实验琼脂糖凝胶电泳及DNA纯化.ppt

实验二 琼脂糖凝胶电泳及DNA的纯化 一、实验目的 1、掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 2、掌握回收试剂盒纯化DNA的方法 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同 ，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带 。 二、实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖的浓度。 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效 应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因 而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以 通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而 得到检测。 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其 荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样 品DNA浓度。 注意事项： EB是有毒物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样， 三、实验材料、器具及药品 电泳： 实验一的PCR产物样品。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波 炉，紫外凝胶成像系统等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载 样缓冲液 纯化： 回收试剂盒 四、实验步骤 1g 琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀 。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解 的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固。 将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面 覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。 用移液器吸取PCR产物样品4l于封口膜上，再加 入2l 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚 蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。 将染色后的凝胶置于紫外凝胶成像系统上，盖 上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光 的DNA条带。 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微 漂洗。 v 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA分子大小来确定。 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 常用的电电泳缓缓冲液 4 保存备用. 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖 水溶液 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油 水溶液 常用的6X载样缓缓冲液 7、用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长 波长（300nm）UV灯下操作，并快速操作，以 免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶。 8、使用TAE缓冲液制作1琼脂糖凝胶，然后对 目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切 出含有目的DNA的琼脂糖凝胶。 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块 体积时，以1mg=1L进行计算 (100mg=100L)。 按照凝胶浓度，按下表提供的参数加入相 应3倍体积的NaI。 均匀混合后55加热融化胶块。间断振荡混合，使胶块充分融化( 约10分钟)。 加入20微升的硅胶树脂，充分混匀后室温放置20分钟。 注：硅胶树脂使用前，一定要将硅胶树脂液充分搅匀。 6. 离心（10，000 rpm、1分钟）后除去上清液。 注：此上清液在整个回收过程结束后，确认回收率较高时方可废 弃。如果回收率较低时，可在此上清液中再次加入硅胶树脂液，重 新吸附。 7. 在Microtube中加入800L清洗液，振荡搅匀后室温静置10分钟， 然后离心（10，000 rpm、1分钟），除去上清液。 注：请确认清洗液中已经加入指定体积的100%乙醇。 重复操作7（不需要静置10分钟） 注：为提高DNA片段的回收效率，此时应尽量除净上清液（完全 风干至不含残留的乙醇气味） 9. 加入和硅胶树脂等量（体积比）30L的灭菌蒸馏水后搅匀，55 水浴中放置10分钟。 离心（10，000 rpm、1分钟）后吸取上清液，尽量注意不要吸取 硅胶树脂。此回收上清液即可为DNA回收溶液。 几点注意事项加以说明： 加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不 会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以 赶走样品孔中的气泡。 应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样 时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分 析。 在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可 在阳极槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。