外源基因在真核细胞中表达及调控.ppt

第七章 外源基因在真核 细胞中表达及调控 第一节 真核细胞基因表达的调控 第二节 哺乳动物细胞表达系统的选择 标记基因 第三节 真核细胞表达系统的载体种类 第一节 真核细胞基因表 达的调控 一、真核生物基因表达的特点及优势 二、真核细胞表达及调控元件 第二节 哺乳动物细胞表 达系统的选择标记基因 一、胸苷激酶基因选择标记（定义） 二、二氢叶酸还原酶基因选择标记 三、新霉素抗性基因选择标记 四、氯霉素已酰转移酶基因选择标记 五、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT） 基因 第三节 真核细胞表达系 统的载体种类 一、载体的类型 二、几种常用的真核表达载体 一、 真核生物基因表达的 特点及优势 1.细胞的全能性 2.转录和翻译分开进行 3.有相当大的非编码区（调控序列） 4.有三种不同RNA聚合酶参与转录 5.初级转录产物能进行剪接加工修饰 6.不存在操纵子结构 7.基因多拷贝，功能基因分散在不同区域， 分别转录 二、真核细胞表达及调控元 件 （一）真核生物基因转录水平的调控 （二）转录后水平的调控 （三）翻译水平的调控 胸苷激酶 胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（ thymidine Kinase,TK）在所有真核细胞 中都有表达, 是嘧啶生物合成补救代谢 途径中的一个关键酶, 它可催化胸苷磷 酸化转变成为dTMP, 继续磷酸化生成 dTTP, 参与DNA的生物合成。 一、载体的类型 1.质粒型载体 2.病毒载体 3.整合型表达载体 4.游离型表达载体 5.瞬时表达载体 6.稳定性表达载体 7.非复制性HSV-病毒（单纯疱疹病毒HSV- 型）载体 8.裂解性HSV-病毒载体 二、几种常用的真核表达载 体 逆转录病毒载体 1.卸甲载体 2.穿梭载体 痘类病毒载体 HSV-单纯疱疹病毒载体 1.重组病毒型载体 2.重组质粒型载体 3.裂解型病毒载体 （一）真核生物基因转录水 平的调控 基因调控的顺式作用元件 启动子 增强子 RNA剪接信号 负调控元件 终止子和polyA信号 基因调控的反式作用因子 概念 反式作用因子主要作用规律 （二）转录后水平的调控 mRNA前体加工：转录的mRNA前体经 5加帽，3酶切加尾去除内含子后，产 生成熟mRNA，通过核孔进入胞质中。 RNA编辑（RNA editing） （三）翻译水平的调控 翻译起始序列 eIF-2的磷酸化反应 由模板来源的遗传信息，进而可编码产 生不同氨基酸序列的多种蛋白质，这是 生物适应性的保护措施。 顺式作用元件 顺式作用元件为一些能与DBP结合的特 定序列DNA片段,位于真核基因上游,含 有特有的相似或一致序列,决定转录起 始位点和RNA聚合酶的转录按效应和功 能可分为启动子、增强子、RNA间接信 号、负调控元件、终止子等调控元件。 反式作用因子主要作用规律 同一DNA序列可被不同蛋白质识别 同一蛋白质因子可与多种不同DNA序列发生 联系，多数是通过蛋白质-蛋白质先相互作用 后，再与DNA结合，发挥调节作用。 反式作用因子的自身生物合成有相当大的可 变性、可塑性。反式作用因子与顺式作用元 件相互作用的特定结构域，有两种类型： 通用转录因子的结构域为识别特异DNA的DNA结 合结构域，如：锌指结构。 转录调节因子的结构域又称转录活化结构域，如 ：酸性-螺旋结构域。 不同结构域各自的特征 不同结构域各自的特征 通用转录因子的DNA结合结构域 锌指结构 亮氨酸拉链 螺旋-转角-螺旋（HTH） 螺旋-环-螺旋 转录调节因子的转录活化结构域 RNA编辑（RNA editing） RNA编辑是在转录时或转录后，能够改变 RNA分子编码特性，是与剪切形式不同的一 种修饰形式，如可使mRNA某位点密码子 CAA转变为UAA，使C变U，编辑的结果形 成了UAA终止密码子，在编码酶的作用下， 除使C变U，还可在RNA上添加多个U或呈单 个C的添加，使前体mRNA变成成熟mRNA时 ，通过插入或替换方式，可改变和扩大原遗 传信息，编码多种蛋白,是生物的适应性保护 。 翻译起始序列 在ATG起始密码子周围要有5- CCACCA-TGG-3保守序列，以利 mRNA翻译起始，若发生突变，其翻译 水平可下降10倍。在起始AUG上游若有 比较多的二级结构序列，也会影响翻译 ，建议外源基因的5端AUG上游序列不 宜过长。 eIF-2的磷酸化反应 eIF-2为转译起始因子-2是蛋白质合成起始阶 段13种起始因子中最为关注的因子。若转入 动物细胞中的质粒DNA的两条链一旦都发生 转录，就会形成双链互补mRNA，而激活胞 内的双链RNA激活的蛋白激酶（DAI PK）该 激酶可使eIF-2的-亚基磷酸化，转译受抑， 为防止该激酶活化，常在载体上加上腺病毒 的VARNA基因，VARNA是由RNA聚合酶 合成的小分子RNA，能阻止双链RNA对DAI 激酶的激活作用，使转译得以正常进行。 一、胸苷激酶基因选择标记 外源基因+载体(TK+)的重组体导入TK-细胞中 ，在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶 核苷）选择培养基中筛选，TK-细胞因氨基喋 呤抑制了dTTP的合成而死亡，TK+细胞可存 活，以此进行筛选。（HSV-1的TK基因转染 细胞加GCV后被杀死，如小鼠LMTK-细胞。 ） 注：TK+BrUdR因掺入后对紫外线敏感而死亡， TK-+BrUdR因不掺入，对紫外线不敏感而存活 。 二、二氢叶酸还原酶基因（ DHFR）选择标记 DHFR是合成dATP和dGTP的关键酶。 常用DHFR的CHO细胞因不能合成四 氢叶酸，只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨 酸和嘌呤的培养基中生长。在不含该培 养基中导入该标记基因重组子，则可筛 选出阳性克隆，也可将DHFR基因置在 强启动子下高表达或通过DHFR基因突 变以提高抵抗高浓度氨甲喋呤（抗 MTX的抗性）的能力，从而筛选阳性 克隆。 三、新霉素抗性基因选择标 记 新霉素类似物G418抗生素，可影响80s 核糖体RNA功能，对细胞有毒性。新霉 素抗性基因neo的载体可在真核细胞中 表达产生新霉素磷酸转移酶能使G418 失活，可在含G418培养基中筛选重组 体转化的阳性克隆细胞。阳性克隆存活 ，阴性者死亡。 五、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（ XGPRT）基因 哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成 黄嘌呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶（HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸 （IMP）。哺乳动物细胞可通过IMP生成GMP。当 用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了GMP的合成， 使细胞失去合成DNA能力而死亡。 将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，在转 化细胞中就能表达XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的 培养基中通过XMP中间体补救合成GMP，使DNA 合成正常进行，加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉 酚酸的抑制而存活，而未转化的阴性细胞则受霉酚 酸的抑制而死亡，以此可用来筛选阳性细胞。 1.质粒型载体 质粒型载体（穿梭载体）：实际上是病 毒质粒型载体，共有两套复制元件和选 择标记，在原核中复制，真核中表达。 2.病毒载体 病毒载体种类多，SV40、Adv、RV、 HSV-1、痘苗V。可在敏感细胞中复制 ，表达外源基因，有的还可通过整合后 表达。 3.整合型表达载体 RV、SV40可携带外源基因整合到宿主 细胞的基因组中进行表达。 4.游离型表达载体 该病毒载体是以完整的或缺陷病毒形式 携带外源基因导入宿主细胞后不发生整 合，可在胞浆中游离复制，表达外源基 因，如痘苗V、Adv。 5.瞬时表达载体 瞬时表达载体（转染后70-90h左右）： 含病毒复制子的病毒载体，可携带外源 基因导入宿主细胞，不整合到染色体上 ，只在细胞内进行暂时性表达，不能随 细胞传代，随后逐渐降低或消失。常用 SV40复制子载体，在COS细胞中表达 ，由于载体复制，若超过104个/细胞， 细胞不能承受而死亡。 6.稳定性表达载体 将外源基因与具标记基因（DHFR）病 毒载体转染动物细胞（CHO），可将基 因整合到细胞染色体上，可随细胞转录 表达和传代。（CHO、DUKX-B11因加 入氨甲喋呤而死亡，依此筛选阳性克隆 。） 7.非复制性HSV-病毒（ 单纯疱疹病毒HSV-型） 载体 HSV-1病毒去除极早期基因，失去复 制能力，但携带外源基因转染细胞后高 效表达，毒性小，转染和表达能力强。 8.裂解性HSV-病毒载体 HSV-1病毒去除了早期基因，而不能 产生DNA合成所需的酶，该病毒在静止 细胞中不能复制和裂解细胞，但在高度 分裂活跃的细胞中（如肿瘤）可复制并 裂解感染的细胞，因分裂活跃细胞可提 供病毒复制所需的DNA合成酶，复制时 只杀死肿瘤细胞，对正常细胞无损害。 逆转录病毒载体 逆转录病毒载体是RNA单链，pol基因 产生逆转录酶，使单链生成双链。有5 、3的U3RU5的长末端重复序列，有 TATA强启动子和加尾功能，经体外包 装，可整合表达。穿梭质粒载体组装基 因后，可由辅助病毒协助或经体外细胞 包装，形成具感染性假病毒颗粒，再感 染宿主细胞进行表达。 痘类病毒载体 已用于构建多价活疫苗载体（HBsAg、 HA、狂犬、HAV、麻疹V、HSV-、 EBV等。该载体的双链DNA的大病毒载 体，组装量大，安全，可在细胞独立复 制，表达。 1.重组病毒型载体 在HSV-1非必需区插入外源基因的重组 体DNA与野毒株共转染细胞，可发生同 源重组，通过LacZ筛选，转染效率高， 无需辅助病毒，但有毒性作用。 启动子 大多位于基因5端上游区，是一种与基 因转录起始有关的5端DNA序列，在- 30bp区有TATA box，可引导RNA聚合 酶转录起始，在-70-80bp区还有GC box，可协同调节转录起始频率和提高 转录效率。 常用的启动子有RSV启动子、CMV启 动子、SV40早期启动子。 增强子 增强子是一类可使启动子的基因转录效率显 著提高的顺式作用元件，本身无启动子活性 ，可独立存在与上游区、下游区或基因内部 ，可进行远距离增强启动作用，而且无方向 性。它有特征性序列，常由812bp组成，以单 拷贝或多拷贝的形式存在。 增强子可使转录效率增强10-100倍，通常来 源于SV40、RSV或CMV病毒。一旦增强子的 作用使表达产物对细胞有毒性时，最好改用 诱导型启动子来表达外源基因，如热休克启 动子、金属硫蛋白启动子。 RNA剪接信号 虽然cDNA来源的基因转入哺乳类细胞 后，其表达不受有或无内含子的影响， 但在该细胞中表达最好有一段内含子序 列的剪接信号，以提供对cDNA基因表 达的需要，常用SV40的小t抗原的内含 子序列来作为cDNA中的内含子剪接序 列。 负调控元件 沉默子和衰减子为转录的负调控元件， 它们与反式作用因子相互作用而起作用 ，不受距离、方向、基因来源的限制。 终止子和polyA信号 真核基因转录的确切终止信号和终止机制目 前尚不清楚，现发现在模板DNA分子3端有 一终止序列，称终止子，产生具有polyA尾的 转录序列，在DNA区域内G/T簇。如SV40中 的终止子序列为AGGTTTTTT的DNA序列， 并有发夹结构的反向重复序列。 polyA可使mRNA稳定其多聚腺苷酸化需要两 种序列：位于polyA位点下游的GU或U丰 富区，位于polyA上游11-30bp处的6bp高度 保守序列（5-AAUAAA）与转录后的RNA切 割和加尾有关。 反式作用因子的概念 反式作用因子是一组能直接或间接地与DNA 的顺式作用元件特定序列结合，发挥调节作 用的核内非组蛋白，即DNA结合蛋白（DBP ），DBP又称转录因子（transcription factor,TF）分通用转录因子及转录调节因子 两大类。基因表达的组织特异性及细胞周期 特异性受上述元件和因子的相互作用所决定 ，通用转录因子中识别TATA box的为TFD ，可与RNA聚合酶结合使转录起始，识别 GC box的DBP为SP1，可调控转录效率。 锌指结构 锌指（zine finger）结构： 由两个半胱氨酸（Cys）和 两个组氨酸（His）残基通 过位于中心的锌离子结合成 一个稳定的指状结构，表面 暴露的碱基及其极性氨基酸 与DNA结合有关。一个蛋 白分子有2-9个锌指重复单 位，由指部碱基或极性氨基 酸（赖氨酸Lys、精氨酸Arg ）结合于DNA双螺旋的深 沟内。结构域为以锌辅基螯 和形成的环状结构作为活性 结构域。 亮氨酸拉链 亮氨酸拉链（Leucine zipper， LZ）：为两组走向平行带亮 氨酸的-螺旋形成的对称二聚 体，每个亚基含4个亮氨酸， 每2个Leu之间相隔6个氨基酸 。于-螺旋的某一侧面，每2 圈（3.6碱基/圈）就出现一个 Leu，排成一排，使2个-螺旋 蛋白分子间形成一条拉链，只 有在形成二聚体拉链后，链上 富含的碱性氨基酸区可与 DNA结合。 结构域为链上碱性区和亮氨酸 拉链形成的稳定结构为基础。 螺旋-转角-螺旋（HTH） 螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）：此 -螺旋中含碱性氨基酸较多，其所带的正电荷 基团可与带负电