植物病原真菌对内吸性杀菌剂的抗药性研究进展.doc

植物病原真菌对内吸性杀菌剂的抗药性研究进展作者：祝明亮 罗义勇 李梅云 杨金奎 张克勤来源：烟草农业科学摘 要：植物病原真菌的抗药性特别是对内吸性杀菌剂的抗药性是植物病害化学防治中的一个非常严重的问题，它给多种农作物和经济作物的病害防治带来了严重困难，给国家和农民造成了大量经济损失。研究植物病原真菌抗药菌的生物学特征以及它们的抗药机制对于改进化学农药使用策略，延缓抗药性的产生，推进植物病害的化学防治，具有十分重要的理论和实践意义。本文综述了近年来国内外植物病原真菌对内吸性杀菌剂抗药性研究在抗性菌和敏感菌的生物学特征、内吸性杀菌剂对植物病原真菌的作用机制、植物病原真菌对内吸性杀菌剂的抗药机制、抗性菌株的分子检测技术以及抗药性利用等方面的成果。关键词：植物病原真菌；内吸性杀菌剂；抗药性；研究进展植物病原真菌对杀菌剂的抗药性是指本来对药剂敏感的植物病原真菌，由于基因突变或其它原因出现了药物敏感性下降的现象。尽管早在1954年James等1就提出了这一现象，但是这一问题直到20世纪60年代末才引起人们真正重视。1969年，由于内吸性杀菌剂苯来特（Benomyl）在生产上大量地使用，首先在黄瓜白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）上产生了抗药性，随后又在其它几十种病原真菌上产生了抗药性，并且有越来越严重的趋势。到目前为止，用于防治植物病原真菌的杀菌剂种类已经很多，与抗药性问题关系密切的有有机硫杀菌剂、内吸性杀菌剂和抗菌素类杀菌剂，特别是内吸性杀菌剂的抗药性问题最为严重。由于杀菌剂抗药性问题的迅速出现和发展，给植物病害的防治带来了越来越大的困难，给农业造成了重大的经济损失，引起了世界各国政府和农民的普遍关注。为了有效防止或延缓杀菌剂抗药性的产生，许多国家和地区相继开展了对杀菌剂的抗药性研究。人们首先对敏感菌和抗药菌的生物学特征进行了大量的对比研究，试图在此研究的基础上发现抗性病原真菌的抗药机制，最终来指导农药的合理使用和病菌的有效防治。经过大量研究人员的辛苦努力，在植物病原真菌对杀菌剂抗药性问题的研究上，尤其是对内吸性杀菌剂的研究上，目前已取得了较大的进展。1. 抗性菌和敏感菌的生物学特征对比抗性菌生物学特征即抗性菌的越冬、越夏、生长、繁殖和对环境的适应力等方面的特征。许多情况下，抗性菌由于遗传变异等原因，在生物学特征上表现出与敏感菌有所不同，如在菌丝生长、产孢、与温度或渗透压的关系、致病力等方面的差异，这些差异影响着抗性菌在自然界与敏感菌的竞争力。当抗性菌的竞争力强时，比较容易形成抗药性群体；反之，只要降低选择压力，就不易形成抗药性群体。此外，有些抗性菌对同类或不同类的杀菌剂具有交互抗药性或负交互抗药性。因此，人们可以根据抗性菌的特点，判断合理的用药策略，延缓或阻止抗药性群体的形成。1.1 菌丝生长、产孢、孢外酶活力和致病力等方面的差异据研究报道，大多数抗药性病原真菌突变的适合度低于敏感菌。抗药性菌株表现出菌丝生长速率慢，产孢量和产孢密度低，孢子萌发能力弱且滞后，孢外酶活力低，致病力弱，甚至完全失去致病力等特征2，3。然而并不是所有的抗药性菌株的适合度都低于敏感菌，有些抗药性菌株具有很高的适合度，与野生敏感菌没有差异，甚至比敏感菌还高。纪明山等研究灰霉病菌（Botrytis cinerea）对多菌灵（Carbendazim）和乙霉威（Dithofencarb）抗药性时，发现抗药菌与敏感菌在生长速率、产孢能力及致病力等方面无显著差异4。徐作珽等报道蔬菜灰霉病菌对速克灵（Procymidone）的抗性突变体表现出较强的适应性，能正常生长繁殖产孢和侵染致病，且生存竞争能力较敏感菌强5。我们在CA平板上测定烟草黑胫病菌对甲霜灵高抗、低抗和敏感菌株生长速率时发现，高抗菌株的生长速率较低抗和敏感菌株更快，而且高抗菌株仍然保持了较高水平的致病力。1.2 交互抗药性与负交互抗药性交互抗药性是指植物病原真菌对一种杀菌剂产生了抗药性，而对另一种从未使用过但作用机制相似的药剂也产生了抗药性的现象。与交互抗药性相反，负交互抗药性是指植物病原真菌对某种杀菌剂产生了抗药性，而对另一种从未使用过的药剂敏感性更强的现象。交互抗药性和负交互抗药性在同类或不同类的杀菌剂之间普遍存在6，7。1.3 多效性多效性是指抗药菌的抗性基因可以同时引起其它的性状，如对低温、高温或渗透压的敏感性。Thomas等在研究酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）对苯来特的抗药性时，发现在173个抗性菌株中，有6个菌株对低温敏感，3个菌株对生长温度敏感8。在研究植物病原真菌对二甲酰亚胺类杀菌剂（Dicarboximides fungicide，DCFs ）的抗药性时，粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）os-1型渗透压突变菌表现出对DCFs的抗药性9。2. 内吸性杀菌剂的作用机制与植物病原真菌的抗药机制内吸性杀菌剂是指能在植物发病后，通过内吸或渗透作用进入植物体内，抑制或杀死病原菌，使病株不再受害、恢复健康的药剂，主要有以下几类：苯并咪唑类（Benzimidazoles），二甲酰亚胺类， 有机磷类（Organophosphates），苯酰胺类（Phenylamides），甾醇生物合成抑制剂类(Sterol Biosynthesis Inhibitors，SBIs )和甲氧基丙烯酸酯类(Strobilurins)（表 1）。表 1 内吸性杀菌剂的种类、杀菌机制及病原菌抗药机制种类代表性药剂杀菌机制病原菌抗药机制苯并咪唑类多菌灵、苯来特、特克多和甲基托布津结合病菌的-微管蛋白，阻碍细胞的正常有丝分裂-微管蛋白的192-202个氨基酸发生基因突变二甲酰亚胺类乙烯菌核利、速克灵、菌核净和扑海因自由基介导的细胞毒假说双组分组氨酸蛋白激酶N端的6个90氨基酸重复区发生突变有机磷类磷酰胺类：定菌磷抑制真菌对氧分子的吸收不常见硫代磷酸酯类：稻瘟净、异稻瘟净和克瘟散破坏菌体生物膜的结构 裂解药剂“S-C”键以致失去生物活性； 可能与药剂靶点修饰或细胞膜透性改变有关苯酰胺类甲霜灵、苯霜灵、恶霜灵和甲呋酰胺干扰核酸的合成单基因变异甾醇生物合成抑制剂类DMIs：三唑类、咪唑类和嘧啶类抑制甾醇14-脱甲基酶P450的活性 ABC运输体基因过量表达，将SBIs 杀菌剂泵出病原菌； CYP51基因发生点突变或表达水平的上升； 14还原酶的过量生成或对药物亲和性的降低； 菌体通过代谢解除DMIs杀菌剂的毒性87异构酶及14还原酶抑制剂：吗啉类和哌啶类抑制87异构化酶或14还原酶的活性甲氧基丙烯酸酯类嘧菌酯、醚菌酯、苯氧菌胺和肟菌酯干扰病原菌能量的合成细胞色素b基因发生突变2.1 苯并咪唑类苯并咪唑类杀菌剂是最早也是最成功的内吸性杀菌剂，由于该类杀菌剂大量和长期的使用，病原真菌对它的抗药性问题越来越严重。在真菌对杀菌剂抗药机制的研究中，真菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药机制的研究最系统、最深入。该类杀菌剂的杀菌机制为：首先结合构成纺缍丝的微管蛋白，使微管的形成受阻，从而破坏纺缍丝的功能，阻碍细胞的正常有丝分裂，使菌株不能正常的生长。研究表明，不同病原真菌对苯并咪唑类杀菌剂抗性的主要机制是病原真菌的-微管蛋白与该类杀菌剂的结合力下降，而杀菌剂同微管蛋白的亲和性的改变又与-微管蛋白的结构变化有关。分子生物学研究表明，在抗药菌-微管蛋白的192-202个氨基酸上会发生基因突变，这类突变会导致-微管蛋白的三维构象发生变化，从而阻止药剂与-微管蛋白的结合，使病原真菌产生抗药性。对田间抗药菌研究表明其突变位点主要集中在氨基酸的198 位和200 位10，其它位点上的突变往往导致竞争力的减弱，因而在田间不易出现。但玉蜀黍赤霉菌（Gibberella zeae）11和马铃薯干腐病菌（G. pulicaris）12对苯并咪唑类杀菌剂抗性菌的-微管蛋白基因并没有发生改变，说明在不同病菌中或者在镰刀菌中对该类药剂发生抗药性突变的位点不同。2.2 二甲酰亚胺类二甲酰亚胺类杀菌剂是20世纪70年代初推出的一类广谱性杀菌剂。随着这类杀菌剂的大规模使用，很多植物病原真菌都对其产生了抗药性。这类杀菌剂对真菌的孢子萌发、菌丝生长均有抑制作用，导致菌体形态改变，菌丝顶端产生了不正常的分枝和肿胀。另外，在该类杀菌剂的处理下，病原真菌细胞内的甘油，过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等内源物的水平会显著提高。关于DCFs作用于病原真菌的机制，Lyr在1987提出了一种假说自由基介导的细胞毒假说。该假说认为DCFs诱导菌体产生还原态的氧自由基，从而攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，引起细胞膜脂质的过氧化反应，最终导致包括改变细胞膜通透性等一系列破坏细胞的连锁反应13。关于这一假说是否成立，还存在着不同的观点。而真菌对该类杀菌剂的抗药机制，还没有得到确切的结果。目前，研究者们普遍认为是这些病原真菌细胞内的双组分组氨酸蛋白激酶N端的6个90氨基酸重复区的突变介导着对该类杀菌剂的抗药性（图 1）14。根据抗药菌株同时具有对渗透压敏感的特征9，研究者们克隆了很多真菌的双组分组氨酸蛋白激酶基因，并且发现：抗药菌的N端6个90氨基酸重复区中存在着碱基的突变或缺失，从而造成氨基酸或开放阅读框的改变，所以该氨基酸重复区的突变可能是抗药性产生的原因15，16。但植物病原真菌对DCFs产生抗药性的机制，还需要更进一步的研究。图 1 双组分组氨酸蛋白激酶结构示意图2.3 有机磷杀菌剂有机磷杀菌剂是指在化学结构中含有“C-P”键的抗菌化合物，根据它们的抗菌谱可分为两类：防治白粉病的磷酰胺类（Phosporothionate）和防治稻瘟病的硫代磷酸酯类（Phosphorothiolate）。 关于这两类杀菌剂的杀菌机制，研究表明，两者各不相同。磷酰胺类杀菌剂的作用机制以定菌磷（Pyrazophos）为例。定菌磷在菌体内能够进一步转化成一种更毒的分子，6-乙氧基羰基-5-甲基吡唑基并1，2a嘧啶（pp），从而抑制真菌对氧分子的吸收。硫代磷酸酯类杀菌剂的作用机制以异稻瘟净（Iprobenfos）为例。异稻瘟净的分子结构与菌体内磷酯酰乙醇胺（PE） 相似，可以替代PE 接受-腺苷高半胱氨酸提供的甲基，阻止PE转化为磷酯酰胆碱， 破坏菌体生物膜的结构，抑制菌体生长。关于磷酰胺类杀菌剂的抗药性还很少见，到目前为止只在黄瓜白粉病菌中发现对定菌磷的抗性菌株，而关于硫代磷酸酯类杀菌剂的抗药性，研究认为，室内获得的稻梨孢菌（Piricularia oryzae）高抗突变体的抗药机制是裂解药剂“S-C”键以致使其失去生物活性。高抗菌一般生存竞争能力较低，所以在自然界很少发生。田间产生的中抗菌的抗药机制可能与药剂靶点修饰或细胞膜透性改变有关。2.4 苯酰胺类苯酰胺类杀菌剂是防治霜霉目真菌的专用药剂，具有显著的保护、治疗和铲除作用，广泛应用于马铃薯和番茄晚疫病的防治。由于该类杀菌剂对病菌作用位点单一，因而很容易导致病菌产生抗药性。由于抗药性产生而导致药效降低的事例已屡见不鲜。该类杀菌剂在寄生组织内抑制菌丝生长和吸器形成，但不影响病原菌孢子囊的直接和间接萌发以及游动孢子的萌发17。关于该类杀菌剂的作用机制，研究结果表明，它们是通过阻止尿苷掺入RNA来干扰核酸的合成（特别是-RNA 的合成）来实现的。多种病原真菌试验结果表明并不是全部的RNA合成受阻。通过研究发现， 该类杀菌剂对合成细胞内核苷酸的三种RNA聚合酶有选择性抑制作用，其中对合成-RNA的聚合酶A的毒力最大，使核糖体不能正常工作。关于不同真菌对苯酰胺类杀菌剂的抗性遗传机制，许多实验结果表明是属于单基因变异。通过对莴苣霜霉病菌（Bremia lactucae）、致病疫霉（Phytophthora infestans）和寄生疫霉（P. parasitica）等的研究发现，对苯酰胺类杀菌剂的抗性是由单个主效基因控制的，其中在莴苣霜霉病菌和致病疫霉中，抗性基因为不完全显性。此外，有人在研究致病疫霉对甲霜灵抗性的遗传机制时，发现各个供试菌株对甲霜灵抗性除了主要由单个不完全显性主效基因决定外，还受到修饰基因和细胞质基因的影响18，19；而在寄生疫霉中抗性则是完全显性的20。2.5 甾醇生物合成抑制剂类甾醇生物合成抑制剂是19世纪六七十年开发的一大类系统性杀菌剂，由于具有杀菌谱广，施药量低和药效期长等优点而迅速发展并被广泛应用于农业与医学领域中。甾醇生物合成抑制剂根据作用方式不同可分为两类：第一类是14-脱甲基反应抑制剂（14-demethylation inhibitors，DMIs）。它们作用于病原真菌的机制是通过本身杂环上的氮原子与甾醇14-脱甲基酶P450（在真菌中称CYP51）的血红素铁活性中心以配位键结合，从而抑制酶的活性，进而阻碍麦角甾醇的合成，导致真菌细胞膜结构破坏和细胞死亡。第二类是87异构酶及14还原酶抑制剂。它们作用于病原真菌的机制是通过模拟反应的碳正离子过度态，竞争性地抑制异构化酶或还原酶的活性。真菌对SBIs类杀菌剂的抗药机制相当复杂，很难简单地以一种模式来解释。许多实验结果表明，病原真菌对SBIs 杀菌剂的抗药机制主要有以下几种： ABC（ATP-binding cassette transporters ）运输体基因过量表达将SBIs 杀菌剂泵出病原真菌21； CYP51 基因表达水平的上升或因点突变导致酶与药剂亲和性的下降22； 14还原酶的过量生成或对药物亲和性的降低23； 菌体通过代谢解除DMIs杀菌剂的毒性24。2.6 甲氧基丙烯酸酯类甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是一类低毒、高效、广谱、内吸性杀菌剂，它是以strobiurinA为先导化合物研制的一类新型杀菌剂。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是通过干扰病原真菌的呼吸作用来发挥杀菌作用的，它是一种真菌细胞色素bc1呼吸抑制剂，其作用于病原真菌的机制如下：它与位于线粒体内膜外壁Q0位点的细胞色素b低势能血红素结合，阻断电子传递，从而干扰能量合成而发挥抑菌作用。由于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂作用靶标的特异性，所以这类化合物与二甲基亚胺类、苯并咪唑类和DMIs等杀菌剂不存在交互抗药性，所以被广泛用来防治对苯并咪唑类等内吸性杀菌剂产生抗药性的菌株。然而尽管该类杀菌剂作用机制独特，但病原真菌对其产生抗药性的速度也很快，如醚菌酯（Kresoxim methyl）在实际应用1年后就有关于小麦白粉病（Blumeria graminis）抗药性发生的报道。关于病原真菌甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的抗药机制，在很多病原真菌中，证明了与其细胞色素b的突变有关。人们克隆了很多真菌的细胞色素b基因，发现抗药菌的细胞色素b基因上的两个区域会发生突变，造成QO中心位置上的127-147和275-296这两个区域氨基酸的改变25-26。此外，还有人报道，在V. inaequalis中，细胞色素b基因没有发生改变，推测可能是在其它位点发生了突变27。3. 抗药菌的分子检测技术抗药菌检测的传统方法是通过将病原菌接种到含药培养基，或含药的植物或植物组织上，然后计算菌落直径，植物或植物组织发病率来实现的。如果要检测很多样品的抗性情况时，传统方法是既耗时又耗劳动力的。大量植物病原真菌抗药机制的研究结果显示，绝大多数抗性是由基因突变介导的。于是，随着分子生物学的发展，一些分子检测技术已经成功应用到抗药性的检测上。这些技术主要包括：PCR和PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）等。 PCR：应用PCR技术扩增出与抗药性相关的基因，比较不同菌株的这些基因的核苷酸序列，就可从分子水平检测出某一特定植物病原菌是否发生了抗药菌。 PCR-RFLP：该技术是基于有些抗性突变会使酶切位点发生改变而应用于抗药性检测的。该技术首先是应用PCR技术扩增出与抗药性相关的基因，然后用特定的酶去切PCR扩增产物，最后通过电泳检测，就可以发现哪些菌株发生了抗性突变。与传统的抗性检测方法相比，分子检测技术具有快速、省力和可靠的优点，具有非常广阔的应用前景，会是将来抗性菌筛选的主要方法。4. 抗药性的利用在许多人的心目中，抗药性是一个对化学防治产生很大威协的严重问题。因此，人们的注意力只集中在它的消极方面，而在很大程度上忽视了抗药性可以利用的一面。实质上，抗药性有两个方面可以利用：一是负交互抗性的利用，二是抗药性基因的利用。4.1负交互抗性的利用目前，将负交互抗性应用于实践的主要是N-苯基氨基甲酸酯类杀菌剂、Nphenylformamidoximes化合物与苯并咪唑类杀菌剂的负交互抗性。1987年，法国首先生产出N-苯基氨基甲酸酯类杀菌剂Diethofencarb和多菌灵混合剂，用于防治葡萄灰霉病菌的苯并咪唑类抗性菌。另外，利用N-苯基氨基甲酸酯类杀菌剂和N-phenylformamidoximes化合物来防治Venturia nashicola、G. fujikuroi、Monilinia furcticola等的苯并咪唑高抗菌，已经非常普遍了。4.2 抗药性基因的利用利用基因工程技术，将抗药基因转入生防真菌中，使化学农药和生物农药综合防治成为可能。例如：Goettel等将抗苯来特的- 微管蛋白基因（benR）导入绿僵菌（Metarrhizium anisopliae）中得到抗苯来特的转化子，其抗性比原来受体菌株的提高了10倍 28 ，从而为绿僵菌与杀真菌剂苯来特混合使用更有效地杀灭害虫提供了可能。杨谦等将酿酒酵母多菌灵抗性基因成功转化到木霉菌（Trichoderma harzianum）中，转化后的木霉菌能在含150g/ mL多菌灵的培养基上正常生长，且其抗药性在非选择性培养基上连续培养10 代保持不变 29。5. 问题与展望植物病原真菌抗药性的日益严重，引起了各国学者的高度重视。因为开发化学杀菌剂的难度越来越大，开发成功率越来越低，开发费用越来越高，且开发新农药的速度落后于病原真菌的抗药性发展速度，于是研究者们普遍把注意力集中在对杀菌剂作用机制及抗药机制的了解和研究上，在此基础上，可以采取相应的抗药性治理措施，延缓病原真菌对药剂产生抗药性的速度，避免抗药性给农业带来的巨大损失，同时避免因农药的大量使用对人类的生存环境和自然界生态平衡造成的不良影响。目前，关于病原真菌对杀菌剂抗药性的研究已经取得了一些进展，特别是关于病原真菌对内吸性杀菌剂抗药机制的研究，已经深入到基因水平，但这仅仅是解决抗药性问题的开始，因为，杀菌剂对病原真菌的抗药性，其实质是病原真菌对农药等外界胁迫环境的一种适应，其中涉及很多信号转导途径，研究病原真菌的抗药机制，并不是克隆几个基因，找出几个靶标蛋白，就可解决的问题。今后研究的重点应是寻找抗药菌和敏感菌在分子生物学水平上更多的差异性，进而确定与抗药性直接相关的基因、蛋白和调控途径，这其中包括基因与基因、蛋白质与蛋白质之间的相互作用，要从本质上克服因病原真菌抗药性问题给农业带来的损失，需要生物学与其它学科，如化学和计算机科学等的共同发展合作。另外，在抗药性的研究中，不能把注意力仅仅集中在抗药性的有害一面，要充分利用抗药性有用的一面。比如，运用分子生物学方法，改造生物防治菌，解决生物防治菌的化学杀菌剂敏感的问题，真正做到用化学农药和生物农药来综合防治植物病原真菌。参考文献1. James， G.H.， Saul， B.R.， 1954. Relation of polyphenol oxidases to fungitoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 40：139-145.2. 潘以楼，汪智渊，吴汉章， 1997. 水稻恶苗病菌（Fusarium moniligforme）对多菌灵不同抗性菌株的菌丝生长、产孢和致病力差异. 江苏农业学报. 13（2）：90-93.3. 石志琦，周明国，叶种音， 2000. 油菜菌核病菌对多菌灵、菌核净抗药性菌株性质研究. 中国油料作物学报. 22（4）：54-57.4. 纪明山，程根武，张益先等， 1998. 灰霉病菌对多菌灵和乙霉威抗性研究. 沈阳农业大学学报. 213：213-216.5. 徐作珽，李林，于建垒等， 1999. 蔬菜灰霉病菌对速克灵抗药性变异研究. 山东农业科学. 2：30-33.6. Zhou， M.G.， Ju， L.H.， Lu，Y.J.， 1993. Resistance of Gibberella fujikuroi to benzimidazoles. ICGEB practical course 1993 proceedings. 93-95.7. Jones， A.L.， Shabi， E.， Ehret， G.R.， 1987. Genetics of negatively correlation cross-resistance to an N-phenylcarbamate in benomyl-resistant Ventrria inaequalis. Canadian Journal of Plant Pathology. 9(3)：195-199.8. Thomas，J.H.，Neff，N.F.，Botstein， D.， 1985. Isolation and characterization of mutations in the tublin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 112：715-734.9. Grindle， M.， 1982. Fungicide-resistance of os mutants of Neurospora crassa. Neurospora Newslett. 29：16-17.10. Koenraadt， H.， Somerville， S.C.， Jones， A.L.， 1992. Characterization of mutations in the beta-tubulin gene of benomyl-resistant field strains of Venturia inaequalis and other plant pathogenic fungi. phytopathology. 82(11)：1348-1354.11. 陆悦健， 周明国，叶钟音等， 2000. 抗苯并咪唑的小麦赤霉病菌-tubulin基因序列分析与特性研究.植物病理学报. 30(1)：30-34.12. Kawchuk， L.M.， Hutchison， L.J.， Verhaeghe， C.A.， et al.， 2002. Isolation of the -tubulin gene and characterization of thiabendazole resistance in Gibberella.pulicarisJ. Can. J. Plant Pathol. 24：233-238.13 Lyr， H. L.， 1987. Mechanism of action of dicarboximide fungicides. In H. Lyr (ed.)， Modern selective fungicides. Fisher Verlag，Jena. 75-89.14. Ian， B. D.， Khor， H. Y.， Hutton， D.G.， 2004. Dicarboximide resistance in field isolates of Alternaria alternatais mediated by a mutation in a two-component histidine kinase gene. 41:102-108.15. Cui， W.， Ross， E.B.， Matthew， D.T.， et al.， 2002. An osmosensing histidine kinase mediates dicarboximide fungicide resistance in Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea). Fungal Genetics and Biology. 36：187-198.16. Takayuki， M.， Kaori， K.， Tomohiro， O.， et al.， 2005. A two-component histidine kinase of the rice blast fungus is involved in osmotic stress response and fungicide action. Fungal Genetics and Biology. 42：200-212.17. 林孔勋主编， 1995. 杀菌剂毒理学M. 北京：中国农业出版社. 101-140.18. Fabritus， A.L.， Shattock， R.C.， Judelson， H.S.， 1997. Genetic analysis of metalaxyl in sensitivity loci in Phytophthora infestants using linked DNA markers. Phytopathogen. 87：1034-1040.19. Shaw， D.S.， Shattock， R.C.， 1991. Genetics of Phytophthora infestants：The Mendelian approach. In Phytophthora pp. 218-230 British Mycological Society，Cambridge Univ. Press，Cambridge.20. Chang， T.T.， Ko， W.H.， 1990. Resistance to fungicide and antibiotics in Phytophatora parasitica：genetic nature and use in hybrid determinationJ.Phytopathology. 80：1414-1421.21. Nakaune， R.， Adachi， K.， Nawata， O.， et al.， 1998. A novel ATP-banding cassette transporter involved in multidrug resistance in the phytopathogenic fungi Penicillium digitatum. Appl and Environ Microbio. 64：3983-3988.22Edlind， T.D.， Henry， K.W.， Metera， K.A.， et al.， 2001. Aspergillus fumigatus CYP51 sequence：potential basis for fluconazole resistance. Med Mycol. 39：299-302.23. Falandre， A.L.D.， Debieu， D.， Bach， J.， et al.， 1999. Mechanisms of resistance to fenpropipropimorph and terbinafine，two sterol biosynthesis inhibitors in Nectria haematoc