《同位素分析技术》PPT课件.ppt

第第5 5章章 同位素分析技术同位素分析技术 中国农业大学 齐孟文 第第5 5章章 同位素分析技术同位素分析技术 5.5.同位素稀释分析方法同位素稀释分析方法(Isotope dilution (Isotope dilution analysis,ID) analysis,ID) 1.1.直接稀释法直接稀释法 由稀释前后总活度不变由稀释前后总活度不变, ,有有: : 只需部分分离，测定只需部分分离，测定 S S m m 。 例题例题 测定测定152.6mg152.6mg蛋百质水解液中甘氨酸的含量蛋百质水解液中甘氨酸的含量 。为此，将比活度为。为此，将比活度为96.2cpm/mg96.2cpm/mg的的5.07mg5.07mg14 14C- C-甘甘 氨酸加到水解液，混均后分离出部分纯的甘氨氨酸加到水解液，混均后分离出部分纯的甘氨 酸，测得其比活度酸，测得其比活度51.3cpm/mg51.3cpm/mg。 则则 2.2.反向同位素稀释反向同位素稀释(inverse isotope (inverse isotope dilution analysis) dilution analysis) 又称逆稀释，用于测定射性物质，分析公式：又称逆稀释，用于测定射性物质，分析公式： 则，则， 例题例题 测定小球藻测定小球藻14 14CO CO 2 2 光合作用生成的光合作用生成的14 14C- C-蛋白质中蛋白质中 谷氨酸的含量。为此，取适量谷氨酸的含量。为此，取适量14 14C- C-蛋白质水解，从蛋白质水解，从 中分离出部分纯的谷氨酸，测得其比活度为中分离出部分纯的谷氨酸，测得其比活度为 254dpm/mg.254dpm/mg.在同样试样的水解液中，加入在同样试样的水解液中，加入10.7mg10.7mg非非 标记谷氨酸，混合均匀后，分离出部分纯的谷氨酸标记谷氨酸，混合均匀后，分离出部分纯的谷氨酸 ，测得其比活度为，测得其比活度为191dpm/mg191dpm/mg。 则则 3.3.亚化学计量稀释法亚化学计量稀释法(substiochiometry (substiochiometry istope dilution analysis) istope dilution analysis) 从稀释系统和示踪剂原液分离出等量的化合从稀释系统和示踪剂原液分离出等量的化合 物，同时测量，则因物，同时测量，则因 有：有： 等量分离可利用，难溶化合物的溶解度一定，等量分离可利用，难溶化合物的溶解度一定， 一定电量下电解质的析出量一定，吸附剂的饱和吸一定电量下电解质的析出量一定，吸附剂的饱和吸 附量一定，不足萃取剂的饱和萃取量一定等性质。附量一定，不足萃取剂的饱和萃取量一定等性质。 4. 4.改进的亚化学剂量法改进的亚化学剂量法(improved (improved substiochiometry istope dilution analysis)substiochiometry istope dilution analysis) 1 1）定量示踪法）定量示踪法 在分析样品时，同时取含待测物已知的标样，在分析样品时，同时取含待测物已知的标样， 分别加入等量的标记物，则：分别加入等量的标记物，则： 若若 则则 若用亚化学剂量法分离出等量待测物，若用亚化学剂量法分离出等量待测物， 则则 该法不必知道所加入标记物的量该法不必知道所加入标记物的量ww 0 0 ，从而，从而 避免由其因质量小不易准确测量产生的误差。避免由其因质量小不易准确测量产生的误差。 2)2)平行稀释法平行稀释法 该法与上法类似，但当标记物的加入量不能该法与上法类似，但当标记物的加入量不能 忽略时，分析时，可取两份等量样品忽略时，分析时，可取两份等量样品ww x x ，分别，分别 加入不同量的标准待测物加入不同量的标准待测物ww 1 1 和和ww 2 2 ，然后再加等，然后再加等 量标记物，此时其量可忽略，因此：量标记物，此时其量可忽略，因此： 若采用亚化学计量法分离，使若采用亚化学计量法分离，使 ， 有有 则则 5. 5. 在现代仪器尤其是质谱分析中，同位素在现代仪器尤其是质谱分析中，同位素 稀释法常作为一种内标计量分析的手段。稀释法常作为一种内标计量分析的手段。 举例举例 Max haldimann et al. Direct determination of yrinary iodine by Max haldimann et al. Direct determination of yrinary iodine by inductively coupled plasma mass spectrometry using isotope dilution whih inductively coupled plasma mass spectrometry using isotope dilution whih iodine-129.Clinical chemistry1998;44(4):817-824iodine-129.Clinical chemistry1998;44(4):817-824 碘是合成人体甲状腺激素所必需微量营养元素碘是合成人体甲状腺激素所必需微量营养元素 ，甲状腺激素在为维持机体能量代谢，促进人体骨，甲状腺激素在为维持机体能量代谢，促进人体骨 骼发育，脑发育和垂体的支持作用中具有重要的生骼发育，脑发育和垂体的支持作用中具有重要的生 理作用，在碘缺乏地区，推行加碘盐是预防碘缺乏理作用，在碘缺乏地区，推行加碘盐是预防碘缺乏 疾病的国家行动，测定尿碘的浓度是指导补碘的基疾病的国家行动，测定尿碘的浓度是指导补碘的基 本依据，而本依据，而129I I同位素稀释同位素稀释ICPICPMSMS是一种最准是一种最准 确的测定尿碘的方法。确的测定尿碘的方法。 理论：理论： 碘是单同位素元素，核素为碘是单同位素元素，核素为127 127I I，为此只能 ，为此只能 以其长寿命的放射性同位素以其长寿命的放射性同位素129 129I I作为内标。样品 作为内标。样品 添加内标后，混合物中碘同位素核素的原子个添加内标后，混合物中碘同位素核素的原子个 数比，相应于数比，相应于ICP-MSICP-MS测定的测定的129 129I I与 与127 127I I的强度比 的强度比 值值R R，即，即 式中，式中，n n为碘的摩尔数，为碘的摩尔数，a a为碘的同位素为碘的同位素127127或或129129 的丰度，下角标的丰度，下角标s s和和u u分别代表内标和尿样。分别代表内标和尿样。 重排上式，并假设重排上式，并假设 ，则尿样中未知，则尿样中未知 碘的摩尔数为碘的摩尔数为 考虑到质谱过程可能发生同位素质量歧视效应考虑到质谱过程可能发生同位素质量歧视效应 ，使得测定的，使得测定的R R值带有系统偏差，应引入一系统校值带有系统偏差，应引入一系统校 正因子正因子f, f,该因子可由对确切知道同位素构成的标样该因子可由对确切知道同位素构成的标样 测定而确定，即测定而确定，即 式中，式中，R Rtrue true是标准中确切已知的同位素比值，而 是标准中确切已知的同位素比值，而 R Rexp exp是质谱实际测定的同位素比值。 是质谱实际测定的同位素比值。 最终，用最终，用ICP-MSICP-MS测定尿碘的同位素稀释计量关系测定尿碘的同位素稀释计量关系 式为式为 5.2 5.2 体外放射分析体外放射分析(in vitiro radioassay)(in vitiro radioassay) 在体外条件下，以放射性标记的配体为示踪剂在体外条件下，以放射性标记的配体为示踪剂 ，以竞争或非竞争性免疫结合为基础，以放射性检，以竞争或非竞争性免疫结合为基础，以放射性检 测为定量手段的超微量物质分析技术。测为定量手段的超微量物质分析技术。 竞争竞争 放射免疫分析放射免疫分析 抗体抗体-抗源抗源 非竞争非竞争 免疫放射分析免疫放射分析 类型类型 结合蛋白结合蛋白-激素激素 竞争性结合蛋分析竞争性结合蛋分析 受体受体- - 配体配体 竞争性受体竞争性受体- -体配体分析体配体分析 1.1.放射免疫分析放射免疫分析(Radioimmunoassy,RIA)(Radioimmunoassy,RIA) oo 建立在待测抗原物质对标记抗原与限量特异建立在待测抗原物质对标记抗原与限量特异 性抗体的结合竞争抑制基础上的将免疫学反应高性抗体的结合竞争抑制基础上的将免疫学反应高 度特异性与放射性测量高度灵敏性相结合的一种度特异性与放射性测量高度灵敏性相结合的一种 超微量分析方法。超微量分析方法。 oo 特点：灵敏度高特点：灵敏度高(10(10-9 -9 10 10-12 -12g) g)，特异性强，特异性强， 重现性好，抗体可用免疫学方法根据需要制备。重现性好，抗体可用免疫学方法根据需要制备。 1)1)基本概念基本概念 抗原抗原(Antigen,Ag)(Antigen,Ag) 能刺激动物的免疫系统产生能刺激动物的免疫系统产生 抗体抗体( (免疫原性免疫原性) ) ，并与所产生的抗体能特异性，并与所产生的抗体能特异性 结合结合( (反应原性反应原性) )的物质。的物质。 抗原决定簇（抗原决定簇（Antigenic determinant)Antigenic determinant) 在抗原在抗原 分子表面决定抗源与抗体特异性作用的特殊基分子表面决定抗源与抗体特异性作用的特殊基 团，又称为表位团，又称为表位(epitope)(epitope)。 半抗原半抗原 (hapten)(hapten) 具有反应原性而不具有免疫原具有反应原性而不具有免疫原 性的小分子物质。性的小分子物质。 人工抗原人工抗原(Artificial antigen) (Artificial antigen) 把半抗原与载把半抗原与载 体蛋白分子体蛋白分子( (人、牛血清蛋白人、牛血清蛋白) )共键结合形成的共键结合形成的 抗原物质。抗原物质。 标记抗原标记抗原(Labelled antigen) (Labelled antigen) 被放射性核素标被放射性核素标 记的抗原。记的抗原。 抗体抗体(Antibody,Ab)(Antibody,Ab) 由抗原刺激动物机体产生的由抗原刺激动物机体产生的 免疫球蛋白，存在于血清中，所以常又称为抗免疫球蛋白，存在于血清中，所以常又称为抗 血清，能与相应的抗原特异性结合。血清，能与相应的抗原特异性结合。 2)2)基本反原理基本反原理 * *Ag+Ab Ag+Ab *Ag*Ag . . AbAb F F + + BB Ag Ag Ag Ag . . Ab Ab AgAg（应变量）与（应变量）与* *Ag Ag . . AbAb（自变量）间存在着逆（自变量）间存在着逆 函数关系，可予以定量。函数关系，可予以定量。 K1 K 2 定量关系演释定量关系演释 Ag Ag *Ag*Ag AbAb Bound Free B F B/F Bound Free B F B/F 0.670.33 10.500.50 2 0.50.330.67 0.20.170.83 竞争放射分析原理示意图 3 3）基本试剂）基本试剂 标准抗原标准抗原 用于测定反应剂量曲线或制备标记抗原，纯用于测定反应剂量曲线或制备标记抗原，纯 度应度应90%90%。 标记抗原标记抗原 多肽类抗原常用碘标多肽类抗原常用碘标 原理原理 用氧化剂如氯胺用氧化剂如氯胺T T使使 I I*- *- 氧化成 氧化成 I I * * ，然后去取，然后去取 代肽分子中酪氨酸残基苯环上的氢原子。代肽分子中酪氨酸残基苯环上的氢原子。 抗体抗体 免疫制备途径：免疫制备途径： 1 1）人工抗原的制备）人工抗原的制备 oo 具有重要生物意义的小分子半抗原具有重要生物意义的小分子半抗原 l l 植物激素植物激素 l l 生物活性物质生物活性物质 l l 药物药物( (农药农药) ) 半抗原半抗原+ +蛋白质载体蛋白质载体(HSA(HSA，BSA) BSA) 蛋白蛋白 半抗原半抗原 oo 偶联剂偶联剂 l l 激活羧基激活羧基( (半抗原上半抗原上) )使之与氨基使之与氨基( (蛋白上蛋白上) )缩合缩合 生成生成 (CO(CO NH)NH) 。 l l 在氨基间搭桥。在氨基间搭桥。 l l 能在酪氨酰，组氨酰或赖氨酰残基间搭桥的双能在酪氨酰，组氨酰或赖氨酰残基间搭桥的双 功能重氮盐。功能重氮盐。 碳二亚胺法碳二亚胺法 混合酸酐法混合酸酐法 戊二醛法戊二醛法 琥珀酸酐法琥珀酸酐法 重氮化的对氨基苯甲酸法重氮化的对氨基苯甲酸法 2 2）抗血清的免疫制备）抗血清的免疫制备 oo 用抗原接种免疫动物，其成熟的用抗原接种免疫动物，其成熟的B B细胞克隆受到细胞克隆受到 抗原刺激后，产生分泌并分泌特异抗体到血清抗原刺激后，产生分泌并分泌特异抗体到血清 和体液中。实际上血清中的抗体是多种单克隆和体液中。实际上血清中的抗体是多种单克隆 抗体的混合物，因此称之为多克隆抗体。抗体的混合物，因此称之为多克隆抗体。 鉴定：鉴定： a. a. 滴度滴度血清中抗体的浓度。定义为血清中抗体的浓度。定义为B/T%B/T%50%50%时抗血清的时抗血清的 稀释倍数。稀释倍数。 b. b. 特异性特异性抗原抗原抗体反应的专一程度。特异性高，则抗抗体反应的专一程度。特异性高，则抗 干扰能力强。用抗原类似物交叉反应率描述。在干扰能力强。用抗原类似物交叉反应率描述。在AbAb和和 Ag*Ag*一定下，分别测定抗源及其类似物的反应剂量曲线一定下，分别测定抗源及其类似物的反应剂量曲线 B/BB/B 0 0 %-f(Ag),%-f(Ag),求出求出B B50 50后按下式计算 后按下式计算 交叉反应交叉反应(%)(%) C. C. 亲合力亲合力抗原抗原抗体结合强度。由平衡常数衡量决定，亲抗体结合强度。由平衡常数衡量决定，亲 和力强，检测灵敏度高。和力强，检测灵敏度高。 3）单克隆抗体Monoclonal antibody,McAb: 由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇 的同源抗体。 制备过程 1.致敏淋巴细胞的准备； 2.骨髓瘤细胞的准备； 3.细胞融合； 4.选择性培养； 5.抗体分泌细胞的筛选； 6.克隆化过程； 7.单克隆抗体的制备取 抗原 致敏淋 巴细胞 骨髓瘤 细胞 融合 选择性 培养 抗体分泌 细胞筛选 克隆化 单抗制取 单抗纯化 单抗鉴定 致敏淋 巴细胞 骨髓瘤 细胞 离心 1000rpm 10min 50%PEG 1ml 培养液 10ml 离心 1000rpm 7min 37。C摇动、 由慢渐快1min 、静止1.5min 加入HAT培养 液悬浮细胞， 置于培养孔内 HAT选择培养原理 核苷酸从头合成途径 （de novo synthesis） 核苷酸补救合成途径 （salvage synthesis） HAT 核苷酸 DNA 氨基碟呤 （A） 次黄嘌呤 （H） 胸腺嘧 啶核苷 （T） 次黄嘌呤核次黄嘌呤核 次黄嘌呤（次黄嘌呤（H H） 单磷酸单磷酸 A A 嘌呤类核苷酸嘌呤类核苷酸 糖氨基酸糖氨基酸 核苷酸核苷酸 DAN DAN 核苷酸核苷酸 嘧啶类核苷酸嘧啶类核苷酸 胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷 胸腺嘧胸腺嘧 单磷酸单磷酸 啶核苷（啶核苷（T T） A A：氨基碟呤，叶酸拮抗物；：氨基碟呤，叶酸拮抗物；TKTK：胸腺嘧啶核苷激酶；：胸腺嘧啶核苷激酶； HGPRTHGPRT次黄嘌呤次黄嘌呤- -鸟嘌呤磷酸核苷转换酶鸟嘌呤磷酸核苷转换酶 HGPRT TK 内源合成 外源合成 细胞组合 HGPRT 生长状态 淋巴细胞 + 骨髓瘤 + 长期生长 淋巴细胞 + 淋巴细胞 + 短期生长 骨髓瘤 + 骨髓瘤 不能生长 未融合淋巴细胞 + 短期生长 未融合骨髓瘤 不能生长 选择培养的细胞类型 骨髓瘤细胞（HGPRT-，或TK-),淋巴细胞（ HGPRT+，或TK+） HGPRT；次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转换酶；TK:胸腺嘧啶 核苷激酶 有限稀释克隆法 计数103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔 单克隆抗体的制取与鉴定 制取： 体外培养罐法 体内腹腔接种 纯化： 盐析、层析、制备型HPLC 鉴定： 特征鉴定Ig类型、亲和力、效价、特异性 决定簇鉴定是否针对同一决定簇 分离试剂分离试剂 oo使游离抗原与抗原使游离抗原与抗原- -抗体复合物相互分离的抗体复合物相互分离的 试剂。试剂。 oo 超微量的抗体超微量的抗体- -抗原复合一般不沉淀，需加入沉抗原复合一般不沉淀，需加入沉 淀剂使其与游离抗原分离，才能分别测定。淀剂使其与游离抗原分离，才能分别测定。 l l 双抗法双抗法 一抗与抗原一抗与抗原( (标记标记+ +待测待测) )温育，平衡后，加大量二抗使一抗温育，平衡后，加大量二抗使一抗- - - -抗原复合物沉淀，离心分离进行测定。抗原复合物沉淀，离心分离进行测定。 l l 吸附法吸附法 萄聚糖炭末法，炭粒外包以萄聚糖构成萄聚糖炭末法，炭粒外包以萄聚糖构成 沉淀剂，小分子可通过萄聚糖的筛孔被活性沉淀剂，小分子可通过萄聚糖的筛孔被活性 碳吸附，而抗原一抗体被拒留在反应液中，碳吸附，而抗原一抗体被拒留在反应液中， 通过离心可使二者分离。通过离心可使二者分离。 l l 固相法固相法 抗体被包被或交联在固体表面，形成固相抗抗体被包被或交联在固体表面，形成固相抗 体，抗原与固相抗体温育平衡后，倾去反应液，体，抗原与固相抗体温育平衡后，倾去反应液， 洗涤固相表面，即可达到分离目的。洗涤固相表面，即可达到分离目的。 4 4）应用举例应用举例 牛奶中孕酮含量的牛奶中孕酮含量的RIARIA测定测定 用于妊娠和卵巢机用于妊娠和卵巢机 能疾病诊断。能疾病诊断。 oo 试剂和仪器试剂和仪器 1)1)测定药盒测定药盒 3 3 H H标孕酮标孕酮15000dpm/0.05ml15000dpm/0.05ml，抗体，抗体 (1100)(1100)。 2)2)水溶性闪烁液，液闪。水溶性闪烁液，液闪。 3)3)萄聚糖炭末萄聚糖炭末(DCC)(DCC)及磷酸盐缓冲液及磷酸盐缓冲液(PBS)(PBS)。 4)4)供试奶样。供试奶样。 oo 操作步骤操作步骤 l l 测试奶样测试奶样 取取0.1ml0.1ml全奶用全奶用PBSPBS稀释至稀释至1ml1ml，再取，再取 0.1ml0.1ml供试。供试。 l l 对照奶样对照奶样( (孕酮极低孕酮极低) )，准备同上。，准备同上。 l l 反应剂量标准 反应剂量标准 8ng8ng标准孕酮加入标准孕酮加入0.5mlPBS0.5mlPBS，取，取 0.05ml0.05ml即得即得800pg800pg，连续稀释至，连续稀释至400400，200200，5050 ， 25pg25pg。 l l 抗体抗体0.1ml0.1ml，用，用6ml PBS6ml PBS稀释稀释(16000)(16000)。 l l 分析过程见表分析过程见表 奶样中孕酮的奶样中孕酮的RIARIA 依次加入依次加入 （mlml） 管号管号 管名管名 1 12 2 T T 3 34 4 NSBNSB 5 56 6 B B0 0 7 71818 标准标准 1919 样品样品 若干若干 质控质控 对照奶对照奶 样品奶样品奶 标准孕酮标准孕酮 PBSPBS 抗体抗体 0.60.6 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.050.05 0.050.05 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.050.05 0.050.05 0.10.1 奶样中孕酮的奶样中孕酮的RIARIA 充分混匀后，充分混匀后，4 4 0 0 C C温育温育20min20min T T NSB B NSB B0 0 标准 标准 样品样品 质控质控 3 3 H-H-孕酮孕酮 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 充分混匀后，充分混匀后，4 4 0 0 C C温育过夜；温育过夜； 在在18 18 0 0 C C水浴中温育水浴中温育10min10min DCC _ 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4DCC _ 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 样中孕酮的样中孕酮的RIARIA 振荡振荡1min1min； 迅速放入营迅速放入营4 4 0 0 C C冰水浴静止冰水浴静止10min10min； 离心离心 10min(3000r/min)10min(3000r/min)； 倒出上清液至盛倒出上清液至盛5ml5ml闪烁液瓶中，经闪烁液瓶中，经24h24h后测后测 定。定。 奶样中孕酮的奶样中孕酮的RIARIA 注：注： NSBNSB非特异结合率，测定结果用作本底。非特异结合率，测定结果用作本底。B B0 0 零管结合率，为不加待测孕酮时相应的标记孕零管结合率，为不加待测孕酮时相应的标记孕 酮的最大结合率。酮的最大结合率。 2.2.免疫放射分析（免疫放射分析（Immunoradiometric Immunoradiometric assay,IRMA) assay,IRMA) 基于过量标记抗体基于过量标记抗体Ab* Ab* 对待测抗原的对待测抗原的 非竞争性免疫结合全量放射测量的微量分非竞争性免疫结合全量放射测量的微量分 析方法。析方法。 Ag+*Ab=Ag.*Ab+*AbAg+*Ab=Ag.*Ab+*Ab 结合率（%） Ag剂量 RIA IRMAIRMA和和RIARIA曲线形态比较曲线形态比较 IRMA IRMAIRMA和和RIARIA的比较的比较 IRMAIRMA的主要优点的主要优点 稳定性好、灵敏度佳稳定性好、灵敏度佳 1.1.标记抗体稳定性比标记抗原好标记抗体稳定性比标记抗原好 2.2.可以检测到可以检测到1010-15 -15/g /g 3. 3.温育的影响小温育的影响小 IRMAIRMA应用主要限制应用主要限制 1.1.不适宜测定小分子物质不适宜测定小分子物质 2.2.需要大量的抗体，直到单克隆抗体的产生才得需要大量的抗体，直到单克隆抗体的产生才得 以普及推广。以普及推广。 3 3放射受体放射受体- -配体分析基础配体分析基础 受体是指在生物系统中，在细胞表面存受体是指在生物系统中，在细胞表面存 在的介导信号传递的，与其内源性配基，如在的介导信号传递的，与其内源性配基，如 神经递质、激素、免疫因子、生长因子等结神经递质、激素、免疫因子、生长因子等结 合并启动后续反应的特定物质。合并启动后续反应的特定物质。 放射受体配体分析，可以通过对受体进放射受体配体分析，可以通过对受体进 行定位显像或定量测定，以研究其生理与药行定位显像或定量测定，以研究其生理与药 理学效应。如神经递质、激素的作用机制，理学效应。如神经递质、激素的作用机制， 细胞水平的调控机制、疾病药理的机制等。细胞水平的调控机制、疾病药理的机制等。 1. 1.质量作用定律质量作用定律 式中，式中，R,LR,L为游离受体和配基的浓度，为游离受体和配基的浓度，RLRL为复合为复合 物浓度物浓度。 2.2.饱和曲线饱和曲线 对与一定数量（对与一定数量（RT)RT)固定）和一定亲合力（固定）和一定亲合力（K K d d 固固 定）的受体，随配基浓度上升，培基结合物定）的受体，随配基浓度上升，培基结合物RLRL先快后先快后 慢上升，最后达到饱和，所有受体都被结合。慢上升，最后达到饱和，所有受体都被结合。 3.Scatchard3.Scatchard作图作图 重排重排: : 得著名的得著名的ScatchardScatchard函数函数 当当RTRT和和K K d d 固定，固定，RL/L-RLRL/L-RL是线性关系，其斜率为是线性关系，其斜率为 1/K1/K d d , ,即亲合常数的倒数，横截距为即亲合常数的倒数，横截距为RT,RT,即受体数量即受体数量。 4.Hill4.Hill函数及系数函数及系数 若受体有多于若受体有多于1 1个以上的配基结合位点，则个以上的配基结合位点，则 上式直线的斜率称为上式直线的斜率称为HillHill系数。若受体：配基系数。若受体：配基=1=1： 1 1，则，则n=1;n=1;若受体：配基若受体：配基=1:2,=1:2,则则n=2n=2。 4.4.非放射性碘标记非放射性碘标记-电感耦合等离子体质谱免电感耦合等离子体质谱免 疫分析体系疫分析体系 以非放射性以非放射性127 127I I为标记原子，采用溴代琥珀酰胺 为标记原子，采用溴代琥珀酰胺 (NBS)(NBS)法，对含有络氨酸残基的抗原或抗体进行标记，法，对含有络氨酸残基的抗原或抗体进行标记， 制得制得127 127I I标记抗体或抗原。免疫反应测定时，将结合的 标记抗体或抗原。免疫反应测定时，将结合的 标记物与游离的标记物分离后，用用稀氨水溶液将碘标记物与游离的标记物分离后，用用稀氨水溶液将碘 洗脱并经洗脱并经ICP-MSICP-MS检。检。 该体系标记反应步骤简便，标记率高、标记物稳定该体系标记反应步骤简便，标记率高、标记物稳定 、活性好，无放射性危害。同时，用、活性好，无放射性危害。同时，用ICP-MSICP-MS检测，尽检测，尽 管卤素的电离电位较高，但碘的第一电离能为管卤素的电离电位较高，但碘的第一电离能为101045 45 eVeV，在氩等离子体中只能达到大约，在氩等离子体中只能达到大约2525的电离，和其的电离，和其 他分析方法相比，还是具有比较高的灵敏度。他分析方法相比，还是具有比较高的灵敏度。 oo 参考文献：李景喜等参考文献：李景喜等. . 非放射性碘标记一电感耦合等非放射性碘标记一电感耦合等 离子体质谱用于免疫分析研究离子体质谱用于免疫分析研究. . 植物生态学报植物生态学报,2010, ,2010, 34 (2): 17017834 (2): 170178 5.5.非放射性标记免疫分析技术非放射性标记免疫分析技术 1)1)酶联免疫分析（酶联免疫分析（enzyme immunoassay,EIA)enzyme immunoassay,EIA) 用酶作为标记物标记抗原（抗体），以酶促底物反应产物用酶作为标记物标记抗原（抗体），以酶促底物反应产物 的颜色作为检测信号的免疫分析方法。的颜色作为检测信号的免疫分析方法。 酶及底物：酶及底物：辣根过氧化酶辣根过氧化酶邻苯二胺邻苯二胺 碱性磷酸酶碱性磷酸酶P-P-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐 测定模式测定模式: : 竞争性竞争性 非竞争性非竞争性 免疫分析类型（用途，分离及分析技术）免疫分析类型（用途，分离及分析技术） 免疫测定免疫测定 均相均相 （Ab-AgAb-Ag E E 酶活性改变，与酶活性改变，与AgAg E E 相区分）相区分） ( (不分离不分离F F与与B)B) 液相（液相（EIA)EIA) 非均相非均相 标记抗原标记抗原 类型类型 （分离分离F F与与B) B) 固相（固相（ELISA)ELISA) 标记抗体标记抗体 光镜水平光镜水平 免疫组化免疫组化 电镜水平电镜水平 酶标测定简便，使用范围较广，但因酶反应对环境条件敏感，酶标测定简便，使用范围较广，但因酶反应对环境条件敏感， 定量性较差。定量性较差。 非均相液相法非均相液相法 非均相固相法（固定抗原）非均相固相法（固定抗原） 均相酶标抗原均相酶标抗原 2)2)化学发光免疫分析（化学发光免疫分析（chemical luminescent chemical luminescent immunoassay,CLIA immunoassay,CLIA） 用某些发光物质标记抗原（抗体），当其被氧用某些发光物质标记抗原（抗体），当其被氧 化时，可被化学反应激发而发光，以其发光作为检化时，可被化学反应激发而发光，以其发光作为检 测信号的免疫测定法。测信号的免疫测定法。 oo 直接化学发光物质标记法直接化学发光物质标记法 标记物为吖啶脂，该类化合物结构上都有吖啶标记物为吖啶脂，该类化合物结构上都有吖啶 环，在过氧化氢阴离子（环，在过氧化氢阴离子（HOHO - -2 2 ) )作用下，形成电子激作用下，形成电子激 发态中间体发态中间体N-N-甲基吖啶酮，其退激是放出甲基吖啶酮，其退激是放出 =395nm,430nm=395nm,430nm的光子。的光子。 oo 酶标化学发光分析酶标化学发光分析 以过氧化酶作为标记，发光物质作为酶的底以过氧化酶作为标记，发光物质作为酶的底 物的免疫分析。物的免疫分析。 a.a.氨基邻苯二甲酰肼类氨基邻苯二甲酰肼类 如鲁米诺，异鲁米如鲁米诺，异鲁米 诺，在酶和启动发光剂（诺，在酶和启动发光剂（NaOH+HNaOH+H 2 2O O2 2 ) )作用下发光作用下发光 。 b.b.环环1 1，2-2-二氧乙烷衍生物二氧乙烷衍生物 为磷酸脂酶设为磷酸脂酶设 计的底物，含金刚烷基，在碱性磷酸酶作用下计的底物，含金刚烷基，在碱性磷酸酶作用下 脱去磷酸根形成中间体，中间体自发性断裂的脱去磷酸根形成中间体，中间体自发性断裂的 同时发出光子。同时发出光子。 oo电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析 标记物为三联吡啶钌标记物为三联吡啶钌(Ru(bpy)(Ru(bpy) 3 3 2 2 + + ),), 当用磁性微珠链接并吸附到电极表面诱使当用磁性微珠链接并吸附到电极表面诱使 电化学发光而作为检测信号的免疫分析法电化学发光而作为检测信号的免疫分析法 。主要特点，在氧化剂。主要特点，在氧化剂TPATPA不断的到补充时不断的到补充时 ，发光可周而复始进行。，发光可周而复始进行。 ECLIA体系结构图 3)3)时间分辨荧光免疫分析（时间分辨荧光免疫分析（time resolved time resolved fluorescence,TRF) fluorescence,TRF) 以鳖合三价镧系元素铕（以鳖合三价镧系元素铕（Eu)Eu)、铽（、铽（Tb)Tb)、 镝（镝（Dy)Dy)、钐（、钐（Sm)Sm)为标记物标记抗原（抗体）为标记物标记抗原（抗体） ，利用其荧光延迟发射的特性，以与短寿命背，利用其荧光延迟发射的特性，以与短寿命背 景荧光时间相区分的性质进行检测的免疫分析景荧光时间相区分的性质进行检测的免疫分析 方法。方法。 分析光谱学性质分析光谱学性质 1) 1) 激发光谱带较宽（激发光谱带较宽（300-500nm),300-500nm),有利于增有利于增 强激发，提高信号强度；强激发，提高信号强度； 2 2）发射谱带较窄）发射谱带较窄( ( 10nm),10nm),有利于排除干扰；有利于排除干扰； 3)Stoke3)Stoke位移较大（位移较大（250-300nm),250-300nm),有利有利 于与激发光相区分；于与激发光相区分； 4 4）荧光寿命较长（）荧光寿命较长（60-90060-900 S),EuS),Eu3+ 3+为 为 714 714 S,S,而一般生色团而一般生色团1-100 1-100 S S，蛋白质，蛋白质1 1 -10 -10 S S，所以延迟测量可消除背静干扰；，所以延迟测量可消除背静干扰； 5 5）标记稳定，可保存）标记稳定，可保存1-21-2年。年。 波长 300 400 500 600 700 Stakes 吸光度 Stakes 位移示意图 激发光 荧光 光强度 激发 短寿命荧光 长寿命荧光 延迟时间测量时间 铕螯合物的激发、 发射光谱 LUMINOLUMINO准自动化学发光免疫分析仪器准自动化学发光免疫分析仪器 中国与国际免疫诊断现状 中国国际（欧美为主） 放射免疫法（ ） 兴起于20世纪70年代，现仍普遍使 用于县级以上医院； 产品处于衰退期； 厂商试剂与仪器共同开发，试剂 基本系列化。 兴起于20世纪60年代，现已基本退 出临床应用； 产品生命周期已终结； 厂商试剂和仪器共同开发，试剂 基本系列化。 酶联免疫法 （ ） 兴起于20世纪80年代，现普遍使用 于各级临床机构，为我国临床免疫 诊断的基本方法； 产品处于成熟期； 厂商试剂与仪器共同开发，试剂 尚未系列化。 兴起于20世纪70年代，现仍在临 床应用； 产品处于衰退期； 厂商试剂与仪器共同开发，试剂 基本系列化。 化学发光免疫 法（ ） 引入于20世纪90年代，现个别较大 医院开展个别项目； 产品处于导入期或成长期； 无厂商开发生产，完全依赖进口 兴起于20世纪80年代，现已被临床 普遍使用，成为临床免疫诊断的支 柱方法； 产品处于成熟期； 厂商试剂与仪器共同开发，仪器 自动化程度高，试剂系列化状态. 4）各种体外分析法的比较 化学发光与酶免的对比表化学发光与酶免的对比表 酶酶 标标化学发光化学发光 测量精度测量精度定性定性/ /半定量测量半定量测量定量测量定量测量 人体伤害人体伤害底物有致癌性底物有致癌性无无 有效期有效期较长较长长长 干扰因素干扰因素较多较多极少极少 测试项目测试项目少少多多 化学发光与放免的对比表化学发光与放免的对比表 放放 免免化学发光化学发光 测量精度测量精度较高较高高高 人体伤害人体伤害放射性放射性无无 有效期有效期较长较长长长 干扰因素干扰因素较多较多极少极少 测试项目测试项目较多较多多多 化学发光与时间分化学发光与时间分辨辨荧光的对比：荧光的对比： 化学发光化学发光 时时 间间 分分 辨辨 荧荧 光光 试剂试剂试剂试剂 基本情况基本情况 国内已有很多厂家生国内已有很多厂家生产产化学化学发发光光试剂试剂 ，种，种 类齐类齐 全，并大多数全，并大多数项项目都取得了国家目都取得了国家药监药监 局局 批准，批准，试剂试剂 价格随着化学价格随着化学发发光系光系统统在国内不在国内不 断普及，两三年内断普及，两三年内试剂试剂 的价格的价格还还会下浮会下浮3030 50%50%。 只是由只是由仪仪器生器生产产厂家直接生厂家直接生产产供供应应，系列，系列试剂试剂 国家国家药监药监 局批准与否不局批准与否不详详，试剂试剂 价格价格较较化学化学发发 光高，国内外光高，国内外试剂试剂 生生产产厂家没有此种厂家没有此种试剂试剂 和生和生 产计产计 划。划。 标记标记标记标记 物物酶酶- -发发光底物两光底物两级级放大放大稀土离子，如稀土离子，如铕铕 仪仪仪仪器和器和检测检测检测检测 技技术术术术 在欧美国家在欧美国家 的使用的使用 在欧美在欧美发发达国家化学达国家化学发发光免疫光免疫检测检测 超超过过整整 个免疫个免疫检测检测 市市场场的的7070，替代了放免或，替代了放免或酶酶 免。免。 几乎没有使用几乎没有使用 发发发发展展趋势趋势趋势趋势 是目前是目前临临床上国床上国际际通用最先通用最先进进的免疫分析的免疫分析 技技术术替代放免淘汰替代放免淘汰酶酶免免 从国外来看不会成从国外来看不会成为为下一个免疫分析方法下一个免疫分析方法 国内外生国内外生产产产产厂家厂家 瑞士瑞士罗罗氏、美国德普、美国氏、美国德普、美国强强生、德国生、德国贝贝 克曼、英国克曼、英国迈迈力德、美国雅培、德国索林等力德、美国雅培、德国索林等 跨国公司均生跨国公司均生产产化学化学发发光免疫分析光免疫分析仪仪 左左边边所述公司没有生所述公司没有生产产，国外公司未，国外公司未见见生生产产， 目前国内两家公司生目前国内两家公司生产产 稳稳稳稳定性定性稳稳定性好定性好影响被影响被标记标记 物生物活性与免疫活性物生物活性与免疫活性 灵敏度灵敏度灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高 反反应应应应体系体系接近中性接近中性酸性，易引起蛋白酸性，易引起蛋白质变质变 性性 包被技包被技术术术术 不透明微量孔壁吸附不透明微量孔壁吸附, ,提高分析灵敏度提高分析灵敏度, ,降低降低 本底本底 采用透明微量孔壁吸附，孔壁的透明度会引起本采用透明微量孔壁吸附，孔壁的透明度会引起本 底干底干扰扰 技技术术术术性性新技新技术术，很成熟，很成熟新技新技术术，不成熟，不成熟 干干扰扰扰扰因素因素干干扰扰极小极小容易受内外源稀土离子的干容易受内外源稀土离子的干扰扰 试剂试剂试剂试剂 种种类类类类项项目目齐齐全全( (见试剂报见试剂报 价价单单) )缺少部分缺少部分项项目。目。 5.35.3中子活化分析中子活化分析(neutron activation (neutron activation analysisanalysis , ,NAA)NAA) 1.1.分析原理分析原理 原理原理 利用中子核反应将待测核素转变成放射利用中子核反应将待测核素转变成放射 性核素，而进行放射性分析的一种核素分析方性核素，而进行放射性分析的一种核素分析方 法。按中子能量不同，可分为热中子或快中子法。按中子能量不同，可分为热中子或快中子 活化两类。热中子一般利用（活化两类。热中子一般利用（n,rn,r）反应激活样）反应激活样 品，其热中子俘获截面大品，其热中子俘获截面大. .快中子利用（快中子利用（n,pn,p） ,(n,(n, ) )反应激活样品。反应激活样品。 稳定核素稳定核素 放射性核素放射性核素 稳定核素稳定核素 即稳定核素经中子俘获核反应，被活化即稳定核素经中子俘获核反应，被活化 转变成放射性核素。转变成放射性核素。 如如, , 基于中子活化技术的煤炭全元素在线分析系基于中子活化技术的煤炭全元素在线分析系 统的研究统的研究 基于中子活化技术的煤炭全元素在线分析系基于中子活化技术的煤炭全元素在线分析系 统统 步骤步骤 活化分四个步骤，除样品制备外，其余分三个为活化分四个步骤，除样品制备外，其余分三个为 ： oo 辐照辐照 选择对待测反应截面大，且干扰反应小的选择对待测反应截面大，且干扰反应小的 一定能量和通量的中子照射样品，使待测核素一定能量和通量的中子照射样品，使待测核素 部分转变成为放射核素。部分转变成为放射核素。 oo 冷却冷却 在停止照射到测量过程，让样品等待的在停止照射到测量过程，让样品等待的 一段时间一段时间t t 2 2 , ,目的是让一些短寿命干扰核素衰变目的是让一些短寿命干扰核素衰变 掉，或对被照射样品做必要的放化分离。掉，或对被照射样品做必要的放化分离。 oo 测量和数据分析测量和数据分析 通过对活化核素放出射线能通过对活化核素放出射线能 量和强度的测量，对待测样品进行定性和定量量和强度的测量，对待测样品进行定性和定量 分析。分析。 待测核素活化后的射线强度在简单情况下待测核素活化后的射线强度在简单情况下 为为 其中，其中，W W待测核素的重量；待测核素的重量；NaNa阿伏加德勒常阿伏加德勒常 数；数； 中子对该核素的活化截面，是能量中子对该核素的活化截面，是能量 的函数；的函数； 探测装置对某种射线的探效率；探测装置对某种射线的探效率； 活化核的衰变常数活化核的衰变常数,t,t 1 1 -照射时间，照射时间，t t 2 2 - -冷冷 却时间。却时间。 计量计量 由上式可知，由上式可知，在相关参数确定后，根据射在相关参数确定后，根据射 线的能量，可定性核素，根据射线强度的测量线的能量，可定性核素，根据射线强度的测量 可由上式求得含量，这种方法称为绝对测量，可由上式求得含量，这种方法称为绝对测量， 为了避免相关参量测量的繁杂和不确定性，常为了避免相关参量测量的繁杂和不确定性，常 采取相对测量。采取相对测量。 相对测量相对测量 待测样品和该元素含量已知的标准在待测样品和该元素含量已知的标准在 相同条件下活化和测量，此时：相同条件下活化和测量，此时： 式中，式中，x-x-待测样品，待测样品，s-s-标准。标准。 特点特点 非破坏性、多元素（周期表几乎所有非破坏性、多元素（周期表几乎所有 元素）同时分析元素）同时分析, ,灵敏度高（灵敏度高（1010-6 -6-10 -10-10 -10） ）, , 准确度高（准确度高（1%1%）。）。 2.2.活化分析的干扰反应活化分析的干扰反应 此处的干扰是指活化过程本身可能产生的此处的干扰是指活化过程本身可能产生的 干扰反应。干扰反应。 1)1)样品中不同元素可能通过不同核反应产生样品中不同元素可能通过不同核反应产生 同一种被鉴定的核素，如同一种被鉴定的核素，如 这类干扰无法在探测中排除，但通过这类干扰无法在探测中排除，但通过 选择中子能量或活化前作必要分离，可尽选择中子能量或活化前作必要分离，可尽 量减少干扰。在热中子活化时，因量减少干扰。在热中子活化时，因,(n,p),(n,p) 反应截面远小于（反应截面远小于（n,rn,r）的）的, ,问题并不严重问题并不严重 ，但在快中子活化时，应考虑是否存在干，但在快中子活化时，应考虑是否存在干 扰。扰。 2 2）其它核素被活化产生能量相近的射）其它核素被活化产生能量相近的射 线，这种干扰可利用核素的半衰期不同，线，这种干扰可利用核素的半衰期不同， 选择适合冷却时间，或采用高分辨率探测选择适合冷却时间，或采用高分辨率探测 器将它们区分开来。器将它们区分开来。 3.3.分析设备和辐照条件选择分析设备和辐照条