乌苏里蝮蛇蛇毒神经毒纯化与鉴定.doc

吉林大学生命科学院学士学位论文吉林省高等教育自学考试吉林大学生物制药专业本科毕业设计设计题目：乌苏里蝮蛇蛇毒神经毒纯化与鉴定 设计作者： 韩大伟 考 号： 010605100329 指导教师： 完成时间： 2009-8-10 吉林大学生命科学学院 二九 年 八 月 十 日目 录一 绪 论11蛇毒中的毒素及活性因子概述11.1作用于血液本身或各种血液成分的物质11.2影响血液循环物质21.3作用于横纹肌的物质21.4作用于平滑肌的物质21.5影响代谢的物质21.6改变血液中碱储备的物质21.7胞溶素21.8出血毒素21.9抑制因子31.10影响神经系统的物质32蛇毒神经毒素(neurotoxin，NT)的概述32.1分布32.2种类32.3结构及理化性质342.4药理性质43蛇毒神经毒素的镇痛特点53.1 起效慢，维持时间长，效价高53.2 无耐受和成瘾性64蛇毒神经毒素的镇痛机制研究64.1镇痛作用与毒性的关系64.2镇痛作用与痛觉调控相关方面的关系74.3与 NO 的关系。95蛇毒神经毒素的应用95.1作为检侧尼克酰胺型AchR的标记物105.2用于AchR的纯化105.3作为研究药物与受体相互作用的工具115.4作为研究AchR结构与性质的工具116蛇毒神经毒素的临床应用117本研究的目的12二 实验材料与方法141实验材料141.1试剂141.2仪器151.3小鼠152实验步骤与方法152.1纯化工艺条件摸索152.2乌苏里蝮蛇蛇毒神经毒素筛选策略202.3乌苏里蝮蛇蛇毒分离前的处理202.4 乌苏里蝮蛇蛇毒离子交换色谱202.5凝胶过滤色谱纯化神经毒素222.6神经毒素的鉴定23三 实验结果与讨论261蝮蛇毒中神经毒素的分离261.1乌苏里蝮蛇蛇毒离子交换色谱261.2凝胶过滤色谱纯化神经毒素272神经毒素的鉴定283小结29四 结 论301结论302进一步工作的几点建议30参考文献32摘 要iAbstractii致 谢i- 5-一 绪 论蛇作为一种古老的动物在地球上已经生存了1.35亿年。在现今存活的2700种蛇中，有毒蛇600多种，其中剧毒的有195种。我国蛇类资源丰富，已发现的蛇有165种，其中毒蛇有47种，隶属于4科25属，主要分布在长江以南地区。乌苏里蝮蛇 (Gloydius ussurensis)，俗名土球子、草上飞、七寸子。属蝰蛇科(Crotalidae)，蝮蛇亚科，蝮蛇属(Agkistrodon)。主要分布于黑龙江、吉林等省。该蛇头部略呈三角形，头背有一深色倒“V”字形斑纹。成体长 4565cm，体重 300400g。中段背鳞21 行，腹鳞加尾下鳞 188213 行，背面浅褐色，中央的两行有色较浅的暗褐色圆斑，通达尾末。眼后白眉显著，下颌部黄白色，一般无斑纹，少数呈灰色网纹。成体尾端不呈黄白色。雄蛇的尾较长，尾基较粗 ，自此向后逐渐变细。雌蛇尾较短，自泄殖腔孔向后突然变细1。1蛇毒中的毒素及活性因子概述蛇毒是毒蛇头部两侧皮肤下方毒腺的分泌物，咬啮物体时经毒牙流出。78 月排毒量最大，成体平均每次可排毒31. 98mg， 一般一个月采 1 次。蛇毒的主要生物学功能是帮助蛇捕食和消化食物。蛇毒中的毒素种类很多，都属于蛋白质和多肽。各种毒素或者单独作用或者协同作用。对蛇毒中的毒素分类方法很多， Kfobusitzty(1936)根据2毒素的生理作用把蛇毒中的毒性组分大致分为10类：1.1作用于血液本身或各种血液成分的物质所有这类物质，或是加速，或是延缓血液凝固，或是引起溶血，或是减弱白细胞的活动性。这类物质如类凝血酶，直接溶血因子等。1.2影响血液循环物质这类物质一部分作用于血管舒缩中心，一部分作用于血管末梢，使其舒张。此类物质如某些心脏毒素，舒缓激肽增强因子和降压因子等。1.3作用于横纹肌的物质这些物质可以改变肌肉细胞的通透性，引起组织肿胀，有些也可以引起心肌的收缩。1.4作用于平滑肌的物质通过对一些分离器官，如小肠，子宫，输卵管的实验，可以证明此类物质的存在。小剂量蛇毒或其组分可以引起上述器官的收缩，大剂量则可以使其麻痹。1.5影响代谢的物质给家兔按每千克体重10mg的剂量注射烙铁头蛇毒或某些眼镜蛇科蛇毒，能够使家兔的血糖水平升至原来的200%，即使内脏神经已经切断，或者肾上腺已经除去，这个作用仍然存在。1.6改变血液中碱储备的物质矛头腹属、响尾蛇属和眼镜蛇属的蛇毒中含有可以改变血液中碱储备的物质。1.7胞溶素几乎所有的蛇毒都含有不同量的胞溶素，也称为膜活性肽。这些物质很容易被检测出来，蛇毒消除组织中组胺的能力就是基于其胞溶素成分。毒素的作用方式之一是使组胺迅速释放从而导致血压急剧下降。1.8出血毒素蛇毒特别是响尾蛇科和蝰蛇科的蛇毒中含有能引起出血的特殊蛋白质，它们甚至是这两类蛇毒致死作用的主要因子。1.9抑制因子研究证明很多蛇毒中存在卵黄热凝血抑制因子，PLA2抑制因子和乙酰胆碱脂酶抑制因子等。1.10影响神经系统的物质蛇毒中包含一些专一性的影响神经系统的物质。这些物质中有些与箭毒、马钱子相似，作用于运动神经末梢的运动终板，与乙酰胆碱受体结合，阻止神经-肌肉传导的进行；有些物质能够作用于神经细胞而影响神经传导。应该指出的是，有不少毒素都有两种或两种以上的毒理作用，把它们归为某一类是由于它以某一种毒素为主。现在已经发现许多毒素无法按照上述的分类标准将它们分类。随着分离技术的提高以及研究的不断深入，以后会出现更多的新毒素。2蛇毒神经毒素(neurotoxin，NT)的概述2.1分布神经毒素是蛇毒中的一类重要活性组分，主要分布在眼镜蛇科、海蛇科蛇及蝰科响尾蛇的蛇毒中。神经毒素在蛇毒中含量较高，一般在 20%50%之间，毒性极强，是该类毒蛇咬伤致死的主要成分之一。2.2种类蛇毒神经毒素种类多、活性强、性质稳定、结构相对简单，因此一直备受人们的关注。近年来随着生化技术的发展及分子生物学方法的应用，已经从不同的蛇毒中分离纯化出许多的神经毒素，其中仅突触后神经毒素就有 100 多种，有80 多种经过氨基酸序列分析，一些蛇毒神经毒素的基因文库和 cDNA 文库已经构建出来。蛇毒神经毒素根据作用机制可分为四类：突触前神经毒素（presynaptically-acting neurotoxin或-neurotoxin）、突 触后神经毒素（postsynaptically-acting neurotoxin或-neurotoxin）、抗胆碱酯酶类神经毒素（antichol- i nesterase neurotoxin）和离子通道型神经毒素（ion-channel neurotoxin）。目前发现的镇痛成分几乎都是突触后神经毒素。2.3结构及理化性质四类神经毒素中，对突触后神经毒素的结构研究最多且较为明确。突触后神经毒素是一条由 6080 个氨基酸残基组成的多肽链，氨基酸残基的组成及相对位置具有很大的同源性，分子量约为 60008000 道尔顿3。突触后神经毒素有长链和短链之分，短链含 6062 个氨基酸，四个二硫键，长链含 6674 个氨基酸，五个二硫键。分子中的二硫键聚集在一起形成一个致密的内核，由此核心伸展出三个肽链环就象三个手指，故其又被形象地称为三指蛋白(three-finger protein)。 突触后神经毒素几乎全部是碱性蛋白，等电点在 910 之间。由于分子量很小但二硫键很多，这类毒素的理化性质十分稳定，对热及化学试剂都有抗性。2.4药理性质突触后神经毒素具有箭毒样作用，能与运动终板上的烟碱受体（N2-AChR）结合，阻止神经肌肉去极化，导致神经传导阻断，使骨骼肌瘫痪。突触后神经毒素与 N2-AChR 的结合十分牢固，它们的解离常数在 10-1010-11之间，明显强于筒箭毒碱。利用这个特性，李镇源等4人将银环蛇毒中分离的-银环蛇毒素 (-bungarotoxin)，鉴定并提取出电鳗中的 N2-AChR，验证了受体的存在。现在以-银环蛇毒素为代表的突触后神经毒素已成为研究神经系统中神经递质的产生及其传递过程分子机制的重要探针，广泛应用于药理学和生理学的相关研究。3蛇毒神经毒素的镇痛特点3.1 起效慢，维持时间长，效价高NT 的镇痛作用与阿片类镇痛药物相比起效较慢，一般肌肉注射或腹腔注射的起效时间在 1 小时以上，35 小时达高峰。陈汝筑等5给大鼠肌肉注射眼镜蛇神经毒素（cobrotoxin）0.022mg/kg，给药后 1 小时出现镇痛作用，3 小时左右达到最高峰；Pu 等6给小鼠腹腔注射眼镜王蛇神经毒素 （hannalgesin） 进行镇痛实验得到相似结果。如果中枢给药不仅可大大提前 NT 的镇痛作用高峰时间，而且能提高 NT 的镇痛效价和强度。陈汝筑用 1/10 肌注剂量（2g/kg）的 cobrotoxin注射到大鼠的侧脑室，发现镇痛作用的峰值时间在 1 小时左右出现，比外周给药提前了约 2 小时7，镇痛作用强于肌肉注射。hannalgesin 侧脑室注射的镇痛强度也明显大于腹腔注射和口服。而班建东等8人在大鼠中脑导水管周围灰质（Periaqueductal Gray， PAG）注射微量 cobrotoxin（1.255 g/kg），痛阈可在 20m达到峰值，痛阈最大提高 247.5%以上，镇痛强度明显大于外周给药。这些结果提示，NT 产生镇痛效应的作用部位可能在中枢。另外 NT 镇痛作用的维持时间相当长。给大鼠肌注 cobrotoxin 的 24 小时内能维持较高的镇痛作用强度，注射后 48 及 72 小时，还显示有残余作用5。而 Picolo 等9发现大鼠口服响尾蛇粗毒其镇痛作用可维持 120 小时之久。而且 NT 具有很高的镇痛效价，按摩尔剂量计算，NT 的镇痛效价一般为吗啡的5005000 倍。cobrotoxin 的镇痛效价是吗啡的4700 倍左右，而 hannalgesic 约为吗啡的 2700 倍，而 Mancin 等10发现响尾蛇神经毒素 crotamine 的镇痛效价约为吗啡的 500 倍。3.2 无耐受和成瘾性NT 镇痛的突出优点是没有耐受性，并且与吗啡没有交叉耐受。给小鼠连续注射cobrotoxin 9 天，没有出现耐受现象，痛阈始终维持在较高水平，显著高于生理盐水组和吗啡组，而且对吗啡急性耐受的大鼠，cobrotoxin 也能产生明显的镇痛效应7。郑罗绮等11和 Pu 等6也报道了相似的研究结果。另外，NT 的镇痛作用没有成瘾性，反而有脱瘾作用。在纳洛酮戒断试验中发现肌注眼镜蛇毒的小鼠没有出现戒断症状11。到目前为止，蛇毒制剂的临床应用尚未见报道成瘾病例而且昆明动物研究所将含有蛇毒神经毒素的制剂复方克痛宁注射液进行戒毒治疗，收到明显效果12。4蛇毒神经毒素的镇痛机制研究4.1镇痛作用与毒性的关系对NT的镇痛作用机制研究首先要解决的问题是NT的镇痛作用是否是其毒性的一种表现或者说是 NT 造成了动物的神经和肌肉功能的损害，而导致其无法对伤害性刺激作出正常的防御反应。突触后 NT 的毒性机制是它能与运动终板上的胆碱受体发生结合，拮抗乙酰胆碱与其受体的作用，从而阻断骨骼肌上神经冲动的传递，导致呼吸肌麻痹，所以它的毒性作用发生在外周。Lee 等13报道小鼠侧脑室注射 cobrotoxin 的 LD50是腹腔注射 LD50的 2 倍，并且小鼠在中枢给药后，其死亡原因还是 cobrotoxin 导致的呼吸肌麻痹。而在镇痛方面，如前述，NT 中枢给药与外周给药相比起效快，作用强。另外 cobrotoxin 的镇痛可被阿托品阻断7，而不被甲基阿托品（不能透过血脑屏障）阻断14。而在给予镇痛剂量的hannalgesin 时，动物均未出现缺氧、呼吸麻痹等外周中毒症状，并且在转棒法实验（rota-rod test）和最大电休克发作实验（maximal electroshock seizure，MES）中，出现镇痛效应的动物无镇静、肌肉松弛和运动协调能力降低等神经和肌肉功能的削弱6。以上这些提示 NT 的镇痛可能主要是通过其中枢作用而实现的，而与其毒性无关。4.2镇痛作用与痛觉调控相关方面的关系4.2.1内源性阿片肽系统NT 的镇痛与内源性阿片肽系统有一定的关系，但它可能不是 NT 发挥镇痛作用的唯一途径。hannalgesin 的镇痛作用可被纳洛酮阻断6，并且纳洛酮和阿片受体亚型拮抗剂 N，N-diallyl-Tyr-Aib-Aib -Phe-Leu (ICI 174，864)可拮抗响尾蛇蛇毒的局部镇痛作用，而阿片受体和亚型拮抗剂D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr amide(CTOP)和 nor-binaltorphimine 则无此作用9。提示响尾蛇蛇毒的镇痛作用可能与阿片受体亚型的激动有关。不过hannalgesin 和 crotamine 都没有阿片肽所共有的 Tyr-Gly-Gly-Phe 片段6，10（该片断是决定内阿片肽与受体结合的特征性结构），说明 NT 不是阿片受体的直接激动剂。另外，连续一周给大鼠注射 cobrotoxin 可使大鼠的下丘脑和中脑+丘脑两个脑区中亮啡肽样和甲硫啡肽样免疫反应物质（MEK 和 LEK）明显升高，海马及后脑的含量则无显著变化，但是 cobrotoxin 的存在与否不影响低浓度吗啡对低频电刺激豚鼠回肠及小鼠输精管收缩的抑制作用（离体豚鼠回肠与小鼠输精管上的吗啡受体分别代表吗啡的和受体亚型，已被广泛用于鉴定阿片样物质），但加纳洛酮后，吗啡的效应被完全拮抗15。由于各种内源性阿片肽具体的生理功能还不十分清楚，难以了解 MEK 和 LEK 在 cobrotoxin 镇痛机理中所起的作用。另外，实验中没有测定这两种物质的更新率（turnover rate），因此也不能完全排除cobrotoxin抑制这些脑区的脑啡肽能神经元，减少脑啡肽样免疫物质的更新率，而引起这两种物质含量升高的可能性。并且纳洛酮仅轻度拮抗 cobrotoxin 和眼镜蛇粗毒的镇痛作用16。这些实验结果提示 cobrotoxin 可能不是直接作用于阿片受体，但可以影响阿片受体的功能。临床上用蛇毒镇痛不会出现阿片类药物的成瘾、耐受现象，并且蛇毒对吗啡成瘾的患者上亦能发挥镇痛效应，这些结果也支持 NT 没有直接激动阿片受体的作用。提示 NT 可能不是主要通过激活内源性阿片肽系统产生镇痛效应的。4.2.2胆碱能神经系统（1）与中枢 M-AChR 的关系文献报道17中枢 M 胆碱能系统兴奋可产生镇痛效应。实验发现 NT 的镇痛与中枢胆碱能系统也有着密切的关系。大鼠肌注 1mg/kg 的阿托品后 1.5 小时能完全阻断 cobrotoxin 的镇痛作用，并且在6小时后cobrotoxin 的镇痛作用恢复到未注射阿托品前的水平，而且阿托品拮抗 cobrotoxin 的镇痛效应具有量效关系7，而相同剂量的甲基阿托品对 cobrotoxin 镇痛作用没有影响，用 hemicholinium-3(HC-3)造成中枢乙酰胆碱耗竭后，发现 cobrotoxin 的镇痛作用也消失了18。说明cobrotoxin 的镇痛作用可能与中枢 M 型胆碱系统有关系，而且中枢胆碱能神经元可能被 cobrotoxin 激活，并且在 cobrotoxin 引起的镇痛中起着重要作用。但是有实验证明阿托品对 cobrotoxin 在脑内的结合位点没有亲和力19，说明阿托品不是直接阻断 cobrotoxin 与受体之间的作用，同时也提示 cobrotoxin 不可能是 M-受体的直接激动剂。在 cobrotoxin 产生镇痛效应的大鼠脑内乙酰胆碱的含量与对照组相比没有显著增多20，说明 cobrotoxin 对胆碱酯酶的活性不产生抑制。上述实验结果表明，NT 产生镇痛作用与中枢 M 胆碱能系统兴奋有关，但是 NT 以何种方式影响中枢胆碱能系统的或者说 NT 的作用环节在何处，目前还不明确，尚需进一步的研究。（2）与 N-AChR 的关系烟碱受体激动剂具有镇痛作用已为人们所知20，新型镇痛药物 ABT-594 是一种强烟碱受体激动剂，它是从厄瓜多尔树蛙皮肤中提取分离出具有镇痛作用的蛙皮素（epibatidine）的衍生物，其镇痛效价是吗啡的 200 多倍。ABT-594 的镇痛作用不被纳洛酮阻断，而被烟碱受体阻滞剂美加明所阻断。而蛇毒神经毒素是肌型烟碱受体的竞争性拮抗剂，同样具有镇痛作用。笔者在实验中发现，烟碱不但不会拮抗 NT 的镇痛作用，而且还可增强 NT 的镇痛作用。NT 的镇痛可能与它对 N2-AChR 的阻断作用无关，是否还有其他机制参与，还有待进一步的研究。4.3与 NO 的关系NT 的镇痛作用机制可能还与 NO 的生成有关。hannalgesin 的镇痛不但可被纳洛酮阻断，而且还被 NO 合酶的抑制剂 L-NG-nitro-arginine methyl ester（L-NAME）阻断5，响尾蛇蛇毒的局部镇痛也可被 NO 合酶抑制剂NG-methyl-L-arginine（L-NMMA）和胍裂解环化酶抑制剂亚甲蓝拮抗8，提示 NT的镇痛还涉及到 NO 系统。另外有报道21NO 的前体 L-精氨酸产生的抗痛作用可被纳洛酮翻转，提示在痛觉调控上，NO 与内阿片肽系统之间存在着某种联系。它们可能是 NT 在发挥镇痛作用时相继激活的环节。研究这三者之间的关系可能有助于加深我们对痛觉调控机制的认识。5蛇毒神经毒素的应用人们很早就知道神经-肌肉传导中有Ach受体存在，也知道很多抑制这种传导的药物或毒物作用在这类受体上22，但对这类受体分离以及性质的研究十分困难。其原因一方面在于它们的含量十分低，不易纯化，另一方面能与这类受体作用的药物亲和力不大而且不十分专一，这给分离和鉴定工作带来了不可克服的困难。实际上在未使用蛇毒中的突触后神经毒之前，对AchR的研究十分缓慢。眼镜蛇毒和海蛇毒中含有大量的突触后神经毒素，它们能与AchR结合从而发挥作用。这类毒素，特别是-银环蛇毒素和 - 眼镜蛇毒素和其它抑制剂相比有两个显著特点：一是对AchR有极高的亲和力，这种作用力是非共价形式的；二是对尼克酰胺型AchR结合有极强的特异性。由于这些性质是它们在AchR的研究上发挥了巨大的作用，具体表现在以下几个方面。5.1作为检侧尼克酰胺型AchR的标记物对 - 银环蛇毒素可以进行放射性3H或135I标记而不失活。由于该毒素对AchR有高度特异结合，所以可以用它来检测AchR在各组织中的分布，以及含量大小，也可以在AchR纯化过程中作为示踪工具。用标记的-银环蛇毒素和组织结合并进行放射自显影，可以搞清各种组织终板后膜上AchR的密度，也可以搞清动物在发育过程中AchR生成和含量方面的变化以及切除神经后对AchR含量等方面的影响。现己知道哺乳动物和蛙骨骼肌的神经被切除后的AchR和原来的AchR在本质上相同，但二者还是有不少的差异，其中包括等电点，对离子的传递活性以及免疫性方面的不同。这种变化也许部分由于终板后膜上磷脂的改变引起的。5.2用于AchR的纯化过去使用多种手段试图对AchR进行纯化，其中包括层析，等电聚焦电泳和亲和层析，但都没有成功。尽管以药物为配基进行亲和层析使AchR获得了部分纯化，但离纯品还相差很远。-银环蛇毒素的发现使这方面的困难得到了解决。以-银环蛇毒素为配基的Sepharose胶是最有效的亲和层析工具。该胶在0.02%叠氮化钠的存在下4可以稳定6个月不变质，这大大方便了对AchR的纯化。5.3作为研究药物与受体相互作用的工具除蛇毒中的突触后神经毒素外，还有许多可以和AchR结合的药物或毒物，它们有的是人工合成的，有的是自然存在的。已知-银环蛇毒素能特异性的与尼克酞胺型AchR结合，亲和力很强。通过竞争结合实验可以了解其它药物或毒物的结合部位是否和-银环蛇毒素相同，结合力大小以及特异性强弱，为弄清药物或毒物的作用机制打下基础。现己知道，有的物质与AchR的结合部位和-银环蛇毒素相同，有些是结合在同一分子的另一个活性部位，有时AchR能同时结合两种活性物质。5.4作为研究AchR结构与性质的工具以-银环蛇毒素为工具可以对AchR的结合部位，作用机制以及结合动力学进行广泛研究。N-胆碱受体是第一个了解最清楚的亚型结构，如不借助于-银环蛇毒素这种高效工具，这种成功是难以想象的，标记的-银环蛇毒素可以跟踪AchR，在测定其分子量，等电点等方面起作用。因为AchR含量不多，不容易得到，不能像测定其它蛋白性质那样有很大的量。由于用量少，用常规的检测方法很难测定，所以只能用标记的-银环蛇毒素来作为检测工具。突触后神经毒素除上述作用外，在重症肌无力病病理研究以及与AchR有关的离子传导泵作用机制研究方面也有应用。6蛇毒神经毒素的临床应用蛇毒镇痛的研究已有很长时间，最早发表这类论文的是Machi (1936)。Steinbrocke 1940年用眼睛蛇毒治疗65例关节炎和神经痛病人，其有效率为59%23。Hynson，westeo和Dunning公司用蛇毒制成两种镇痛药Cobroxin和Nyloxin。前者为神经毒素，用于治疗各种顽固性疼痛和恶性肿瘤疼痛，后者专门用于治疗关节痛。这两种药物已列入美国药物局方中。1975年，中国科学院动物研究所等单位利用眼镜蛇毒研制成功眼镜蛇神经毒素注射液，此药现已由广西梧州市制药厂批量生产，商品名为“克痛宁注射液”。该注射液是一种新型的镇痛剂，止痛作用快，效果好，连续用药不会产生耐药性，也不会成瘾，用药剂量小，一般没有严重的副作用，可以用于风湿性关节痛，三叉神经痛，坐骨神经痛等。但该药仅供肌注，且注射部位起硬结，给药35天后才起作用。中国人民解放军蛇毒临床应用研究中心用近代技术，将眼镜蛇毒神经毒素分离纯化，制备出新型镇痛针剂“新克痛宁”，静脉给药或肌注后立即起作用。7本研究的目的长白山乌苏里蝮蛇蛇毒是一种富含血循环毒素的蛇毒，从中提取出的清栓酶已用于临床治疗血栓病。虽然已有文献报道从该蛇毒中提取出了磷脂酶A2、L-氨基酸氧化酶、纤溶酶和神经生长因子等多种组分，但至今没有关于从中提取到神经毒素的报道24。因此进行长白山乌苏里蝮蛇蛇毒神经毒素的研究，一方面具有科研价值，另一方面也为开发应用新的镇痛药打下基础。在本研究中我们首先利用离子交换层析分离技术分离蛇毒粗毒。在粗分后的若干组分中通过小鼠急性毒性实验，利用神经毒素具有引起中毒小鼠神经行为异常（如步态，翻正反射，前肢握力，后肢握力等2）并使小鼠致死，而且神经毒素一般不会造成实验动物腹腔的大面积出血的特性初步筛选出神经毒素，然后对这些组分利用凝胶过滤层析，进行近一步的纯化，同样通过小鼠急性毒性实验进行鉴定。对筛选后的组分进行SDS-PAGE（Tris-Tricine系统）电泳检测，分析是否含有神经毒素。二 实验材料与方法1实验材料1.1试剂长白山乌苏里蝮蛇蛇毒购于吉林辉南县DEAE-Sephadex A50Amersham Pharmacia公司Sephadex G-50Amersham Pharmacia公司丙烯酰胺 Sigma公司NN-甲叉双丙烯酰胺Sigma公司SDS Tricine Sigma公司Sigma公司TEMED Sigma公司考马斯亮蓝G-250Sigma公司Tris-巯基乙醇Sigma公司Sigma公司蛋白标准品(3.3120.1)kD过硫酸胺 宝泰克生物科技有限公司宝泰克生物科技有限公司甘氨酸国产分析纯试剂甘油国产分析纯试剂盐酸国产分析纯试剂溴酚蓝国产分析纯试剂乙酸乙醇国产分析纯试剂国产分析纯试剂NaCl国产分析纯试剂1.2仪器仪器 型号 生产厂家高速离心机 TGL-16G 江苏金坛市中大仪器厂普通离心机 TDL-40B上海安亭科学仪器厂电子天平ESJ60-4美国双杰兄弟集团精密电子天平JJ500 美国双杰兄弟集团超纯水设备RO-1070武汉纯水机玻璃层析柱 VantageA2 S2北京慧德易公司酸度剂PHS-3CT 沈阳龙腾电子有限公司小型台式记录仪XWT-S 上海自动化仪器厂核酸蛋白检测仪HD-95-1上海金达生化仪器厂电泳仪电泳槽 DYY-6C DYCZ-24D北京六一仪器厂北京六一仪器厂紫外可见分度计 UV-4802H 尤尼柯（上海）仪器有限公司旋转蒸发器超净台磁力搅拌器RE-20SW-CJ-2D90-3上海实验仪器厂有限公司苏州净化设备有限公司上海振荣科学仪器有限公司1.3小鼠昆明系小白鼠，体重1822g小鼠，雌雄各半，吉林大学基础医学院动物中心提供。2实验步骤与方法2.1纯化工艺条件摸索蛇毒是一种复杂的混合物，内含丰富的蛋白质，因此要研究其中一种蛋白或酶，首先就是要从复杂的大分子体系中分离纯化出所需的目标蛋白质或酶，然后对单一组分的蛋白质或酶进行深入的分析。因此，选择适当的方法对目标蛋白质或酶进行分离纯化则至关重要。近30年来，生物分离技术的进步促进了蛇毒的研究。目前，用于蛋白质分离纯化的方法有盐析、热失活、酸碱变性、有机溶剂分步沉淀、自由区带电泳、超离心、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤、亲和层析和疏水层析等方式25。 蛋白质或多肽的分离方法多种多样，主要是利用蛋白质之间性质的差异，包括蛋白质或多肽分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、极性、吸附性质、电荷以及对其它分子的生物学亲和力的特性而建立起来的一些分离纯化方法。根据各种分离纯化方法的基本原理可以将这些分离纯化方法归纳为两大类:一类是利用混合物中几个组分的分配系数的差异，把它们分配到两相中，从而达到分离纯化的目的，如层析、盐溶、盐析、共沉淀、有机溶剂沉淀和蛋白结晶等方法；另一类是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用从而使各组分分配于不同的区域中而达到分离的目的，这类纯化方法有电泳、超速离心、超滤等方法。由于蛋白质或酶容易失活，不能受热融化和汽化，所能分配的物相也只能限于固相和液相，并通过在两相之间的交换进行分离纯化。因此可以将蛋白质制备方法按分子大小、形状、带电性质、溶解性及对其它分子的亲和力等主要因素进行分类（Tab1）。表 1: 蛋白质的分离方法性质 方法 分子大小和形状 差速离心，超滤，分子筛，透析等溶解性 盐析，有机溶剂沉淀，等电点沉等带电性质电泳 等电聚集，离子交换层析，吸附层析等生物功能专一性 亲和层析，疏水层析，共价层析等 2.2.1电泳系统的选择聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是鉴定蛋白质或多肽的常用生化方法，样品的蛋白质或多肽热变性解聚后与SDS结合形成带负电的蛋白质-SDS复合物，复合物在电泳中的迁移率取决于蛋白质的分子大小，使用均匀浓度的SDS-PAGE来分析分子量在15200kDa的蛋白质时，电泳迁移率与分子量的对数成线性关系。但常规的Tris-甘氨酸-盐酸系统中电泳分离分子量小于10kDa的多肽效果差。传统上分离小分子肽用连续梯度胶，制作较麻烦，而且需要专门的灌胶设备。Schagger等26改用Tricine-SDS-PAGE系统后，对小分子肽的分辨率明显提高。利用16.5%凝胶浓度、11%甘油，按“小孔胶-夹层胶-浓缩胶”模式制作不连续的梯度胶，分析昆虫细胞的表达产物，可见小于14kDa的几个小分子成分，并呈现清晰的34条带，而且还能分离23kDa的肽段27。但同样有国内学者做过相关研究证明在分离胶内加入尿素，使其浓度达到6mol/L，会得到更好的分离效果28。由于神经毒素分子量大多在10kDa以下，所以应该采用SDS-PAGE（Tris-Tricine系统）来进行鉴定。为了得到更理想的电泳图谱，本实验分别使用的了含11%甘油的浓缩胶和含6mol/L的尿素的浓缩胶进行电泳，结果表明后者得到更直更窄的蛋白条带，故选用含6mol/L尿素的电泳系统。由于神经毒素的分子量较小，在凝胶中容易扩散，电压过低，导致扩散作用，条带变得的模糊；电压过高条带又会发生严重畸变，所以本实验摸索了多个电泳条件，最终选择了恒压进行电泳，在进入分离胶之前电压为40V，进入分离胶后电压为80V。2.2.2层析系统的选择层析是蛋白质分离纯化的重要手段之一，一般而言，带分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据待分离的蛋白质颗粒大小，电荷多少剂亲和力等。使待分离的蛋白组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋质的目的。层析的种类很多，有离子交换层析，凝胶过滤和亲和层析等。其中离子交换层析和凝胶过滤应用最广泛。离子交换层析是利用离子交换剂对带有反电荷各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术。这种层析具有分辨率高，不受样品体积限制和交换容量大等优点，比较适合蛇毒的分离。在分离粗毒时，我们首先选用离子交换色谱。例如DEAE-Sepharose FF是一种弱阴离子交换剂，本身带有很多正电荷，它必须吸附带负电荷的阴离子以维持电中性。当样品溶液中的阴离子通过时，与琼脂糖凝胶上的阴离子交换而被吸附。阴离子被吸附的强度与该阴离子的电荷密度成正比，带负电荷越多，电荷密度越高，则与琼脂糖凝胶的亲和力越大，结合也越紧密，相反，电荷密度越低的阴离子则结合也较松散。洗脱过程中，随着洗脱液离子强度或pH的改变，电荷密度较低的阴离子物质先被洗脱下来，而电荷密度较高的阴离子物质则后被洗脱，从而使不同的物质互相分离。本实验也尝试了使用DEAE -Sepharose FF离子交换层析，但效果并不理想。凝胶过滤又称分子筛层析。层析柱内填满的凝胶是含有小孔的颗粒，小孔的孔径根据凝胶的不同而不同29。凝胶一般为葡聚糖制成，当蛋白质溶液加于柱之顶部，在不同的柱压下，使其往下渗漏，小分子蛋白会进入到葡聚糖颗粒的小孔内，因而在层析柱内滞留的时间较长；而大分子蛋白不能进入到小孔内，直接沿着凝胶颗粒的间隙往下流动，在层析柱内滞留的时间较短。由于不同蛋白在层析柱内的滞留时间不同，他们流出柱底的时间也不同，从而达到分离的目的。本实验就是通过该方法对蛇毒中的去整合蛋白进行进一步纯化。常用的凝胶过滤介质及其分离范围范围见表2。表 2:介质种类与其分离范围介质种类蛋白分离范围/kDaSephadex G-10Sephadex G-25Sephadex G-50Sephadex G-75Sephadex G-100Sephadex G-150Sephadex G-2000.7151.530370415054005800神经毒素分子量大多在10kDa以下，所以本实验选用Sephadex G-50作为凝胶过滤层析介质。2. 2.3缓冲系统的选择由于蛋白质在不同的缓冲系统中溶解度和稳定性不同，因此选择合适的缓冲系统对层析分离的结果至关重要。例如本实验中选用Sephadex G-50作为凝胶介质的凝胶过滤层析，样品应溶于同一缓冲液中，除非色谱的目的是为了除盐。缓冲液最好是水溶性的，其pH范围在68左右，因为这个条件适合有大多数蛋白质，同时也适合于大多数的凝胶介质。常用的磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液通常使用中性pH。有时候也可使用挥发性的缓冲盐溶液如乙酸铵或碳酸氢铵，他们可以通过冷冻干燥快速的去除，但是这需要相应的冷冻干燥设备30。本实验对磷酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液和乙酸盐缓冲液的层析结果进行了比较，对比结果表明使用较低浓度的Tris-HCl缓冲液分离效果最为理想，并且浓缩后易于电泳鉴别。影响层析分离蛋白的另一重要因素是pH的选择，例如本实验中选用DEAE-Sephadex A50作为离子交换层析介质，使用的是Tris-HCl缓冲液，所以我们在上样量，流速及缓冲液浓度不变的情况下，分别筛选了pH为6.0，7.0，8.0，9.0四个值进行层析分离。结果pH为8.0时分离效果最好，故在离子交换层析的缓冲系统中，选用的pH为8.0。而在凝胶过滤层析则选用了pH为7.6的Tris-HCl缓冲液。2.2乌苏里蝮蛇蛇毒神经毒素筛选策略神经毒素一般具有影响神经传导和致死活性作用，因此我们筛选神经毒素的第一步就是筛选出能够使小鼠神经功能异常并且致死的有毒组分。又因为神经毒素一般不会造成实验动物腹腔的大面积出血，而乌苏里蝮蛇蛇毒中又恰恰含有多种血循环毒素，其中的出血毒素又是导致实验动物死亡的主要组分，并能引起动物腹腔的大面积出血31，因此第二步筛选就是对注射有毒组分致死的小白鼠进行解剖，淘汰掉造成腹腔出血的组分，将可能的组分缩小到最少。因蛇毒中蛋白质等电点和分子量的不同，我们采用离子交换与凝胶过滤相结合的方法，逐步分离纯化，得到目的蛋白。2.3乌苏里蝮蛇蛇毒分离前的处理取粗蛇毒2g溶于20ml缓冲液中，3000r/min离心15min后，取上清液，透析袋透析过夜除去粗毒中的盐分，。2.4乌苏里蝮蛇蛇毒离子交换色谱2.4.1 DEAE-Sephadex A50填料的处理根据柱体积，称取所需DEAE-Sephadex A50干胶的量，先用蒸馏水浸泡至全部溶胀，倾去液面飘浮的细小颗粒，抽干。置于0.2mol/L NaOH溶液中，搅拌浸泡1h，用布氏漏斗加两层滤纸抽滤。蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将DEAE-Sephadex A50用0.2mol/L HCl溶液适当搅拌浸泡半小时， 同样抽滤液至近中性，再用0.2mol/L NaOH溶液适当搅拌浸泡半小时，蒸馏水洗至中性，抽干，备用32。2.4.2 DEAE-Sephadex A50的装柱选用2.0cm40cm层析柱。将洗净后的层析柱安放得横平竖直，关闭底端出口，加入柱长2/3的缓冲液甲， 缓冲液甲为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH为8.0，将柱中缓冲液甲放至离出口处约10cm，将DEAE-Sephadex A50加约一倍体积的Tris-HCl缓冲液甲，除去气泡，用玻璃棒小心均匀地倒入柱中，一次倒至距层析柱上口约1cm处，等胶面沉积12cm时，打开层析柱出液口，控制流速与柱洗脱时的洗脱速度一致，0.5ml/分，随着胶面不断下降，将胶表面处轻轻搅起，不断补加胶至所需高度，然后用Tris-HCl缓冲液甲平衡3个柱体积，过夜。2.4.3加样与洗脱取上步制得样品上柱，用缓冲液甲洗脱。期间通过多通道电子蠕动泵调节流出液的速度，保证流速不能过快或过慢。流速约为60ml/h，人工收集，每管4ml。第二步换用0.1，0.2，0.4mol/L NaCl的Tris-HCL缓冲溶液进行分段洗脱，测定OD280nm，绘制洗脱曲线，收集各峰。2.4.4毒性测定通过小鼠急性毒性试验测定各峰洗脱液的毒性。取昆明系小白鼠，随机分组每组5只(1822g)，将经DEAE-Sephadex A50分离后的各组分浓缩后给小鼠腹腔注射0.2ml，观察小鼠注射后的反应及三日内每组小鼠的死亡情况，取中毒致死的小鼠，解剖，观察其腹腔及腹膜有无出血和出血斑。并针对神经毒活性，观察小鼠神经行为功能，如步态，翻正反射，前肢握力，后肢握力等。实验中，各取神经毒素峰0.2ml，分别腹腔注入1只小鼠，观察小鼠的毒性反应。确定每种组分的毒性。同时将注射0.2ml Tris-HCl缓冲液甲及0.2ml NaCl-Tris-HCL缓冲溶液的小鼠作为阳性对照组。2.5凝胶过滤色谱纯化神经毒素2.5.1 Sephadex G-50填料的处理根据柱体积，称取所需Sephadex G-50干胶的量，先用蒸馏水浸泡至全部溶涨，倾去液面飘浮的细小颗粒，抽干。用0.2mol/L HCl溶液适当搅拌浸泡半小时，蒸馏水洗至中性，再用0.2mol/L NaOH溶液适当搅拌浸泡半小时，蒸馏水洗至中性，抽干，备用33。2.5.2 Sephadex G-50的装柱选用2.0cm40cm层析柱。将洗净后的层析柱安放得横平竖直，关闭底端出口，加入柱长2/3的缓冲液乙， 缓冲液乙为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH为7.6，将柱中缓冲液乙放至离出口处约10cm，将Sephadex G-50加约一倍体积的缓冲液乙，除去气泡，用玻璃棒小心均匀地倒入柱中，一次倒至距层析柱上口约1cm处，等胶面沉积12cm时，打开层析柱出液口，控制流速与柱洗脱时的洗脱速度一致，0.5ml/分，随着胶面不断下降，将胶表面处轻轻搅起，不断补加胶至所需高度，然后用Tris-HCl缓冲液乙平衡3个柱体积，过夜。2.5.3加样与洗脱取神经毒性峰浓缩液上柱，用缓冲液乙洗脱。洗脱液用EP管来收集，每管2ml，每小时60ml。核酸蛋白检测仪检测OD280nm吸收值，绘制洗脱曲线，收集各峰。2.5.4毒性测定具体操作如上离子交换色谱的毒性测定2.6神经毒素的鉴定2.6.1 SDS-PAGE（Tris-Tricine系统）采用SDS-PAGE（Tris-Tricine系统）碱性不连续垂直电泳，检测，其中分离胶中含6mol/L的尿素63,66。1.溶液配制:(1)正极缓冲液(10)121.14g Tris溶于400ml重蒸水，用10mol/L HCl调至pH8.9，定容至500ml。(2)负极缓冲液(10)将60.55g Tris，89.58g Tricine及5g SDS溶于400ml重蒸水中，加水至终体积为500ml。(3)凝胶缓冲液(3)将181.5g Tris，1.5SDS溶于400ml重蒸水中，用1mol/L HCl滴定至pH8.45，再加水稀释至500ml。(4)3C丙烯酰胺储存液将48g丙烯酰胺和1.5g甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中至100ml，制备成T=49.5%，C=3%的储液。（T为两种丙烯酰胺的总浓度；C为交联度）(5)5C丙烯酰胺储存液用重蒸水溶解47g丙烯酰胺和2.5g甲叉双丙烯酰胺成100ml溶液，制备成T=495%，C=5%的储液。(8)10%SDS 2.5g SDS，用双蒸水溶解至25ml，室温保存。(9)10%过硫酸胺 0.1g过硫酸胺+1ml双蒸水，使用前新鲜配制(10)10%TEMED0.1ml TEMED+0.9ml双蒸水，使用前新鲜配制(11)样品缓冲液样品缓冲液中含有100 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8；1%SDS；4%巯基乙醇；24%甘油和少许溴酚蓝。2.胶的制备见表3表 3: Tricine-SDS-PAGE凝胶配方Separating GelT=16.5%，C=5%Spacer GelT=16.5%，C=3%Stocking GelT=4%，C=3%3Gel Guffer2ml0.5ml1ml3C stock0.5ml0.25ml5C stock2ml6mol/LUrea2mldH2O0.5ml1.75ml10%TEMED30l10l35l10%过硫酸胺30l10l35l3.样品制备:受试样品与样品缓冲液以1:1混合，100水浴5min。上样前离心（10000r/min，1min）。4.电泳条件:上样后在未进入分离胶前先稳压40V，待样品全部进入分离胶后，再改用稳压80V走完电泳，全程约4.5小时。5.固定、染色、脱色:用含有0.25% 考马斯亮蓝 G-250的固染一体的溶液（乙醇:乙酸:水=9:2:9）染色1h，10%冰醋酸脱色过夜。三 实验结果与讨论1蝮蛇毒中神经毒素的分离1.1乌苏里蝮蛇蛇毒离子交换色谱1.1.1色谱结果将处理的蛇毒经DEAE-SephadexA50柱层析，分离得到9个蛋白峰，标记为peak1 peak9，（见图1）。 1.1.2 毒性测定结果将peak1peak9洗脱液分别腹腔注入小鼠各5只(见表3)，结果peak3与peak8洗脱液注射后，小鼠全部死亡； peak6洗脱液注射后，小鼠4只死亡；而其余各峰洗脱液对小鼠无毒性，小鼠均存活。小鼠具体死亡状况如下：（1）将peak8洗脱液成分分别腹腔注射小鼠表现为：注射58min后，小鼠烦躁不安，头不停地拌动。915min，小鼠毛发竖立，皮肤发皱，不能行走。1625min后，小鼠死亡。将死亡小鼠进行解剖，可见腹腔大量出血，其中有血凝块。（2）将peak6洗脱液成分分别腹腔注射小鼠表现为：小鼠三小时内急性中毒死亡，对死亡小鼠解剖发现腹腔大量充血。（3）将peak3洗脱液成分分别腹腔注射小鼠表现为：小鼠呼吸逐渐变缓，四肢运动不协调，感觉迟钝，六小时内急性中毒死亡。对死亡小鼠解剖发现腹腔内无血迹且腹膜上也无出血斑。由于许多神经毒素可以引起动物呼吸肌麻痹，从而使动物窒息死亡，推测该组分含有神经毒素。1.2凝胶过滤色谱纯化神经毒素1.2.1色谱结果将通过小鼠急性毒性试验鉴定，确定对小鼠具有神经毒性的peak3洗脱液，经