族。其中很多成分已用于疾病的诊断和治疗，如! -银环蛇毒素可用于诊断重症肌无力及治疗顽固性神经痛、肌萎缩性侧索硬化症和复发性疱疹性角膜损伤等 # %，蛇毒类凝血酶可有效治疗血栓栓塞性疾病等 ( %。蛇毒蛋白的主要来源是捕蛇取毒后进一步分离纯化，这样获得的蛇毒蛋白成本高、周期长、质量难以控制，长期下去还会耗竭生物资源，破坏生态平衡。而且同种蛇毒的产地不同，其成分和作用就有可能不同，从而影响疗效的评价。生物工程技术的纵深发展使蛇毒蛋白的规模化生产成为可能，而且可以根据不同的目的对天然蛇毒蛋白基因进行改造。早在#.)年，美国、法国和英国的科学家联合克隆并表达非洲绿眼镜蛇毒素基因，获得了几种具有与天然蛇神经毒素同样毒性的神经毒素 ! %。随后陆续不断有用生物工程方法生产蛇毒蛋白的报道。尽管蛇毒蛋白基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫及哺乳动物细胞3但大肠杆菌仍是应用最广泛的蛇毒蛋白基因表达工具。现将蛇毒蛋白基因的大肠杆菌表达策略作一介绍。&蛇毒蛋白目的基因的获取方法! !从#$%&文库中获得蛇毒9:;6文库包含了毒腺中全部的?ABCD EF?A ,从9:;6文库中筛选出含目的基因的克隆3然后利用聚合酶链反应（7G=）方法扩增出目的基因。! 利用反转录(聚合酶链反应（)* ( +,)）技术获得将蛇毒腺细胞破碎提取总=;63以总=;6为模板反转录为9:;63利用7G=方法3以9:;6为模板扩增出目的基因。毒蛇的种类繁多，蛇毒蛋白成分及含量随蛇种而异，即使是同一种蛇，受地区分布和周围环境的影响，蛇毒蛋白成分的=;6在毒腺细胞总=;6中的比例或丰度也会存在差异。从9:;6文库中扩增和利用=H - 7G=技术获得目的基因均受=;6丰度的影响。目的蛋白的=;6在毒腺细胞中的拷贝越多，扩增出的目的基因就会越多，而低丰度的=;6会增加扩增的难度。从中华眼镜蛇毒腺9:;6表达文库中成功扩增了细胞毒素（GHI - !）和786(基因的9:;6，证实了GHI - !和786(=;6在中华眼镜蛇毒腺中丰度较高，GHI - !和786(在中华眼镜蛇粗毒中含量丰富 0 %。! -人工合成在已知天然蛇毒蛋白全序列的情况下3根据大肠杆菌简并密码子的嗜好性可人工合成目的基因。对于小片段+小于0$ EJ ,的基因，采取互补链全部合成，先对合成的寡核苷酸片段进行磷酸化，通过混合、退火实现正确匹配，再经连接酶连接相邻片段的!K和)K端而完成拼接过程。但基因序列长度在2$ EJ以上时，全基因合成不仅成本高，而且不容易控制好数目增多的寡核苷酸链的正确退药学专论蛇毒蛋白基因的大肠杆菌表达