引种紫锥菊烷酰胺类免疫调节作用毕业论.doc

毕毕业业论论文文 题题 目：目： 引种紫锥菊烷酰胺类免疫调节作用引种紫锥菊烷酰胺类免疫调节作用 学学 生生 姓姓 名名： 孟孟根根苏苏力力德德 学学 号号： 1010201022 指指 导导 教教 师：师： 吴吴 华华 专专 业业 年年 级：级： 动物科学系动物科学系 2010 级（动物营养与饲料加工方向）级（动物营养与饲料加工方向） 所在学院和系：所在学院和系： 农牧学院动物科学系农牧学院动物科学系 完完 成成 日日 期：期： 2014 年年 6 月月 6 日日 答答 辩辩 日日 期：期： 2014 年年 6 月月 12 日 引种紫锥菊烷酰胺类免疫调节作用 摘 要 目的：研究引种紫锥菊提取物烷酰胺类的免疫调节作用。方法：以小鼠脾淋巴细胞作为试验样 本，设置0.01g/mL、0.1g/mL、1g/mL、10g/mL烷酰胺类浓度梯度，采用MTT法检测脾淋巴细 胞增值的影响，ELISA法测定IFN-含量。结果：引种紫锥菊提取物烷酰胺类在0.01-10g/mL浓度范 围内能够刺激脾淋巴细胞的增殖，其浓度为0.1g/mL时差异为极显著（p0.05）。结论：引种紫锥菊提取物烷酰胺类 具有免疫调节作用。 关键词：引种紫锥菊，免疫调节，T淋巴细胞，IFN-， RESEARCH OF IMMUNOMODULATORY ON THE ALKYLAIDES FROM INTRODUCED ECHINACEA PURPUREA Abstract：Objective Discuss the immune modulation of Introduction plant of Echinacea 。Methods The proliferation of murine spleen lymphocyte and the secretion of IFN 一 were measured by MTT and ELISA assay to evaluate the immunomodulatory action 。Results Introduction plant of Echinacea extract of Alkylamides can enhance Con A stimulation of normal mice spleen lymphocyte proliferation, extremely significant difference compared with the control group (P 0.05)。Conclusion Introduction plant of Echinacea extract of Alkylamides have immunomodulatory effect。 Keywords：Introduction plant of Echinacea，Immune 一 modulation，T- lymphocyte，IFN- 目录 绪论.1 第一章 体外试验.3 1.1 材料方法.3 1.1.1 试验动物 .3 1.2 试验材料与仪器3 1.3 引种紫锥菊烷酰胺类的制备.3 1.4 试验方法.4 1.4.1 引种紫锥菊的栽培 .4 1.4.2 样本的采集 .4 1.4.3 MTT 法测定5 1.4.4 IFN- 的测定5 1.5 结果分析.5 1.5.1 引种紫锥菊烷酰胺类的制备 5 1.5.2MTT 法测定.5 1.5.3 IFN- 的测定.6 1.5.4 统计学处理 .7 第二章 讨论.9 2.1 引种紫锥菊烷酰胺类含量9 2.2 引种紫锥菊烷酰胺类对细胞增殖的影响9 2.2 引种紫锥菊烷酰胺类对 IFN-的影响 9 参考文献.11 致谢.13 绪论 农牧学院动物科学系 1 绪论 免疫系统在人类和动物的机体中起重要作用。免疫系统的功能紊乱会产生多种疾病，威胁人们 健康和生活质量。同样，在动物养殖业中，机体免疫功能障碍会产生很多疾病，并且，动物生产中 长期应用抗生素、化学制剂和激素类饲料添加剂等，造成耐药性、药物残留、致癌、致畸变等问题， 给养殖业和人类健康带来严重危害。因此，研究者们致力于疗效确切、安全稳定免疫调节剂的研究。 目前使用的免疫调节剂主要有：微生物来源的制剂、人或动物免疫系统的产物、中药或天然药物有 效成分、化学合成药物等。随着上世纪70年代人参烷酰胺类、香菇烷酰胺类等的免疫调节作用相继 报道，使人们对从中药或天然植物中开发免疫调节药物产生了浓厚的兴趣。特别是在“回归自然、 绿色消费”成为时尚的今天，天然植物药物理所当然地成为现代医疗保健的良好选择1,2。 目前，紫锥菊作为免疫调节剂在国际上受到普遍重视。在美洲作为免疫促进剂和免疫调节剂用 于感冒和流行感冒的辅助治疗，在德国被推荐用于感冒、呼吸道和泌尿道慢性感染的辅助治疗，以 及用于外伤感染、慢性溃疡的治疗。在提高免疫力方面，特别是在免疫力低下的状态比正常生理状 态，紫锥菊表现出较为显著的免疫效果，如对人类的艾滋病、肿瘤等均有抑制病原和平衡机体免疫 状态的效果。在国内，紫锥菊于上世纪70年代开始引入，尽管引种时间短，但各行业对其的研究进 展均较快3。 国内紫锥菊的免疫调为开发引种的紫锥菊成为我国的一种新的药用植物资源，对紫锥菊提取物 对小鼠单核巨噬细胞系统功能的影响进行了研究，结果显示紫锥菊提取物对正常小鼠的单核巨噬细 胞系统功能都没有显著影响，但可增强小鼠抵抗氢化可的松引起的免疫抑制作用，说明该引种的紫 锥菊有可能成为我国的一种新的药用植物资源，其氯仿提取物有可能被开发成一种免疫恢复剂 。 兽药有很多都是从人药移植过来，通过相应的研究应用于畜牧业，更好的为人类提供健康、绿色的 产品。基于此，很多研究者们对紫锥菊在畜牧业中的免疫调节作用做了较广泛的研究，主要集中于 为人类提供食品的鸡和奶牛方面。紫锥菊在人类、畜牧业得到了广泛研究，但在水产养殖业方面研 究较少。人类和畜牧业中对紫锥菊免疫调节的研究结果为紫锥菊在水产养殖中的应用研究提供参考 4。 对于引种紫锥菊提取物的研究不少，但是对紫锥菊烷酰胺类免疫功能的未见报道。目前，青海 地区尚未进行紫锥菊的栽培，本课题旨在研究引种青海紫锥菊烷酰胺类的免疫调作用。为紫锥菊提 取物在青海省的研发提供有力的条件，开发免疫调节增强剂或保健食品提供重要依据，使紫锥菊这 一闻名于世的免疫调节剂更好的为人类和各种养殖动物的健康服务。 第一章 体外试验 农牧学院动物科学系 3 第一章 体外试验 1.1 材料方法 1.1.1 试验动物 清洁小鼠，体重1822g, 雌雄各半（西北农林科技大学实验动物中心提供）合格证号： 4101150 1.2 试验材料与仪器 引种紫锥菊：北京南无科贸有限责任公司,原产地加拿大 刀豆蛋白A(Con A):北京索莱宝生物有限公司 四甲基偶氮哇盐(MTT):Sigma公司 RPMI-1640培养基:赛默飞世尔生物化学制品公司 甲醇、乙醇:广东光华化学试剂厂产品 小鼠ELISAIFN-检测试剂盒:有限公司产品 细胞培养板、细胞计数板、微量移液器、加样槽、眼科剪、镊子等 Benchmark酶标仪:BIO-RAD公司产品 微量振荡器:江苏姜堰公司产品 Allegra 64R高速冷冻离心机:Beckman公司产品 DU640紫外分光光度计:Beckman公司产品 倒置相差显微镜:重庆光学仪器厂产品 Waters269O高效液相色谱分析仪:Waters公司产品 SANYO培养箱,日本SANYO公司产品 1.3 引种紫锥菊烷酰胺类的制备 根据参考文献8，10，将粗提物浸膏 282g 混悬于水中, 用 10 倍量 95%EtOH 超声提取三次,每次 l h,合并提取液,回收 EtOH,以热水溶解,CH3CL 萃取三次,回收 CH3CL 置 50浓缩干燥即得。经紫外 分光光度法测定其烷酸胺类成分含量。 4 农牧学院动物科学系 4 1.4 试验方法 1.4.1 引种紫锥菊的栽培 1.种子来源 种子购于北京南无科贸责任有限公司（原产地加拿大） 2.种植基地 青海大学农牧学院实习牧场 3.种植过程 2013 年 4 月 12 日至 2013 年 6 月 6 日期间，温室育苗。 2013 年 6 月 7 日，移栽。 4.试验处理 2013 年 6 月 18 进行试验处理。将紫锥菊分为 3 组进行试验处理，每组 8 垄，每垄选 6 株，分 别做对照组、施肥组、覆膜组。 不同处理采的植物样已按地上部分，地下部分分别处理，风干，准备烷酰胺类含量测定。 1.4.2 样本的采集 取正常小鼠10只,雌雄各半,断颈处死小鼠,以75%酒精消毒皮毛后立即分离脾脏, 放入无菌RPMI 一1640培养基中, 迅速转入超净工作台,剔除筋膜组织及结缔组织,逐次用过量双抗PBS,正常双抗PBS,无 双抗PBS,无血清RPMI一1640培养基清洗,用无菌眼科剪将脾组织剪碎,无菌RPMI1640培养基冲洗剪 碎的脾组织,反复操作,收集细胞悬液至离心管中自然沉降,弃去沉淀。取脾细胞悬液1500rpm离心5分 钟。弃上清,用无血清RPMI一1640洗涤3次;收集脾细胞,加入0.83%的NH4CL 5mL,破除脾细胞悬液中 的红细胞3分钟。加入含10%小牛血清的RPMI一1640培养基中止NH4CL破红细胞作用,以1500印m离 心5分钟,收集沉淀,洗涤3次,即得脾淋巴细胞。离心弃上清,加入含10%小牛血清、5g/mL Con A的 1640培养基,调整细胞密度为3*105个细胞/孔,以180L体积接种于96孔培养板,分别加入上述紫锥菊提 取物20L,起始浓度为100g/mL,10倍连续稀释至0.01g /mL,同时设置药物空白对照。加入药物后在 37、完全饱和湿度、体积分数为5%的CO2孵箱中培养72小时。从孵箱中取出培养板,于高速冷冻 离心机2500rpm离心3分钟,取培养的细胞部分用MTT法检测T淋巴细胞增殖情况【5,10】。 脾淋巴细胞的分离与检测流程如图1所示： 第一章 体外试验 农牧学院动物科学系 5 处死小鼠，分离脾脏 过量双抗PBS清洗 正常双抗PBS清洗 无双抗PBS清洗 无血清RPMI-1640清洗 无菌脾脏 用无菌剪刀剪碎，1640清洗 带组织块脾淋巴细胞 自然沉降，弃去沉淀 无组织块脾淋巴细胞 NH4CL破红细胞 脾淋巴细胞 细胞计数 接种、加药、孵育72小时 MIT法检测细胞增殖，ELISA法测定IFN-含量 图1 1.4.3 MTT 法测定 MTT法测定T淋巴细胞增殖方法:取待测细胞,按10L/孔 加入5mg/ml的MTT液,在37、体积分 数为5%的CO2孵箱中培养4小时,轻轻吸取80L上清液,弃去,按100L /孔 加入酸化异丙醇,充分溶解, 用Benchmark酶标仪于57Onm处测定其吸光度。参考文献6,10 。 1.4.4 IFN- 的测定 参照试剂盒说明,用 ELLSA 法检测 Con A 刺激 T 淋巴细胞分泌 INF 一 的水平。收集培养细胞 上清液分别加入到 INF 一 检测酶标板内,按试剂盒说明进行操作,反应终止后测定 450nm 波长下的 吸光度,根据标准反应孔吸光度所得回归方程计算 INF 一 的含量。参考文献6,10。 1.5 结果分析 1.5.1 引种紫锥菊烷酰胺类的制备 经过经紫外分光光度法测定其烷酸胺类成分含量为 12.36%。 1.5.2MTT 法测定 引种紫锥菊提取物烷酰胺类对Con A刺激脾淋巴细胞增殖的影响试验结果见表1，图2。 表1 引种紫锥菊烷酰胺类对Con A刺激对脾淋巴细胞增殖的影响 6 农牧学院动物科学系 6 药物浓度g/mLOD570 00.0210.015B 0.010.2780.019B 0.10.3130.021B 10.2940.018B 100.3020.024B 注：Con A浓度：5g/mL B:差异极显著p0.05)。随着引种紫锥菊烷酰胺类浓度的升高，IFN-的生 成量表现为先上升后下降的趋势，引种紫锥菊烷酰胺类浓度0.1g/mL时，IFN-的生成量达到最大。 1.5.4 统计学处理 全部数据采用SPSS13.0进行统计分析，应用ANOVA进行方差分析，应用DUNCAN程序的显著 检验。各项指标以平均数标准差（）表示。 SX 第二章 讨论 农牧学院动物科学系 9 第二章 讨论 2.1 引种紫锥菊烷酰胺类含量 烷酰胺类化合物：紫锥菊的烷基酰胺类化合物具有免疫调节作用，还具有抗上呼吸道感染的作 用。Vinti等的实验表明紫锥菊所含的烷基酰胺可以抑制5-脂氧合酶和环氧合酶的活性，从而增加 NK细胞的数目6。本试验紫锥菊烷酰胺类含量测定值为12.36%，据报道9引种紫锥菊提取物烷酰胺 类含量28.37%。 ，可能与西宁地区的气候、土壤、自然条件有关。 2.2 引种紫锥菊烷酰胺类对细胞增殖的影响 T淋巴细胞是免疫细胞的主要组成部分,在机体免疫应答中起着核心作用,T淋巴细胞的转化和增 殖能力直接体现机体细胞免疫功能。本试验结果表明，引种紫锥菊提取物烷酰胺类在0.01-10g/mL 浓度范围内能够刺激脾淋巴细胞的增殖，与对照组相比，当浓度为0.1g/mL时差异极显著 （p0.05), 由此，推断引种紫锥菊烷酰胺类对 IFN- 生成有影响。 参考文献 农牧学院动物科学系 11 参考文献 1肖培根.国际流行的免疫调节剂紫锥菊及其制剂J.中草药,1996,24(1):46-48 2马小军、王雅玲等.紫锥菊在北京地区的引种J.中国中药杂志,199.924(10):590一592 3张莹,刘坷,吴立军.紫锥菊属药用植物研究进展J.中草药,200L32(9):852一855 4刘一兵.紫锥菊属植物制剂的化学、免疫作用与临床J.国外医药植物药分册,2001.16(2):4755 5 Poksch A， Wanger H. Structral analysis of 4- o-methyl- glu-curonrarabinoxylan with immune stimulating activity from Echinacea purpurea J . Phytochemisty. 1987，26: 1989-1993 6 Luettig B.， Steinmuller C.， Gifford GE.， Wagner H.