植物酯酶的提取及纯化研究-环境工程毕业论.doc

南京林业大学 本科毕业设计（论文）题 目：植物酯酶的提取及纯化研究学 院： 化学工程学院 专 业： 环境工程 学 号： 070205223 学生姓名： 王康 指导教师： 范钦华 职 称: 讲师 二零一一 年 五 月 二十日摘 要 本文通过实验条件筛选，初步确定了小麦酯酶的提取纯化方法及不同浓度的有机磷农药对酶活性的抑制效果，结果发现：如下： 1.通过单因素条件改变实验，确定了提取小麦粗酶液的固液比、温度、缓冲液pH值、提取时间、小麦粉目数的最优条件。 2.通过一次盐析及二次盐析，确定了通过盐析法初步提纯酶液的饱和度条件及提纯效果。 3.验证了超滤法在小麦酶液纯化过程中去除盐分的可行性及对酶液纯化的效果。 4.通过Sephadex G100凝胶层析后，顺利将酶液的比活力提高了7.2倍，确定了纯化酶液的方法。 5.通过绘制毒死蜱对小麦脂酶的活性抑制标准曲线，确定了小麦脂酶对于有机磷农药抑制作用的线性表现。AbstractIn this paper, the extraction and purification plants for lipase extraction and purification of the conditions, and the mapping of the organic phosphorus pesticide on wheat lipase inhibition standard curve, through literature review and selection of experimental conditions, initially identified wheat lipase Extraction and purification method and explore the inhibitory activity of organophosphorus pesticides for the preliminary nature of the experimental results are as follows: 1.Conditions by changing a single factor experiment, the crude enzyme extract of wheat solid-liquid ratio, temperature, buffer pH, extraction time, the best wheat flour mesh conditions. 2.And the second by a salting salting salting method determined by the initial saturation of purified enzyme solution conditions and the purification effect. 3.Validated ultrafiltration method in the wheat enzyme purification process to remove salt feasibility and effect of the purified enzyme. 4.By Sephadex G100 gel chromatography, the successful enzyme specific activity will be increased 7.2 times to determine the method of solution of pure enzyme. 5.By drawing on wheat of chlorpyrifos inhibited the activity of lipase standard curve to determine the organic phosphorus pesticide for wheat lipase inhibition of linear performance.目 录前言.61.文献综述.7 1.1有机磷农药.7 1.1.1有机磷农药的特点.7 1.1.2有机磷农药的毒性.7 1.2农药检测方法.8 1.2.1分析检测法.8 1.2.2酶抑制法.10 1.2.3两种酶抑制法比较.11 1.2.4动物胆碱脂酶法.11 1.2.5植物脂酶抑制法.14 1.3植物脂酶的纯化及检测.15 1.4总结.152. 实验药品、器材及方法.17 2.1.1实验药品与材料.17 2.1.2实验器材.17 2.2试剂配置.17 2.2.1磷酸缓冲液配置.17 2.2.2 0.8%固兰B盐溶液（显色剂）配置.18 2.2.3-乙酸萘脂丙酮溶液.18 2.2.4考马斯亮蓝（显色剂）配置.18 2.2.5小麦粉制取.18 2.3实验步骤.19 2.3.1-奈酚标准曲线绘制.19 2.3.2粗酶液提取.19 2.3.3酶活的测定.19 2.3.4蛋白质含量测定.19 2.3.5硫酸安盐析.20 2.3.6超滤.20 2.3.7凝胶柱层析.20 2.3.8毒死蜱抑制率曲线制作.213. 实验结果.22 3.1 -萘酚标准曲线.22 3.2蛋白质标准曲线.22 3.3粗酶液提取单因素条件结果.23 3.3.1固液比.23 3.3.2培养时间.24 3.3.3缓冲液pH值.24 3.3.4培养温度.25 3.3.5小麦粉目数.26 3.3.6粗酶液提取优化条件总结.26 3.4一次盐析.26 3.5二次盐析.29 3.6超滤.29 3.7凝胶柱层析.29 3.8毒死蜱对酶活抑制标准曲线.314.实验结论.32致谢.33参考文献.34前 言农药作为重要的农业生产资料，在农产品生产中对病、虫、草、鼠害的防治起到了非常重要的作用，为人类创造了巨大的经济效益，但同时也给环境安全和人体健康带来了一定威胁。在农业生产中应用的农药主要可分为四大类:第一类是以滴滴涕、六六六为代表的有机氯杀虫剂，这类杀虫剂由于致畸、致癌、致突变、高残留等缺点，已停止生产和使用;第二类是有机磷杀虫剂;第三类是氨基甲酸酷类杀虫剂;第四类是拟除虫菊酷类杀虫剂。在所有的农药中，有机磷农药是目前最常用的一类农药，它包括杀虫剂、杀菌剂、除草剂等，具有品种多、防治对象多、杀虫效率高等特点，在各种农作物尤其是水果蔬菜生产中广泛应用。有机磷农药中的部分品种具有高毒性的特点，大量使用会造成环境污染、作物药害及人畜中毒。大多数有机磷农药具有手性，它们的一对对映异构体之间存在着不同的生物活性，包括毒性、酶抑制活性和生物降解能力等。通过非手性分析得到的农药浓度所指示的可能与实际的生态毒理学效应并不相符，所以随着人类对环境污染物认识的不断深入，在对映体水平上研究农药的环境毒理学将会成为必然。近年来，由蔬菜中有机磷农药残留所引起的中毒现象十分严重。据世界卫生组织统计，全世界每年农药中毒人数约30万人，其中有机磷农药中毒占70%。我国专家对为数众多的农药品种进行分级排队，从中筛选出的十种强污染农药中，有七种属于有机磷类，可见，农药残留检测的重点应该放在有机磷类杀虫剂。目前，在我国农药残留快速检测技术应用最多的是酶抑制法，其较高的灵敏性、准确性及低成本等优点已受到人们的广泛关注。酶抑制检测法由于具有能在短时间内检测大量样本，成本低、对操作人员技术要求不高、易于在农产品生产基地和批发市场推广等优点而受到广泛重视。本法的关键材料是敏感酶源，植物醋酶作为酶抑制法的生物识别元件由于其来源广泛、价格低廉，而且检测的灵敏性好，检测限低，可以满足农药残留检测普及化、市场化的要求，近年来得到了较多的关注，但深入研究较少。因此本文选择小麦为酶源，深入研究了粗酶液提取的最佳条件，酶的进一步分离纯化以及毒死蜱对于小麦脂酶的抑制的线性性质。1.文献综述1.1有机磷农药1.1.1有机磷农药的特点 早在20世纪30年代，德国的SChrader就合成了一系列有机磷酸醋类化合物，并发现其中一些具有杀虫杀瞒活性。目前全世界有机磷杀虫剂的品种约为100余种，常用的有50多种。我国农药市场上有机磷品种30余个，占我国杀虫剂品种的38%，而产量却占75%。有机磷杀虫剂作为我国使用最广泛、用量最大的一类杀虫剂，其品种繁多，性能也千差万别。综合起来主要具有以下几个方面的特点1:绝大多数有机磷杀虫剂在碱性条件下易分解。因此，不能与碱性物质混用在自然环境和动植物体内易降解。因此，在高等动物体内无累积毒性，正确使用时残留问题小，不致污染环境。杀虫效率高，广谱，作用方式多样(如触杀、喂毒、熏蒸)，不少品种为内吸杀虫剂，且许多品种同时又是杀瞒剂。化学结构复杂多变，品种多，适用范围广。毒性差异大。辛硫磷、马拉硫磷、敌百虫等毒性低，而对硫磷、甲拌磷为剧毒品种。总的来说，有机磷杀虫剂的毒性偏高。易解毒。对有机磷杀虫剂引起的急性中毒有特效的解毒药，如解磷定和阿托品。与有机氯农药、拟除虫菊醋类杀虫剂相比，害虫对有机磷杀虫剂的抗药性发展缓慢。1.1.2有机磷农药的毒性 目前国内外普遍使用的有机磷农药被认为是非持久农药，其降解半衰期一般在几周至几个月。研究表明，有机磷农药在某些环境条件下也会有较长的残存期，并在动物体内产生蓄积作用;模拟实验也显示，在模拟降雨19d后，在地表径流中仍能检测到痕量的有机磷农药。据研究，对硫磷在苹果上降解半衰期为15一17d，在储存期，残留于苹果上的对硫磷的降解半衰期为13d2；;；长期食用农药残留超标的农副产品，虽然不会导致急性中毒，但可能引起人和动物慢性中毒，导致疾病的发生，甚至影响到下一代。试验证实，农药可能破坏某个特定的身体器官比如肝脏、肾、骨髓等，而且还会改变酶的活性，长期接触农药还会对人体有致畸、致癌作用。有关流行病学调查显示，恶性肿瘤的发病率逐年上升与蔬菜中的农药残留有关。 作为典型的酶毒剂，有机磷农药可以通过消化道摄入，也可以通过皮肤、粘膜、呼吸道吸收3。有机磷的急性毒性主要归因于对胆碱能神经突触后膜上的乙酞胆碱醋酶活性的抑制，使酶不能起催化乙酞胆碱水解的作用，导致组织中能使神经过度兴奋的乙酞胆碱过量蓄积。这种乙酞胆碱传导介质代谢紊乱，可导致迟发性神经毒性，引起运动失调、昏迷、呼吸中枢麻痹、瘫痪甚至死亡。有实验证明对氧磷和对硫磷酞化人脑胆碱醋酶一般约经4天即“老化”，酶活不易再恢复4。1. 2农药检测方法1.2.1分析检测法 农药残留分析方法是对待测样本中痕量农药残留进行定量和定性分析的技术，农药残留分析技术既需要精细的微量操作手段，又需要高灵敏度的痕量检测技术。目前常用的方法包括色谱法、超临界流体技术以及近些年来发展迅速的快速检测法。(l)超临界流体技术超临界萃取技术 超临界流体萃取技术(supereritiea一FluidExtraetion，sFE)是利用超临界流体(SF)密度大、粘度低、扩散系数大、兼有气体的渗透性和液体的分配作用的性质，将样品中的待测物质溶解并从基体中提取出来的一种新的分离技术。它能同时完成萃取和分离两步操作，分离效率高、操作周期短、传质速度快、溶解力强、选择性高、无环境污染。近年来，SFE技术在农药残留分析中的应用随着SF的性质、萃取机理、过程控制的深入研究而日益广泛，并显示其独特的优势。Juhler在用SF技术研究牛肉中的有机磷农药(OPS)和非有机磷农药(NOPS)及其混合物的残留量时，对超临界CO:的温度、压力、流量和提取时间对回收率的影响进行了考察，选择了适合不同样品、不同农药类型的操作条件，获得较好的回收率78%一95%和满意的检出限0.01一0.03m叭g，并确定了适合几种农药残留联合分析的萃取条件5。将SFE萃取过程与气相色谱(GC)、液相色谱(HPLc)、毛细管柱液相色谱一GC联用可实现过程的自动化，减少样品用量、缩短分析时间、提高重现性、灵敏度和检出限。超临界流体色谱技术 超临界流体色谱技术(S叩ereritiealFluidChromatogaphy，SFC)是以超临界流体为色谱流动相的分离技术，可以在较低温度下分析分子量较大、对热不稳定的化合物和极性较强的化合物;可与各种气相、高效液相色谱检测器匹配;可与红外、质谱联用。SFC弥补了GC和HPLC的不足，适用于分析热不稳定而HPLC又不易分析的化合物。许多在GC或HPLC上需要经过衍生化才能分析的农药，都可以用SFC直接测定。SFC可与SFE直接相联，使样品的提取、净化和测定一次完成。SFC与火焰光度检测器连接还可以分析番茄和洋葱中的乐果、马拉硫磷等。(2)色谱法 色谱法是根据分析物质在固定相和流动相之间分配系数的差异达到分离目的，当样品混合物在两相相对运动时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果使混合物得到分离，通过将被分析物质的浓度转换成易被测量的电信号(电压、电流等)，并送到记录仪记录下来。目前应用于农药残留检测的色谱法主要有薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法薄层色谱。薄层色谱法 薄层色谱法是利用被检测物经显色后同标准有机磷农药(OPS)比较来定性，用薄层扫描仪来定量的测定方法。薄层色谱法显色反应类型多，显色剂范围广，快速，具有不受物质的限定，在方法设计、拟定和实际应用上机动灵活，适用于对多种农药检测与鉴定。薄层层析法设备简单，操作方便，展开时间短，定性分离效果好，适用于微量成分的分离和鉴定，也应用于各种有机化合物如亲水性物质或亲脂性物质等的分离、精制和鉴定分析。20世纪70年代，Kumar等对胆碱酷酶使用的显色基质及薄层定量方法进行了研究，近年来，国内开始关注植物胆碱酷酶的研究。杨娟，阮长青等利用有机磷农药抑制植物胆碱酷酶活性的原理，确定了小麦胆碱酷酶液与Q一乙酸蔡醋的酶促反应过程中的最大吸收波长、显色温度、显色时间以及酶液稀释倍数。通过酶抑制法与薄层层析的逐步分离过程相结合分析实现了10种常用有机磷农药的定性分析6，为分离有机磷农药多残留以及植物胆碱酷酶抑制法快速检测有机磷农药残留的深入研究提供依据。气相色谱法 气相色谱法(GC)是以惰性气体为流动相的柱色谱分离技术，是目前检测有机磷农药的国家标准方法，该方法是利用经提取、纯化、浓缩后的OPs注入气相色谱柱，程序升温气化后，不同的OPs在固定相中分离，经不同的检测器检测扫描绘出气相色谱图，通过保留时间来定性，通过峰或峰面积与标准曲线对照来定量。具有即定性又定量、准确、灵敏度高，并且一次可以测定多种成分的优点。美国的EPAMethod1657就是使用GC来测定城市和工业废水中的45种有机磷农药;袁慧娟，宋国新等采用GC从s技术对上市蔬菜中有机磷类农药(甲胺磷、敌敌畏、久效磷、马拉硫磷等9种)残留同时测定。蔬菜样品经超声波提取、简单的净化处理后可直接进样分析。样品加标回收率在70%一127%之间，检测限为0.020.20mg/kg7。该分析方法简便、快速、准确，适用于蔬菜中农残的定性定量分析。高效液相色谱法 高效液相色谱(HPLC)是以液体为流动相采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的一种柱色谱分离技术，常用于挥发及热不稳定性的农药残留分析。李永新等采用高效液相色谱柱分离、紫外检测以及外标法定量，建立了同时测定蔬菜水果中12种农药残留的反相高效液相色谱分析方法。该方法的检测限为0.014林留L一0.0266协留L;在水果中的平均加标回收率为62.2%一118.2%，在蔬菜中的平均加标回收率为52.1%一124.6%8。陈珠灵等采用高效液相色谱法对蔬菜中甲基对硫磷、乙基对硫磷、甲拌磷进行同时分离和检测，以Shim一packVP一ODS为分离柱，紫外检测波长为250nm，该方法所测得的3种有机磷在0.02g/L一2.0g/L范围内具有良好的线性，检出限达1.0g/L一5.0g/L，加标回收率在97.44%一101.22%9。1.2.2.酶抑制法 目前检测有机磷农药残留普遍采用的方法如色谱法、超临界流体技术，检测结果准确，灵敏度高，但成本高，测定时间长，且需要具有一定技术水平的专业人员才能进行操作，只适合在实验室分析;而近些年来兴起的酶抑制法具有操作简便，速度快，适合现场检测、大批样品筛选检测以及我国小规模、分散的销售体系中经常性的现场快速检测，因此作为一种检测农药的常用方法得到广泛应用。而如何选择酶源是实现快速、准确检测的关键。 胆碱脂酶广泛存在于动物的组织中，1953年stedman等首先从马血清中分离出乙酞胆碱脂酶，此后不同来源的乙酰胆碱脂酶相继得到纯化和研究10。目前已分离纯化的动物来源的乙酰胆碱脂酶主要集中在动物肝脏和血液，如猪肝，鸡血等。也有利用蛆蝴以及海洋鱼类，甲壳类动物的神经组织，脑组织分离乙酰胆碱脂酶1113。近年来很多学者致力于从昆虫体内提取乙酰胆碱脂酶如:家蝇、麦二叉蚜、黄猩猩果蝇、烟草天蛾、光叶库蚊、黄粉甲、美洲淤夜蛾、豆荚草盲蜷、马铃薯叶甲、骚扰角蝇、棉铃虫等。迄今为止，酶抑制法进行农药残留检测以从敏感家蝇中提取的乙酰胆碱脂酶效果最佳，其敏感性优于其他来源的乙酰胆碱脂酶，更有进一步研究表明，家蝇羽化后2一3d时其头部的乙酰胆碱脂酶敏感性最高。植物来源的脂酶作为农药残留检测的三种酶标记物之一，由于其来源广泛、价格低廉，近年来得到了较多的关注。但是，几乎所有的研究都是直接以面粉作为酶源，筛选用于农残检测的最佳小麦品种或者是以面粉作为酶标记物，制成酶片，对酶片检测农残显色反应的温度、时间、显色剂的选择等方面进行比较研究。尚未见到用提取纯化的酷酶制品对大量有机磷农药的灵敏性和最低检测限进行研究的报道。1.2.3两种酶抑制法的比较 酶抑制法测定有机磷农药残留是根据有机磷农药的毒性对酶分解底物的抑制作用进行的，其酶源有来自动物的胆碱酷酶和从植物中提取的植物酷酶。动物胆碱酷酶法是基于有机磷农药的毒性抑制乙酞胆碱酷酶催化底物水解生成乙酸和胆碱，后者与5，5一二硫代一双一2一硝基苯甲酸反应，生成黄色产物5一硫代一2一硝基苯甲酸，其在410nln处有最大吸收，测定其在单位时间内的生成量，即可测得乙酞胆碱酷酶的活性。植物酷酶可以催化乙酸蔡酷水解为蔡酚和乙酸，蔡酚与显色剂固B作用形成紫红色的偶氮化合物，从而发生显色反应，具体反应见下式。 有机磷农药能抑制植物脂酶的活性，使反应速率发生变化，紫红色的偶氮化合物产量不同，吸光度值也不同，即酶的活性受到抑制的程度不同14。很多学者经过大量实验，比较了动物脂酶和植物脂酶反应的条件、总脂酶活力和灵敏度，并对其检测条件进行了优化。2004年黄志勇等比较了快速测定蔬菜中有机磷农残的胆碱脂酶抑制法和植物脂酶抑制法，并通过正交实验优化了两种酶抑制法的测定条件。结果发现两种酶抑制快速测定方法均可用于蔬菜中有机磷农残的测定，其加标回收率都达到85%以上，但植物脂酶法测量精密度更胜一筹14。而后对植物脂酶和动物脂酶在不同pH值下的酶活、抑制程度等性质进行的实验研究也表明了动物脂酶中的苍蝇酶、蝇蛆酶与植物脂酶中的小麦脂酶相比，它们的活力和被农药抑制程度处于相近的水平15。可见，植物酷酶与动物酷酶均可用于蔬菜中有机磷农药残留的快速测定，而且两种酶抑制法测量的精密度都较好，准确度也相当。与动物脂酶相比，植物脂酶的酶活、抑制程度等各项指标均不逊色。此外，植物脂酶具有来源方便、成本低的优势，能够稳定而准确地检测到浓度为10-3mol/L的敌敌畏，达到了其安全限值16。1.2.4动物胆碱脂酶法 自从1951年发现有机磷农药在体外也能抑制胆碱脂酶以来，绝大多数研究都是基于动物胆碱脂酶这一原理进行的。目前，胆碱脂酶法检测有机磷的方法主要有酶片法、酶抑制分光光度法以及胆碱脂酶生物传感器法。(1)酶片法酶片法是将敏感生物的胆碱脂酶和生色基质液经固化处理后加载到滤纸片或类似载体物质上，基质在胆碱脂酶的催化作用下迅速分解，生成胆碱(蓝色）和乙酸。有机磷和氨基甲酸酷农药对胆碱脂酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变。将胆碱脂酶与样品提取液反应，若胆碱脂酶受到抑制，基质就不能水解、不变色，表明样品中含有机磷和氨基甲酸脂类农药(呈阳性)。目前广泛使用的速测箱、速测卡法均属于酶片法。近年来国内常见的用固化含有胆碱脂酶和靛酚乙酸醋试剂的试纸片建立的适合我国蔬菜中部分农药残留限量的现场监督检测的速测卡法，其检出限一般在0.3一3.5m叭g，检出时间为15min，操作简单，速度快，测试成本低廉17。也有学者利用马血清中的乙酰胆碱脂酶与底物氯化乙酞胆碱作用，根据反应前后的pH值变化及指示剂的颜色变化情况，建立的一种可以作定性及半定量分析的酶片快速检测法，应用于实际检测黄瓜中农药残的效果较好18。在国外方面，Hwa一YoungNO和YoungAhKim等用涂有乙酰胆碱脂酶的试纸检测样品中农药残留的含量，实验表明以HybondN+为酶载体，苯基乙酸脂为底物最合适，此时有机磷和氨基甲酸酷类农药的检出限分别为:10-6102和10-6100g/mL，实验还发现:与对氧磷相比，试纸法对被氧化的对氧磷更敏感19。(2)酶抑制分光光度法 有机磷类农药对乙酰胆碱脂酶活性有抑制作用，浓度越高，抑制率越高。通过分光光度计测定吸光度随时间的变化值，并与空白对照比较求得酶抑制率，从而判定样品中是否有有机磷或氨基甲酸酷类农药的存在。该法所需仪器设备简单、灵敏度高、前处理简单、检测时间短，可及时检测含农残的蔬菜。曾有报道以鸡脑为酶源提取乙酞胆碱醋酶，利用酶抑制分光光度法检测油白菜中有机磷农药(对硫磷、辛硫磷、氧化乐果)的残留量，可使3种农药的回收率分别达到97%，101%和99%。Ingridwalt等从镰刀菌pisi中提取角质酶，利用酶抑制分光光度法和%孔板法同时检测多个样品中有机磷和氨基甲酸酷类杀虫剂的含量，该法对毒死蟀和对氧磷的检测限分别为2.6mg/L和0.04mg/L。(3)胆碱酷酶生物传感器胆碱醋酶生物传感器法是目前农药残留速测技术中的研究热点，其在研究方法多样化、灵敏度、准确性、响应时间等方面都具有很大优势。方法较为多样化，主要包含了电化学型、光化学型以及压电型，与本文关系不大，不做具体介绍。1.2.5植物脂酶抑制法 酶法快速检测农药残留的方法中，多采用敏感家蝇头部获得的乙酞胆碱醋酶，但是动物酷酶常表现为保持期短，需冷冻低温保存。而植物酷酶酶源丰富，提取和保存较为方便，只需以一定比例的水或缓冲液混合离心获得的上清液即可作为粗酶液，并在一4保存即可。而且与动物醋酶相比，植物酷酶抑制法的测量准确度和精密度均不逊色，能达到快速检测农药残留的目的。1987年，中国农业部环保所研制出一种酶片和显色基质片，不需仪器，即可在田间或菜市场快速测定蔬菜和水果中的有机磷类农药，其检测限为0.5一10mg/kg。而后有人利用自制的植物酶片和高灵敏度化学检测液(速测灵)，使检测出有机磷农药残留的灵敏度达到0.4一10mg/L和0.18一10mg/kg，检测时间为5一10min，检测成本为0.2一0.3元人民币20,21。至此，植物酷酶法检测有机磷农药残留开始受到了研究学者的广泛关注，各方面的研究也随即展开。在酶源的筛选方面，依据对有机磷农药的敏感性而定，许多研究者直接从面粉中提取酶，但不同的小麦酶对农药的敏感性不同即使对于同一品种小麦，产地不同、种植方法不同、所处生长期不同时，其对农药的敏感度也会存在较大差异。因此，需要作进一步的研究，以确定可以进行定量分析而且具有互换性的植物脂酶酶源。在显色液方面，由于酶抑制法检测农药残留常需借助于固蓝B盐和乙酸萘脂组成的生色基质液的显色完成。但该显色液非常不稳定，在室温下40min以后显色能力大大下降，不能再用来测定，需现用现配，这给检测工作带来了诸多不便23。为此，董超等改进了显色剂的配方，将其制成固体显色剂，大大延长了显色剂的有效使用期限，使其在室温下放置3个月后性能不变，且该法对甲胺磷、敌敌畏、对硫磷、辛硫磷等的检出浓度为10-410-7（V/V）24。也有学者改用其它显色剂一2，6一二氯乙酰靛酚，先用植物酷酶水解橙色的2，6一二氯乙酸靛酚，然后用分光光度法测定分解的靛酚(蓝色)吸光度，计算可得有机磷的含量，该法对常用的几种有机磷及氨基甲酸脂类农药的测定限均在0.0015一0.3300mg/L范围内。通过进一步实验比较两种不同显色剂(2，6一二氯靛酚乙脂和固蓝B盐的显色原理与性能，证实了采用2，6一二氯靛酚乙酷既兼顾了底物和显色剂的双重作用，且从显色底物液使用的方便程度、稳定性以及便于现场快速检测等方面看，使用2，6一二氯靛酚乙醋显色剂比用固蓝B盐来显色更具有优越性25,26。进一步研究还发现了小麦酷酶活性与保存温度的关系:在20储存sd酶活只剩余39.6%，在4储藏sd剩余75.6%，酶活衰退较快，而将该酶用液氮在一1%保存sd，酶活仍有97.5%，可见酶的保存需要较低的温度177。近年来研究人员主要利用酶固定化技术解决酶液难以贮藏的问题，如用离子交换树酷作为固定化载体对植物酷酶进行固定化，不仅可使酶的稳定性大大提高，而且与游离酷酶相比，对农药抑制的响应敏感性也有明显的提高。也有选用聚苯乙烯微孔反应板作为酶的载体，将自制的植物醋酶固定在载体上的微孔内壁表面，制成农药快速检测板，检测有机磷和氨基甲酸酷类农药的灵敏度可达0.01mg/kg0.lmg/kg。最近有报道采用原位溶胶一凝胶法制备PVA/SiO2有机/无机杂化溶胶，并将显色剂和植物酷酶分散于溶胶中，制成一类亲水一亲丙酮可调，贮存性好的传感膜。固定于该杂化膜中酶的稳定性在冷藏和室温条件下均比在溶液状态下有明显提高。由此可见，酶的固定化方法在检测农药残留中将起到非常重要的作用。1.3植物脂酶的纯化及检测 关于酷酶的提取纯化，国外的研究大多集中在从假丝酵母、霉菌、假单胞菌、细菌、链球菌、乳酸菌、醋酸菌等菌类中提取，只见到ChristinaeStuhleflder等通过硫酸钱盐析沉淀、Q一sPeharose层析等步骤提取西红柿中的植物酷酶27。国内也仅见到纪淑娟等通过水提取、离心、硫酸馁盐析沉淀以及Sephadex G200凝胶层析从小麦种子中提纯醋酶。关于农药残留检测用植物酷酶的来源，近年来有很多的研究报道直接以市售面粉作为酶原，用面粉中的植物醋酶检测农药残留，在面粉中按一定比例加入蒸馏水，振荡离心所得溶液即为检测用的脂酶溶液。少见有人对植物脂酶的提取、纯化工艺进行进一步的研究确定。 1.4小结 本章介绍了有机磷农药的特点、毒性及其酶抑制活性等方面的研究情况，综述了国内外对酶抑制法检测有机磷农药的研究进展。综上所述，笔者认为，目前植物脂酶的研究多为直接用面粉作为酶源，研究具体测定方法，缺少对植物脂酶这个检测材料进一步纯化的研究，而此项研究对于为进一步提高酶抑制法测定农药的效果以及提高酶抑制法的实际应用性能提供必要的理论支持是十分必要的;随着人们对蔬菜中农药残留及食品安全性问题的关注，进一步探索更有效的分离纯化方法，更大程度地提高植物醋酶法的检测灵敏度和准确性也具有较大的现实意义。此外，研制便宜、简便、准确的农药速测仪器，尽快将研究成果投入实际运用;对植物醋酶的结构进行研究，明确其作用靶标部位都是该领域值得研究的方向。2实验部分2.1实验材料与器材2.1.1药品、试剂与材料 丙酮、甲醇、甲醛、乙醇（95%)、磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵、氯化钠 -乙酸萘脂 -萘酚 固兰B盐 考马斯亮蓝 微孔滤膜 超滤膜 Sephadex G100凝胶 小麦种子 毒死蜱 压缩氮气2.1.2实验器材 高速粉碎机 检验筛（20目100目） 恒温水浴振荡器 恒温水浴锅 台式高速离心机 紫外可见分光光度计 层析柱2.2.试剂配制2.2.1磷酸缓冲液 22.24g磷酸二氢钠定容至1L得0.2mol/L磷酸二氢钠溶液 73.2g十二水合磷酸氢二钠定容至1L得0.2mol/L磷酸氢二钠溶液按下表混合后可得不同PH值的缓冲液。表2.1pH值0.2mol/LNa2HPO4溶液（%）0.2mol/LNaH2PO4溶液（%）5.88.092.05.910.090.06.012.387.76.531.568.57.061.039.07.584.016.08.094.75.32.2.2 0.8%固兰B盐溶液（显色剂）称取3.6g SDS溶解于100ml蒸馏水，称取0.8g固兰B盐，加入SDS溶液中溶解，用微孔滤膜过滤，滤液即为固兰B溶液。2.2.3-乙酸萘脂丙酮溶液 称取0.3724g-乙酸奈脂，溶于丙酮后定容至50mL。2.2.4考马斯亮蓝准确称取350mg考马斯亮蓝溶于100mL95%的乙醇中，然后加入2O0mL88%(w/v)的磷酸，得到Bradford储存液;取30mLBradford储存液，并加入30mL88%的磷酸、1m5L9%5的乙醇、425mL蒸馏水，得到Bradford工作液50OmL，然后用1号滤纸过滤，室温保存于棕色瓶中备用。2.2.5小麦粉制取把挑选好的小麦种子置于高速粉碎机中粉碎，打开开关，每粉碎10秒需关闭20秒，防止过热而使小麦脂酶失活。粉碎完毕后过筛收集至广口试剂瓶保存与冰箱中。2.3实验方法2.3.1-奈酚标准曲线绘制 称取0.0036g-奈酚，溶解于蒸馏水定容至100mL，得