植物NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒.doc

GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS50096.3 v.AGENMED植物NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED植物NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）的特异活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。技术背景NADPH氧化酶，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或还原型辅酶II氧化酶，是机体防御机制中的重要元素。NADPH氧化酶由6个亚体构成：Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase）和5个phox（吞噬细胞氧化酶；phagocytic oxidase）。其中主要包含细胞膜嵌合蛋白质分子（gp91phox、p22phox、flavocytochrome b558等），以及位在细胞质内的蛋白质分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其最特征性的酶活性是超氧化物歧化酶敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。细胞膜上的NADPH氧化酶被激活，将还原型辅酶（NADPH）转变为氧化型辅酶（NADP），氧分子则获得电子形成超氧阴离子O2-，由O2-又可生成H2O2和OH。植物有氧代谢（呼吸、光合成等）过程中具有活性氧信号调节作用的NADPH氧化酶，与哺乳动物的gp91phox等同源。NADPH氧化酶在植物细胞（根部、下胚轴hypocotyl、毛状体trichome等）生长、植物发育（尖端生长根毛tip growing root hairs、花粉管pollen tube等）具有重要作用，同时调节细胞壁松软、植物免疫、非生命性应急反应和适应的功能。基于底物还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），在特异性抑制剂联苯基三价碘（diphenyleneiodonium；DPI）的存在下，受到NADPH氧化酶的催化作用，转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP），产生吸光峰值的变化，通过分光光度仪（340nm波长）检测，来测定NADPH氧化酶的特异活性。其反应方式为： NADPH OxidaseNADPH + O2 + FAD NADP + FADH2 + O2 产品内容GENMED清理液（Reagent A） 30毫升GENMED裂解液（Reagent B） 5毫升GENMED缓冲液（Reagent C） 20毫升GENMED反应液（Reagent D） 2.5毫升GENMED阴性液（Reagent E） 2毫升GENMED底物液（Reagent F）500微升GENMED专性液（Reagent G） 200微升产品说明书 1份保存方式保存GENMED清理液（Reagent A）和GENMED阴性液（Reagent E）在4冰箱里，其余的保存在在20冰箱里，避免反复冻融；GENMED反应液（Reagent D）和GENMED底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月用户自备15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器4（微型）台式离心机：用于样品处理恒温培养箱或恒温水槽：用于反应物孵育比色皿：用于比色测定的容器分光光度仪：用于比色分析实验步骤 实验开始前，将20冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；GENMED反应液（Reagent D）和GENMED底物液（Reagent F）注意避光。然后进行下列操作。一、样品准备1 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量 2 （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管3 （选择步骤）加入3毫升GENMED清理液（Reagent A）清洗1次4 即刻用刀片切碎组织5 放进一个预冷的15毫升锥形离心管6 加入预冷的1毫升GENMED裂解液（Reagent B）7 涡旋震荡5秒，充分混匀8 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）9 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）10 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管11 （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）12 即刻移入到1.5毫升离心管13 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）14 放进70的冰箱里保存或置于冰槽里备用二、测定准备1 从-70取出待测样品（例如植物裂解悬液样品等），置于冰槽里 2 设定好分光光度仪（温度为30）：波长为340nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零3 GENMED缓冲液（Reagent C）室温预热三、 背景对照测定1 移取780微升GENMED缓冲液（Reagent C）到新的比色皿2 加入100微升GENMED反应液（Reagent D）3 加入20微升GENMED底物液（Reagent F）4 放进30培养箱里静置3分钟5 加入100微升GENMED阴性液（Reagent E）6 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）7 即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：（340波长读数）0分钟（340读数）5分钟 四、 样品总活性测定1 移取780微升GENMED缓冲液（Reagent C）到新的比色皿2 加入100微升GENMED反应液（Reagent D）3 加入20微升GENMED底物液（Reagent F）4 放进30培养箱里静置3分钟5 加入100微升待测样品（注意：50至100微克植物裂解悬液蛋白；样品须溶解；参见注意事项5、11和12）6 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）7 即刻放入分光光度仪检测，此为样品总活性读数：（340波长读数）0分钟（340读数）5分钟五、 样品非特异活性测定1 准备1个1.5毫升离心管2 加入20微升GENMED专性液（Reagent G）3 加入100微升待测样品（注意：50至100微克植物裂解悬液蛋白；样品须溶解；参见注意事项5、11和12）4 放进30培养箱里静置5分钟5 放进冰槽里备用6 移取760微升GENMED缓冲液（Reagent C）到新的比色皿7 加入100微升GENMED反应液（Reagent D）8 加入20微升GENMED底物液（Reagent F）9 放进30培养箱里静置3分钟10 加入上述冰槽里的120微升含有GENMED专性液（Reagent G）和待测样品的溶液 11 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）12 即刻放入分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：（340波长读数）0分钟（340读数）5分钟六、计算样品活性1）样品总活性和非特异活性（样品读数背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数0.1（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）单位/毫升或微摩尔NADPH/分钟/毫升（样品蛋白浓度）毫克/毫升单位/毫克或微摩尔NADPH/分钟/毫克或者（样品读数背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数0.1（样品重量；毫克）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）单位/毫克或微摩尔NADPH/分钟/毫克2）样品特异活性样品总活性样品非特异活性样品特异活性注意事项1 本产品为21次（10个样本）操作，包括1次背景对照测定2 操作时，须戴手套3 GENMED反应液（Reagent D）和GENMED底物液（Reagent F）注意避光4 系统操作过程中，背景测定只需1次5 样品检测前，须溶解和澄清 6 加样后3秒内进行比色测定7 比色测定后，比色皿须清洗彻底8 样品0秒读数通常和背景空对照0秒读数一致9 反应测定值由高到低变化；测定持续5分钟10 测定值由高到低变化，表明有酶活性11 建议待测样本蛋白浓度为50至100微克/100微升；如果样本酶活性过低，则可以增加样本量（本公司提供GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）12 如果使用纯化目标蛋白，则蛋白浓度为1至5微克/100微升；如果使用纯化膜蛋白，则蛋白浓度为10微克/100微升13 样品实际活性是指联苯基三价碘（diphenyleneiodonium；DPI）敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，去除其它干扰因素 14 NADPH氧化酶活性单位浓度定义：在30室温下，pH 7.0的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）氧化1微摩尔的还原型辅酶（NADPH）15 本公司提供系列氧化酶类分析技术产品质量标准1 本产品经鉴定性能稳定2 本产品经鉴定检测准确使用承诺杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。友情提醒IF IT DOESNT WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。订购信息单组份订购信息编号名称规格GMS50096.3GENMED植物NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒20次GMS50096.3AGENMED清理液（Reagent A） 100毫升GMS50096.3B GENMED裂解液（Reagent B） 100毫升GMS50096.3CGENMED缓冲液（Reagent C） 100毫升GMS50096.3D GENMED反应液（Reagent D） 10毫升GMS50096.3E GENMED阴性液（Reagent E） 10毫升GMS50096.3FGENMED底物液（Reagent F）5毫升GMS50096.3G GENMED专性液（Reagent G）5毫升GMS30030.1GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒100次试剂盒订购信息产品编号名称规格GMS50095.1细胞NADPH氧化酶活性化学发光法定量检测试剂盒20次（10样本）GMS50095.2组织NADPH氧化酶活性化学发光法定量检测试剂盒20次（10样本）GMS50095.3植物NADPH氧化酶活性化学发光法定量检测试剂盒20次（10样本）GMS50095.4酵母NADPH氧化酶活性化学发光法定量检测试剂盒20次（10样本）GMS50095.5真菌NADPH氧化酶活性化学发光法定量检测试剂盒20次（10样本）GMS50096.1细胞NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒（细胞色素C法）20次（10样本）GMS50096.2组织NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒（细胞色素C法）20次（10样本）GMS50096.3植物NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒（细胞色素C法）20次（10样本）GMS50096.4酵母NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒（细胞色素C法）20次（10样本）GMS50096.5真菌NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒（细胞色素C法）20次（10样本）GMS50096.1细胞NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒（NADPH法）20次（10样本）GMS50096.3组织NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒（NADPH法）20次（10样本）GMS50096.3植物NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒（NADPH法）20次（10样本）GMS50096.4酵母NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒（NADPH法）20次（10样本）GMS50096.5真菌NADPH氧化酶活性比色法定量检测试剂盒（NADPH法）20次（10样本）联系我们关于订购详情或技术支持，欢迎来电、来函、传真或电邮GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A 大中华区上海分公司上海杰美基因医药科技有限公司上海市浦东新区张江高科技园区哈雷路1011号301室邮编：201203技术部电话：+86（021）51097356 X 101 市场部电话：+86（021）51097356 X 102；购电话：+86（021）51097356 X 104传真：+86（021）58559383Em