集胞藻6803CO2浓缩机制的研究.doc

湖北师范学院2008届生物系学士学位论文目录1.前言12.材料和方法42.1 实验材料42.2集胞藻6803的培养42.3 测定方法53.结果74.结果讨论95.参考文献10致谢12集胞藻6803（Synechocystis PCC6803） CO2浓缩机制的研究引言： 集胞藻6803属于蓝藻门，蓝藻纲。集胞藻6803是单细胞蓝藻,以一分为二的方式进行繁殖,繁殖速度快1。自从工业革命以来，人类活动的增加导致化石燃料的大量使用，使大气CO2浓度持续增高。预计到本世纪中期，大气CO2浓度将倍增2-5，最终将引起温室效应。 CO2作为植物光合作用的底物，大气CO2浓度升高对陆地生态系统功能和结构的影响是明显的。陆地生态系统的生产力在CO2浓度增加的条件下比正常CO2浓度高，一般提高25%左右。全球农作物产量和生物量在大气CO2浓度倍增的情况下平均增加24%43%6。一般认为CO2增加会促进植物光合产物流向根系，从而提高陆地生态系统地下部分对碳的固定7以及土壤矿质化过程。CO2浓度升高对水生植物的影响的研究比陆生植物要滞后至少十年5，这在一定程度是由于它们的经济重要性低于农作物。淡水浮游植物是湖泊、水库和其它淡水水域中的主要初级生产者。因此，大气CO2浓度升高对淡水浮游植物生长和光合作用的影响是非常重要的研究内容。国外学者在70年代就提出CO2浓度升高与海洋生物关系的问题8，80年代初分析了大气CO2浓度升高可能对海洋表层海水的碳酸系统和PH产生影响9。近年来，CO2浓度升高对海洋藻类的影响得到了研究。例如：Gao et al. （1991，1992）证明了CO2浓度升高促进红藻（条斑紫菜Porphyra yezoensis和江蓠Gracilaria spp.）的生长，提高了缘管浒苔（Enteromorpha linza）、铁钉菜（Ishige okamurae）和海萝（Gloiopeltis furcata）的光合速率10；Riebesell et al.（1993）通过室内实验推测CO2浓度升高将促进海洋微藻的生长；Hein & Sand-Jensen (1997)证明CO2浓度升高将提高海洋浮游植物的初级生产力。大型海藻广泛分布于潮间带以下的渐深带，约占海洋初级生产力的10%11，在近岸碳循环中起重要作用。一些海藻的光合作用仅利用CO212，但是大多数海藻可利用HCO3-13，14。通常借助于细胞表面的碳酸酐酶将HCO3-转化成CO2，然后吸收和加以固定。在光合固碳过程中，藻类（包括海洋和淡水藻类）像陆地高等植物一样以CO2为Rubisco的羧化底物。虽然CO2的分压在水中与在大气相比没有明显差别，但是水环境和陆生环境有很大差别，在水环境中CO2的扩散速率比在空气中慢104倍15。现在的大气CO2浓度为360mol-1，与大气平衡时海洋表层水中无机碳浓度为2mmol/L（18 oC），大约95%的无机碳形成为HCO3-，CO2为10mol-1。这个浓度比Rubisco饱和时所需的CO2浓度低很多，因此在缺乏CO2浓缩机制（CCM）情况下，海洋浮游生物在光照充足时期生长将受到无机碳的限制15，16。经过近20年的研究表明，许多海洋浮游生物具有无机碳浓缩机制（CCM）（虽然这种机制在不同的生物体中其效率有较大差别）17-21。研究表明，当CO2浓度很高时，碳酸酐酶活性降低或是消失，HCO3-的运输能力降低；当生长在低CO2中时，微藻细胞对无机碳的亲和力大大增强，而且它会诱导产生CO2浓缩机制来适应这种低浓度的CO2环境，同时其生理状态也会发生变化。在蓝藻Synechcloccus中当细胞从高CO2条件转移至低CO2条件下时，它们也诱导形成高光合无机碳亲和力（其亲和力一般比绿藻更高），而溶液中的总DIC可能是诱导CCM表达的关键信号分子22，23。因此，许多真核微藻和大藻以及所有的海洋细菌的光合速率都不受与大气CO2平衡时海水中无机碳浓度限制24，25。不过许多海草（marine embryophytes, ie seagrasses）的光合作用仍受海水中无机碳的限制25，26。但是海洋浮游植物的生长是否受无机碳的限制还存在许多争议，还需要大量的实验来检验15。蓝藻水华暴发和蓝藻毒素已成为世界性环境问题，蓝藻水华污染所带来的主要危害之一是藻毒素的产生，在已发现的各种藻毒素中，微囊藻毒素的毒性较大，危害最严重。目前，有关微囊藻毒素的毒性研究大多数集中在动物、高等植物上。藻类作为水生生态系统的初级生产者，其种类的多样性和初级生产量直接影响水生态系统的结构和功能27。在对于集胞藻6803的研究中，国内外主要研究的是集胞藻6803所分泌的藻毒素对于生态环境所造成的破坏以及影响，而很少有对于集胞藻6803的CO2浓缩机制的研究，因此加强此方面的研究对于了解水华产生机制以及水华的治理有着极其重要和深远的意义。本文主要是研究集胞藻6803的CO2浓缩机制，即通过各种抑制剂对该藻吸收外源无机碳的影响，来讨论其可能的运输机制。1.材料和方法：1.1 实验材料：藻种来自于中国科学院武汉水生生物研究所。1.2 聚胞藻的培养条件：以BG11为基础培养基（表1），将藻液接种到大培养瓶中。按BG11:A5=500:1的体积比加入A5溶液，以BG11:NaNO3=250：1的体积比加入NaNO3溶液(0.1molL-1)，置于人工气候箱（ROH-01型）中通气培养4-5天。培养温度为25 ，光照强度为90 molm-2s-1,每天光照12小时。当细胞处在对数生长期时开始取样，用于不同条件下的再培养。表1 集胞藻6803BG11培养成分Table 1 composition of BG11 medium （unit：mg）BG11的成分：MgSO4 7H2O 750 Na2-EDTA 10 Citric acid 60 FeSO4.7H2O 60CaCl2 270 Na2SiO3.9H2O 580Na2CO3 200 K2HPO4 623A5的成分：H3BO3 28600 MnSO4.H2O 15460ZnSO4.7H2O 2220 CuSO4.5H2O 790（NH4）6.Mo7O24.4H2O 2850 CoCl2.6H2O 400注：按上述顺序依次加入称量好的药品溶入10L蒸馏水中每种药品在水中溶解完全后，再加入下一种药品1.3 测定方法： 1.3.1 光合放氧量测定：细胞的光合放氧测定用Clark-型氧电极（Chlorolab2, Hansatech Instruments）, 测定时反应杯的温度为25 ，光强为400 molm-2s-1。在5000 g下离心5分钟，收集生长在对数期藻细胞，用H2SO4+Tris洗涤一次，然后悬浮在1.5 ml有20mmolL-1H2SO4+Tris的缓冲液中（pH 8.2），将悬浮液转移至电极反应杯。整个反应过程中反应杯中O2浓度通过吹N2保持在低于30%水平。首先在光照下让细胞把胞内“CO2”耗竭，直至净放氧为零，然后每隔1-2分钟添加不同浓度的KHCO3(表2)，测定细胞的光合放氧速率。K1/2（DIC）值由无机碳依赖的光合放氧曲线通过Michaelis-Menten方程拟合给出。V=Vmax*S/(K1/2（DIC）+S)S：DIC或CO2浓度； V：给定无机碳浓度下的净光合放氧速率； Vmax：饱和无机碳浓度下的净光合放氧速率； K1/2（DIC）：达到最大光合速率一半时所需的无机碳浓度。 1.3.2 叶绿素含量的测定： 按Chen的方法：将每次放氧量测定完后的藻液离心，倒掉上清液；用1ml甲醇（浓度99.5%）悬浮，置于冰箱内冷冻。取出冷冻的藻液离心，收集上清液：再用1ml甲醇悬浮藻细胞，第二次离心，收集上清液，合并两次上清液，用甲醇定容至10ml，于663nm处比色（OD663）。表2 加入的不同浓度KHCO3与反应杯中KHCO3最终浓度反应槽中最终浓度(M)加入的量(L) 加入的溶液浓度(mM)207.54407.54807.581607.5163207.5326401532160014.41003600152005600152007600152009600152001.3.3 计算： 叶绿素含量：Ca(ug*ml-1)=11.8*OD663*10/1.5 放氧量计算：V（umol*mg-1*h-1） =Rate*1000*60/Ca1.4 药品：DPC Diphenylamine-2carboxylateDIDS 4,4-diisothiocyanato-stilbene-2,2-disulfonic acid SITS 4-acetamino-4-isothiocyanato-stilbene-2,2-disulfonicacid NPPB 5-Nitro-2-(3-phenylpropyl-amino)benzoic acidBTP BIS-TRIS propane2. 结果:图1 不同浓度的抑制剂SITS在低浓度KHCO3溶液中对集胞藻6803的抑制作用Figure1The relative photosynthetic rate of Synechocystis PCC6803 under low concentration of KHCO3with different concentrations of inhibitor SITS. 图2 不同浓度的抑制剂DIDS在低浓度KHCO3溶液中对集胞藻6803的抑制作用Figure2The relative photosynthetic rate of Synechocystis PCC6803 under low concentration of KHCO3with different concentrations of inhibitorDIDS.图3 不同浓度的抑制剂DPC在低浓度KHCO3溶液中对集胞藻6803的抑制作用Figure3The relative photosynthetic rate of Synechocystis PCC6803 under low concentration of KHCO3with different concentrations of inhibitor DPC. 图4 不同浓度的抑制剂NPPB在低浓度KHCO3溶液中对集胞藻6803的抑制作用Figure4The relative photosynthetic rate of Synechocystis PCC6803 under low concentration of KHCO3with different concentrations of inhibitor NPPB.Figure 1: 不同浓度的抑制剂SITS在低浓度KHCO3溶液中对集胞藻6803的抑制作用如图所示：6803在分别加入50umL-1和100umL-1的KHCO3后，再加入200umL-1的SITS，其抑制后的光合放氧速率分别是加入SITS前的75%和81%；6803在分别加入50umL-1和100umL-1的KHCO3后，再加入400umL-1的SITS，其抑制后的光合放氧速率分别是加入SITS前的73%和77%。说明SITS对集胞藻6803的HCO3-的亲和性抑制作用不明显。Figure 2: 不同浓度的抑制剂DIDS在低浓度KHCO3溶液中对集胞藻6803的抑制作用如图所示：6803在分别加入50umL-1和100umL-1的KHCO3后，再加入200umL-1的DIDS，其抑制后的光合放氧速率分别是加入DIDS前的75%和82%；6803在分别加入50umL-1和100umL-1的KHCO3后，再加入400umL-1的DIDS，其抑制后的光合放氧速率分别是加入DIDS前的72%和78%。说明DIDS对集胞藻6803的HCO3-的亲和性抑制作用不明显。Figure 3: 不同浓度的抑制剂DPC在低浓度KHCO3溶液中对集胞藻6803的抑制作用如图所示：6803在加入50umL-1的KHCO3后，再分别加入50umL-1、100umL-1、200umL-1、400umL-1的DPC，其抑制后的光合放氧速率分别是加入DPC前的25%、16%、7%、2%；6803在加入100umL-1的KHCO3后，再分别加入50umL-1、100umL-1、200umL-1、400umL-1的DPC，其抑制后的光合放氧速率分别是加入DPC前的50%、18%、10%、4%。并且随着抑制剂的浓度的增加，其抑制效果也随着显著增加，当达到200umL-1时，再增加抑制剂的浓度时，抑制作用增加缓慢。说明DPC对集胞藻6803的HCO3-的亲和性抑制作用十分显著。Figure 4: 不同浓度的抑制剂NPPB在低浓度KHCO3溶液中对集胞藻6803的抑制作用如图所示：6803在加入50umL-1的KHCO3后，再分别加入25umL-1、50umL-1、100umL-1、200umL-1的NPPB，其抑制后的光合放氧速率分别是加入NPPB前的44%、32%、17%、10%；6803在加入100umL-1的KHCO3后，再分别加入25umL-1、50umL-1、100umL-1、200umL-1的NPPB，其抑制后的光合放氧速率分别是加入NPPB前的47%、34%、27%、23%。并且随着抑制剂的浓度的增加，其抑制效果也随着显著增加，当达到200umL-1时，再增加抑制剂的浓度时，抑制作用增加缓慢。说明NPPB对集胞藻6803的HCO3-的亲和性抑制作用十分显著。3.讨论关于无机碳浓缩机制（CCM）的研究工作在蓝藻和淡水绿藻中已经有很多报道19。在蓝藻Synechococcus中存在Na+依赖和非依赖的HCO3-吸收以及CO2吸收利用20。在绿藻Chlamydomonas reihardtii 和Chlorella sp.中已报道二者都能既主动吸收CO2又能吸收HCO3-21。我们的实验结果得出：与不加Na+相比，在加Na+条件下，藻细胞的无机碳亲和力显著提高。这说明Na+/HCO3-运输载体可能参与HCO3-的主动运输，这与Synechococcus PCC 7942 中已经观察到Na+的流动可以满足HCO3-的胞内积累结果一致。这说明：参与HCO3-主动运输的Na+/HCO3-运输载体可能在蓝藻中普遍存在。在CO2浓缩机制中，CA酶起了很重要的作用，它促使HCO3-和CO2之间的相互转换27,28，即当外界CO2浓度较低时，胞外CA酶加速外面的HCO3-向CO2转化，CO2被运输进入细胞后，胞外CA是无机碳浓缩机制的重要组成部分，其对HCO3-亲和力的大小与K1/2值成反比，即K1/2值越大，表示对HCO3-亲和力越小，反之亦然。胞内CA的功能可能是提高Rubisco羧化位点的CO2浓度，胞内酶对于藻细胞在CO2固定过程中有效利用无机碳是非常重要的12。我们的实验得出：在抑制剂EZ存在条件下，藻细胞的无机碳亲和力显著降低。我们发现：EZ是胞内CA的抑制剂，它抑制CA的活性，从而使细胞对无机碳亲和力下降，这说明胞内CA在提高细胞的光合固碳效率和低CO2对其光合固碳的限制作用过程中起重要作用。这些结果表明铜绿微囊藻的胞内碳酸酐酶通过催化胞内碳库中的HCO3-快速转化成CO2，提高胞内CO2的有效供应，从而提高其光合固碳效率和对低CO2的适应能力。关于无机碳浓缩机制（CCM）调节机理的研究在蓝藻和绿藻中已经有不少的报道22, 23。在绿藻Creindardtii 和Chlorella sp.中高CO2浓度（5）生长条件抑制了它们的CCM，降低了它们对外源无机碳的亲和力，而当从高CO2转移至低CO2浓度（0.035）时其CCM被诱导，提高了它们对外源无机碳的亲和力24。许多报道表明溶液中的CO2浓度可能使调节CCM表达的关键信号分子25。在蓝藻Synechococcus 中当细胞从高CO2条件转移至低CO2条件下时它们也诱导形成高光合无机碳亲和力（其亲和力一般比绿藻更高）。而溶液中的总DIC可能是诱导CCM表达的关键信号分子26。有我们的实验得出，Na+/HCO3-运输载体可能参与HCO3-的主动运输。这与溶液中的总DIC可能是诱导CCM表达的关键信号分子结果一致。并且我们的实验得出：CCM中，在有阴离子通道抑制剂DPC，DIDS存在条件下，藻细胞的无机碳亲和力都降低，这说明HCO3-进入细胞与阴离子通道有关。并且DPC的加入使藻细胞的无机碳亲和力显著降低，而DIDS的加入使藻细胞的无机碳下降不明显，这说明在CCM中藻细胞HCO3-的运输通道可能对DPC敏感，而对DIDS不敏感。从以上结果可以看出：1 与不加Na+相比，在加Na+条件下，藻细胞的无机碳亲和力显著提高。这与Synechococcus PCC 7942 中已经观察到Na+的流动可以满足HCO3-的胞内积累结果一致，这说明Na+/HCO3-运输载体可能参与HCO3-的主动运输；并且由本实验及前人的工作可以得出：参与HCO3-主动运输的Na+/HCO3-运输载体可能在蓝藻中普遍存在。2 在抑制剂EZ存在条件下，藻细胞的无机碳亲和力显著降低。我们发现：EZ是胞内CA的抑制剂，它抑制CA的活性，从而阻碍HCO3-进入细胞，由此可以说明胞内CA对HCO3-的运输非常重要。3 在阴离子通道抑制剂DPC，DIDS存在条件下，藻细胞的无机碳亲和力都降低，这说明HCO3-进入细胞与阴离子通道有关。并且DPC的加入使藻细胞的无机碳亲和力显著降低，而DIDS的加入使藻细胞的无机碳下降不明显，这说明藻细胞HCO3-的运输通道可能对DPC敏感，而对DIDS不敏感。参考文献1 陆时万，徐祥生，沈敏健，吴国芳等 植物学(上、下)。高等教育出版社，1988.2 张其德，卢从明，冯丽洁等(1996)，CO2加富对紫花苜蓿光合作用原初光能转换的影响。植物学报，38（1）：7782.3 彭长连，林植芳，孙梓健，林桂珠，陈怡竹（1998），水稻光合作用对加富CO2的响应。植物生理学报，24（3）：309312.4 汪杏芬，白克智，匡廷云（1997），大气 CO2浓度倍增对植物暗呼吸的影响。植物学报，39（9）：849854.5 Bowes G.1993.Facing the inevitable :Plants and increasing atmospheric CO2. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44:309332.6 Kimball BA，Mauney JR，Nakayama FS.1995. Productivity and water use of wheat under free-air carbon dioxide enrichment. Global Change Biology. 1:429442.7 Hungate BA. 1997. The fate of cabon in grasslands under carbon dioxide enrichment. Nature. 388: 576579. 8 Smith AD & Roth AA .1979. Effect of carbon dioxide concentration on calcification in the red coralline alag. Plant physiol.9 Stumm W, Morgan JJ.1996. Aquatic Chemistry. John Wiley & Sons, New York: 171185.10 Gao K, Ji Y, Aruga Y(1999) Relationship of CO2 concentrations to photosynthesis of intertidal macroalgae during emersion. Hydrobiologia. 398/399: 355359.11 Smith SV. 1981. Marine Macrophytes as a global carbon cycle. Protist 150:2532.12 Beer S,1989. Photosynthesis and photorespiration of marine angiosperms. Aquat Bot. 34:153166. 13 Gao k, Mackinley KR. 1994. Use of macroalgae for marine biomass production and CO2 remediation:a review. J.Appl. Phycol. 6: 456014 Maberly SC, Raven JA, Johnston AM.1992. Discrimination between 12C and 13C by marine plants. Oecologia. 91:481492.15 Raven JA, Falkowski PG. 1999. Oceanic sinks for atmospheric CO2. Plant Cell Environ. 14:779794. 16 Raven JA .1970. Exogenous inorganic carbon sources in plant photosynthesis. Biological Reviews. 145:167221. 17 Beardall J, Beer S, Raven JA. 1998a. Biodiversity of marine plants in an area of climate change: some predictions based on physiological performance. Botanica Marica. 41: 113123.18 Giordano M, Bowes G.1997. Gas exchange and carbon allocation in Dunaliella salina cells in response to nitrogen source and CO2 concentration during growth. Plant physiol. 115:10491054.19 Miller AG, Turpin DH, Canvin DT. 1984. Growth and photosynthesis of the cyanobacterium Synechococcus UTEX625. Plant Physiol. 78:8795.20 Raven JA.1991. Physiology of inorganic C acquisition and implications for resource use efficiency by marine phytoplankton: relation to increased CO2 and temperature. Plant Cell Environ. 14: 779794.21 Raven JA. 1992. Present and potential uses of the natural abundance of stable isotopes in plant sciences,with illustrations from the marine environment. Plant Cell Environ. 15: 10831090.22 Mayo WP, Williams TG, Colman B. 1999. Quantification of the rate CO2 formation in the periplasmic space of microalgae during photosynthesis. Plant Cell Environ. 22: 397406.23 Sultemeyer DF, Klughammer B, Badger MR, Price GD. 1998. Fast induction of highaffinity HCO3- transport in cyanobacteria. Plant Physiol. 116: 183192.24 Tortell PD, Reinfelder JR, Morel FMM. 1997. Active uptake of biocabonate by diatoms. Nature 390: 243244.25 Beardall J, Johnston AM, Raven JA. 1998b. Environmental regulation of CO2 concentrating mechanisms in microalgae. Can J of Bot. 76:10101017.26 Raven JA. 1997. Inorganic carbon acquisition by marine autotrophs. Adv. Bot. Res. 27: 85209.27食用蓝藻葛仙米的二氧化碳浓缩机制及其生理生态学研究,刘继勇，华中师范大学04级硕士论文；20040501。28 Kaplan A,Reinhold L.1999. CO2 concentrating mechanisms in photosynthetic microorganisms.Annu Rev Plant Mol Biol.50: 539-570.29 Espie GS,Kandasamy RA.1994.Monensin inhibition of Na+-dependent HCO3-transport distinguishes it from Na+-independent HCO3- transport and provides evidence for Na+/HCO3- symport in the cyanobacterium synechococcus UTEX 625. Plant Physiol. 104: 1419-1428.30 Sultemeyer DF, Fock HP, Canvin DT.1991.Active uptake of inorganic carbon by Chlamydonomas reinhardtii: evidence for simultaneous transport of HCO3- and characterization of active CO2 transport.Can.J Bot.69:995-1002.31 Goleman JR. The molecular and biochemical analyses of CO2-concentrating mechanisms in cyanobacteria and microalgae. Plant Cell Environ, 1991, 14:861867.32 Moroney JV, S