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中国馒头生产过程中小麦麦谷蛋白的聚合作用和麦谷蛋白聚合物的变化文献翻译题 目 中国馒头生产过程中小麦谷蛋 白的聚合作用和麦谷蛋白聚合 物的变化 学生姓名 高 翔 专业班级 食品科学与工程专业12-01班 学 号 541203010112 院 （系） 食品与生物工程学院 指导老师（职称） 张 露（教授） 完成时间 20 年 月 日 中国馒头生产过程中小麦谷蛋白的聚合作用和麦谷蛋白聚合物的变化Xiang-Yu Wang, Xiao-Na Guo, Ke-Xue ZhuState Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety,Jiangnan University, 1800 Lihu Avenue, Wuxi 214122, Jiangsu Province, PR China摘要：研究了中国馒头生产过程中谷蛋白的聚合作用和麦谷蛋白聚合物的变化，为改善和控制CSB质量提供理论依据。在面团的准备阶段，蛋白质的可萃取性和自由巯基（SH）的含量会增加到一定程度，但是在通入蒸汽后会有显著降低（P0.05）。同时，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）模式下，观测到大量的蛋白质聚合物。通过激光扫描共聚焦显微镜，对气泡微观结构和蛋白质网络的研究，进一步揭示了连续和三维面筋网络的形成。在面团的加工过程中，GMP湿重的损失和恢复是至关重要的（P0.05）。而麦谷蛋白的解聚作用与GMP湿重以及高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）和低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）的含量成负相关。谷蛋白的聚合作用会导致GMP的G和G减少，而谷蛋白的解聚作用诱导GMP的G和G略有增加。1 介绍中国是世界上最大的小麦生产国和消费国。中国馒头（CSB），也被称为中国的馒头，是一个基于小麦发酵的传统中国食品，占中国小麦消费量的40以上(Kim, Huang, Zhu, & Rayasduarte, 2009)。作为主食，尤其是在中国北方它被广泛食用，馒头已经获得了越来越多的兴趣和关注。虽然CSB和西方的面包有相似之处，但是CSB的加工完全不同于西方的面包。CSB可以通过面粉、酵母和水进行简单配制，不含蔗糖和氯化钠，而这两者总是出现在西式面包的配方(Lagrain, Thewissen, Brijs, & Delcour, 2007)。CSB与西方的面包相比，除了有着独特的口感和风味之外，还有着筋道、有弹性、质地致密、以及耐嚼的食用特点。而CSB的这些特点主要归因于面团的加工过程，例如：混合、发酵、揉捏和醒发。消费者喜欢馒头有一个白色、光滑且较薄的表皮，以及一个柔软、湿润且均匀的碎片，而不是西方传统的棕色皮面包(Su, Ding, Li, Su, & Zheng, 2005)。另外，CSB和西方面包两者之间产品质量的差异，主要由于CSB的制作是通过蒸制发酵好的面团这一独特的加工方法，而西方面包则是通过在烘箱中烘烤制成。相比烘焙来说，蒸制用其相对较低的温度和较高的水分含量，较好的保留多样内源性和补充营养素(Wang, Tao, Jin, & Xu, 2015)。Tsen、Reddy和Gehrke (1977)表明，蒸制相对于烘烤能够更好地保留面包原料中的蛋白质品质。此外，在不同含水量的情况下，加热谷蛋白能够诱导出不同的功能特性(Weegels, De Groot, Verhoek, & Hamer, 1994; Weegels, Verhoek, De Groot, & Hamer, 1994)。在蒸制馒头的过程中，其中的温度和水分含量使得淀粉发生热转换且导致面筋中的气孔进一步张开，这是CSB的典型特点。然而，涉及面团加工和CSB蒸制过程中所有组分的化学和物理转变尚未阐明。小麦粉是馒头的主要成分，它主要是由淀粉（约70-75%）、水（13-14%）和蛋白质（10-12%）组成，而所有的面粉组成成分都与CSB的生产和质量相关(Zhu, 2014)。特别是，蛋白质通常被认为是控制CSB质量的最重要的组成成分(Zhu, Huang, Khan, & OBrien, 2001)。面筋蛋白主要包括两大类蛋白质：麦醇溶蛋白单体和麦谷蛋白聚合物。虽然麦谷蛋白也存在链内键，但其含有的低分子量链间二硫键（LMW）和（或）高分子量麦谷蛋白亚基（HMW）形成了具有不同分子量的麦谷蛋白聚合物(Aussenac, Carceller, & Kleiber, 2001)。如果麦醇溶蛋白存在的话，仅通过分子内二硫键就能形成。现已报道麦谷蛋白的主要作用是使面团筋道和有弹性(Wang et al., 2014)，而麦醇溶蛋白则赋予面团有粘性的特点(Bruneel, Pareyt, Brijs, & Delcour, 2010)。此外，麦谷蛋白和麦醇溶蛋白之间不同的反应在面筋网络的形成中起到了关键作用。尽管其他的反应类型也存在，但这两种反应类型对于网络的形成来说是至关重要的。一种是氧化，其中自由巯基（SH）基团被氧化成二硫键（SS），从而导致大的蛋白质聚合物的形成(Bruneel, Lagrain, Brijs, & Delcour, 2011)。另一种是巯基-二硫键（SH-SS）交换，其中麦醇溶蛋白链接麦谷蛋白，它涉及到切割或改造二硫键，并且由面筋蛋白的自由巯基基团介导，这也将导致麦谷蛋白聚合物的解聚和重排(Lagrain, Thewissen, Brijs, & Delcour, 2008)。麦谷蛋白组分，即所谓的麦谷蛋白大聚合物（GMP），在发挥面团特性和面包制作质量中已经被证明起到了显著作用，且GMP可以分离成由HMW-GS和LMW-GS组成的SDS不溶性凝胶层。一些研究已经表明GMP的数量和流变学特性，以及面团特性和面包制作质量它们之间的相关性(Pritchard, 1993, Sapirstein & Suchy, 1999)。由于HMW-GS对GMP粒子的影响，因此对面粉的质量也进行了研究(Don, Mann, Bekes, & Hamer, 2006)。GMP特性包括数量、流变学和GMP的结构特征，它似乎在评估面团性质和预测面包制作质量上起到了重要作用。此外，GMP与各种工艺参数密切相关，因此，对于技术反应来说是重要的组成部分。多项研究表明，GMP直接与面团加工的某些工艺参数相关(Skerritt, Hac, & Bekes, 1999; Skerritt, Hac, Lindsay, & Bekes, 1999)。例如，一些研究混合能源(使用曲拐式搅拌机和销式混合器)对GMP的物理性质的影响，表明GMP含量和麦谷蛋白的大小取决于在两种混合系统中输入的机械能。有趣的是，与标准的曲拐式混合相比，面团简单的剪切并没有导致GMP湿重或麦谷蛋白粒子大小的减少，且改变了GMP成为连续的蛋白质相，显示出高能量耐受性能。GMP标示着最大的麦谷蛋白网络的蛋白质和面筋网络的形成，很大程度上源于谷蛋白的聚合/解聚。在以往的文献中，主要关注的是产品加工过程中谷蛋白的聚合(Rombouts, Lagrain, Brijs, & Delcour, 2012b; Singh, 2005)，而且一些研究人员只关注GMP(Don, Lichtendonk, Plijter, & Hamer, 2003a, 2003b; Ong, Ross, & Engle, 2010)。在考虑到谷蛋白的聚合/解聚和GMP改变面团特性以及CSD质量的重要性上，谷蛋白的聚合/解聚与GMP特性之间的关系被怀疑。据我们所知，很少文献着重于谷蛋白的聚合/解聚和GMP的变化之间的关系。此外，对于谷蛋白聚合和GMP在CSB中如何共同决定面筋网络形成的理解是很浅显的。小麦面筋网络的形成对于许多以小麦为主的食品来说是至关重要的，例如：面包(Lagrain et al., 2007)，意大利面(Bruneel et al., 2011)，披萨饼，椒盐卷饼(Rombouts, Lagrain, Brijs, & Delcour, 2012a)，磅蛋糕(Wilderjans, Pareyt, Goesaert, Brijs, & Delcour, 2008)和饼干(Pareyt, Van Steertegem, Brijs, Lagrain, & Delcour, 2010)。许多产品的特点都受到了面筋网络形成的影响，例如：面包的体积和筋道(Aussenac et al., 2001)，蛋糕的塌陷和面食烹饪损失(Bruneel et al., 2010)。制作CSB时，连续粘弹性的面筋网络在调节面团发酵和蒸制过程中的扩张起到了最重要和决定性的作用，此外，它在产品的尺寸规格和质量上也至关重要。强韧的网络包裹了酵母发酵过程中产生的二氧化碳气体，并直接有助于形成一个典型的扩张气泡和蜂窝结构(Zhu, 2014)，蒸制后，赋予典型的碎屑纹理。然而，具我们所知，谷蛋白在生产CSB过程中的变化信息是匮乏的。在混合、发酵、醒发和蒸制过程中，谷蛋白确切的性质变化还没达到共识，在CSB蒸制中，对于谷蛋白基本物理化学的转换知之甚少。谷蛋白交联机制的完整认识对于控制小麦制品的最终使用质量有很大的价值。因此，本研究的目标是为了进一步深入了解小麦谷蛋白在CSB加工过程中的聚合行为，并调查谷蛋白聚合和GMP特性变化之间可能的相关性。SE-HPLC和SDS-PAGE分别适用于检查经受CSB加工的每个阶段谷蛋白的聚合，并评估分子大小分布的变化。另外，自由巯基的水平，GMP湿重，GMP粒度分布，GMP流变学和GMP亚基也被确定。此外，为了可视化蛋白质网络的形成，通过CLSM观察谷蛋白的每一个阶段的微观结构。这项研究的目的在于丰富CSB生产过程中谷蛋白交联机制的认识，并为进一步研究控制CSB的质量提供理论依据。进一步的工作将完成探索谷蛋白聚合和CSB质量参数之间的关系。2 材料和方法2.1 材料 小麦面粉（品牌：金龙鱼，由益海嘉里粮油工业有限公司，济宁，中国制造）来自当地市场。水分，蛋白质含量(N*5.7)和灰分含量分别为13.240.01，11.190.05和0.420.03。新鲜，购买安琪干酵母（湖北，中国）。 在实验中使用的所有化学品、溶剂和试剂最少都要分析等级，分析至少要完成一式两份。2.2 CSB的准备 制作CSB的基本配方包含：面粉400克、蒸馏水200克、活性干酵母2克。和面前，将新鲜酵母溶解在温水中(35-40)，并放置3分钟以便于激活酵母。把配料放入搅拌机（雷鸟，加拿大）内搅拌4分钟（低速3分钟，然后再中速1分钟）。然后，把面团放在25和55%相对湿度的环境中发酵60分钟。发酵后，将40克（在第一步骤混合中使用小麦面粉的基础上加入10克/100克小麦面粉）小麦面粉和发酵面团再混合，并用低速搅拌五分钟。将混合面团分割，并以手工成型圆润的面团。然后，在38和85%相对湿度的环境中醒发30分钟。最后，将醒发过的面团在蒸笼上蒸30分钟。保留每个阶段面团的样本（混合、发酵、混合、揉面、醒发），并将在蒸馒头过程中，不同时间的面团状态立即用液氮冷冻，冷冻干燥和粉碎。2.3 高效液相凝胶色谱法(SE-HPLC) 蛋白质萃取和SE-HPLC是根据Lagrain, Brijs, Veraverbeke,和Delcour (2005)的方法做了一些调整。所有样品（含1.0毫克蛋白质）均用1.0毫升含有2.0（重量/体积）十二烷基硫酸钠（SDS）的一个0.05M磷酸钠缓冲液（PH=6.8）萃取，以下简称SDS缓冲液，并在室温下震荡60分钟。确定在还原条件下蛋白质的可萃取性，将样本用1.0毫升含有2.0M尿素和1.0%重量/体积）二硫苏糖醇(DTT)的SDS缓冲液来萃取，并将悬浮液以7690的加速度离心10分钟，再通过一个0.45微米的隔膜过滤后，得到干净的上清液。把蛋白质提取物装载到一个分离范围从15到500kDa (300 mm *7.8 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)的Biosep-SEC-S4000柱上，并显现在一个液相色谱(LC)系统上（日本岛津，日本京都）。洗脱溶剂为乙腈/水（1：1，V/V）含有0.05（体积/体积）三氟乙酸（TFA）与1.0毫升/分钟的流速且柱温为30。监测在214nm下蛋白质的洗脱。洗脱曲线被分成三个部分，使用最低的吸光度读数之间的峰值作为截止点。第一级分相当于在SDS缓冲液中萃取麦谷蛋白的水平，第二级分属于SDS-萃取麦醇溶蛋白的水平，第三级分是SDS-萃取小麦面粉蛋白质提取物中白蛋白和球蛋白的水平。在含有中等水平的SDS中(SDSEP)面筋蛋白的可萃取性总是由相应的峰面积来计算，并表示为还原条件下小麦面粉峰面积的百分比，这代表了面粉用SDS-萃取蛋白质的总量，因为降低的面筋蛋白是可以完全萃取的。2.4 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳）分析用12分离胶（PH=8.8）和5积层凝胶（PH=6.8）在垂直电泳细胞中进行蛋白质的SDS-PAGE分析。蛋白质萃取缓冲液是0.01M的Tris-盐酸（PH=6.8），含有10（重量/体积）SDS，10（体积/体积）甘油和0.1（重量/体积）溴酚蓝。每个样品60毫克，边加入样品边搅拌于1.0毫升提取缓冲液10分钟并在室温下放置1小时。为了减少蛋白质，提取缓冲液含有5（V/V）2-巯基乙醇（2-ME）。将样品在100 下加热5分钟后，以7690加速度离心10分钟。在每个泳道上放置体积为10微升的样品，且在电泳运行期间以100V的恒定电压进行。然后，将凝胶用0.25（重量/体积）考马斯亮蓝R-250染色，并用7（体积/体积）乙酸滴定至褪色。2.5 自由巯基含量的测定样品中巯基含量的测定方法是根据Rombouts, Jansens, Lagrain, Delcour, and Zhu (2014)所报道的方法进行了一些调整。把0.200g样品首先悬浮在5.0毫升含有2.0（重量/体积）SDS，3.0M的尿素和1.0毫摩尔/升乙二胺四乙酸四钠的0.05摩尔/升的磷酸钠缓冲液（样品缓冲液，PH=6.5）中，将混合物震荡60分钟。然后，再加入500微升5,5-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)试剂（0.1w/v的样品缓冲液），并将悬浮液在黑暗中略微震荡10分钟。接着，将悬浮液以11000加速度离心10分钟。等到完全加入DTNB试剂45分钟后，将上清液的吸光度在412nm空白处测定（不含DTNB试剂或样品）。吸光度值用还原性谷胱甘肽的校准曲线转化为自由巯基(1mol/gdm 蛋白质)的水平。2.6 激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）CLSM是一种能够更深层次的了解CSB内面筋蛋白网络的微观结构和三维结构的有价值的方法，由于它在食品体系内有选择和区分特定结构的能力(Drrenberger, Handschin, Conde-Petit, & Escher, 2001)，因此被应用于染色程序。从CSB的中间部分取馒头片(0.5*0.5*0.2 cm)，浸入2.5戊二醛的定影液后，放入0.1M磷酸盐缓冲液(PH=7.0)中24小时，并用CLSM制造商推荐的脱水乙醇（型号LSM710，德国莱卡）。部分馒头片在旋转切割机(PM2245, 莱卡)上用钢刀被消减为10微米厚之后，再转移到载玻片上。分别将异硫氰酸荧光素(FITC, 3.5*10-4 g/ml)和罗丹明B (1.3*10-5 g/ml)的溶液用于非共价标记的淀粉（绿色）和蛋白质（红色）。获得了一个像素分辨率为1024*1024的CLSM图像后，使用ZEN2012软件来分析确定面团和CSB样品的微观结构。FITC和罗丹明B的吸收光谱分别为488nm和561nm。2.7 GMP的分离GMP的分离是根据Don等人(2003a, 2003b)描述的方法进行了一些调整。将质量为1.4克的面粉悬浮于28毫升1.5（重量/体积）SDS，并在4下以20000加速度离心20分钟。倒出上清液，并在淀粉顶部的凝胶层收集GMP，将其立即称重作为GMP的湿重。取CSB制作不同阶段的冻干面团进行GMP分离作为面粉描述。在蒸CSB过程中，GMP以凝胶的形式分离导致蒸出的馒头品质不好。其原因可能是在蒸馒头的过程中，麦醇溶蛋白通过一个SH/SS交换反应并入麦谷蛋白中，并导致形成了一个永久的面筋网络。因此，由于在CSB中麦谷蛋白和麦醇溶蛋白之间的交联，面筋网络的流动性降低，麦谷蛋白组分不能被分离出凝胶层。此外，嵌入式淀粉的糊化降低了GMP凝胶分离的可能性。表1：在含有十二烷基硫酸钠的缓冲液中萃取蛋白数据表示为平均值标准偏差（n=2）。在同一列中的不同小写字母表示显着差异为P0.05。蛋白质在SDS中的可萃取性（）总是由相应的峰面积计算，并表示为还原条件下小麦面粉的峰面积的百分比，由于减少的谷蛋白是完全萃取，该百分比代表SDS-萃取面粉中蛋白质的总值。2.8 GMP的粒度分析 将新鲜制备湿的GMP（1克）样品分散在10毫升1.5（重量/体积）SDS上，轻轻旋转得到GMP的分散体，使其呈现出目视均匀和乳光。GMP分散体的粒度分布通过范围为0.1-1000微米的激光粒度（S3500，Microtrac Inc.公司，美国）来确定。2.9 GMP凝胶的流变学 GMP凝胶的流变学是根据Don等人(2003a, 2003b)的方法来进行测定的。从凝胶的顶部小心的取出GMP（1克），并在旋转流变仪（AR-G2，TA仪器）的平行板（平行板直径20毫米）上进行分析。测量是在20，0.03-10赫兹的频率扫描模式，线性粘弹性范围内以0.5的固定应变下进行，通过动态应变扫描测量确定。2.10 统计分析在研究中所得到的所有数据均表示为至少两个重复测定的平均值。方差分析（ANOVA）是使用SPSS16.0（SPSS公司，芝加哥，IL，美国）软件进行单项方差分析（ANOVA）和Duncan的多重范围测试。P 0.05是用来定义采样之间的差值显著性。3 结果与讨论3.1 面筋蛋白的可萃取性在含有介质的SDS中，蛋白质的可萃取性是交联程度的良好指示(Hayta & Schofield, 2004)。如表1所示，面筋蛋白的可萃取性，在CSB加工过程中，2%的SDS中的麦谷蛋白和麦醇溶蛋白差异十分显著。与小麦面粉相比，蛋白质混合后的可萃取性略有下降，这与Jazaeri等人(2015)的研究相符合。相比之下，Lagrain等人(2007)观察到面包面团在混合过程中蛋白质的可萃取性增加。其原因可能是，额外的盐诱导面筋蛋白(Fu, Sapirstein, & Bushuk, 1996)通过非共价相互作用发生解聚。麦醇溶蛋白的可萃取性降低表明，在面团混合过程中，部分麦醇溶蛋白通过疏水相互作用与麦谷蛋白相互联系。然而，由于增加了蛋白质的流动性，并通过水合作用改变了结构，SDS可萃取的蛋白质水平有显著的增加且高于小麦面粉混合时的值。观察到在发酵过程中谷蛋白和麦谷蛋白的可萃取性略有增加。再次混合和混合期间，由于机械能的输入使蛋白质的可萃取性有定性增加，可萃取的蛋白质和麦谷蛋白的数量在面团醒发时又再次减少，验证假设麦谷蛋白聚合物发生再聚合。总的来说，SDS可萃取蛋白质的改变，表明在面团加工中较少的发生解聚作用，从而保持更好的弹性以应对蒸制馒头时淀粉的膨胀(Bruneel et al., 2010)。许多科学家已经研究了面筋蛋白承受相对较高温度的性能(Deng, Tian, Zhao, Zhang, & Sun, 2008)。小麦面筋蛋白的热处理导致二硫键通过SH-SS交换反应和自由巯基的氧化后交联，从而导致大的蛋白质聚集物的形成及相应的流变和功能的变化(Lagrain et al., 2005)。表1显示，在蒸馒头时面筋蛋白的可萃取性有显著的降低(P0.05)，表明了蛋白质的聚集和密集面筋网络的形成，这是由于增加了巯基（SH）-二硫键（SS）的交换反应。蒸制对谷蛋白的可萃取性有很大的影响，且麦谷蛋白比麦醇溶蛋白更容易受到热处理。在蒸制的前十分钟内，大部分麦谷蛋白变为不溶性，且可萃取性显著降低95%以上，然后，即使在更长的蒸制时间内保持不变（表1）。蒸制10分钟麦醇溶蛋白的可萃取性减少43.9%，而蒸制20分钟导致麦醇溶蛋白的可萃取性减少75.6%（表1）。蒸制10分钟与蒸制5分钟相比，可萃取的麦醇溶蛋白大幅度减少了16.45%，这表明大量的麦醇溶蛋白通过SH-SS交换机制并入了麦谷蛋白。麦谷蛋白具有热敏感性，可以优先通过氧化自由巯基成为SS产生聚合，且部分与麦醇溶蛋白发生结合。蒸制10分钟后，麦谷蛋白的聚合主要归因于/型麦醇溶蛋白与麦谷蛋白的相互作用，除了缺乏半胱氨酸残基的-麦醇溶蛋白(Deng et al., 2008)。蒸制时间25分钟，麦谷蛋白的可萃取性略有增加（表1）。一种解释可能是二硫键（SS）的裂解和麦谷蛋白聚合物通过SH-SS交换重排。总之，谷蛋白的聚合主要发生再蒸制的过程，并且蛋白网络更易于跟随淀粉膨胀。3.2 谷蛋白的电泳概要分析 为了评估谷蛋白分子大小分布的变化，进行非还原的SDS-PAGE。图1所示，当蒸制5分钟和10分钟时，高分子量麦谷蛋白(90124 KD) (Marchetti, Cards, Campaa, & Ferrero, 2012)对应的分离凝胶顶部的谱带强度明显减少，与表1所示SDS萃取蛋白质的显著减少相对应。这与早期报道(Don et al., 2006)显示特定的高分子量麦谷蛋白亚基和产品性能的相关性一致。蒸制时间越长，分离凝胶顶部的谱带将消失，表明有较大尺寸的蛋白质聚合物的形成，且在非还原条件下无法进入凝胶。对于较低的分子量范围，/-麦醇溶蛋白(2840 KD)、-麦醇溶蛋白(3842KD)和低分子量麦谷蛋白(LMW-glutenins, 3644 KD)相对应的谱带强度在蒸制时间内逐渐减少，这与麦醇溶蛋白和麦谷蛋白在SDS中可萃取性的变化相一致。在蛋白质中，观测到-麦醇溶蛋白(5579 KD)的范围没有显著变化，这表明缺乏巯基基团，因此无法通过二硫键聚合。低分子量亚基的范围多达20KD，也被观测到在蒸制时蛋白质带的强度有显著减少，表明白蛋白和球蛋白广泛参与到蛋白质网络。综上所述，在这项研究中，冷冻干燥面团的电泳模式在蒸制之前没有显示出任何明显变化。在蒸制时，谱带强度多种多样。电泳图谱不仅反映了蛋白质在SDS中可萃取性的变化，而且进一步深入了解多种分子量亚基的聚合作用。图1.馒头生产过程中谷蛋白的SDS-PAGE分析：1、面粉；2、混合面团；3、醒发面团；4、再次混合面团；5、揉面团；6、再次醒发面团；7、面团蒸制5分钟；8、面团蒸制10分钟；9、面团蒸制15分钟；10、面团蒸制20分钟；11、面团蒸制25分钟；12、中国馒头3.3 CSB加工引起自由巯基（SH）的变化一般来说，自由巯基水平的改变最有说服力的指标是二硫键(Wang et al., 2014)的变化，这有助于一个三维蛋白网络的行成。混合和揉捏导致自由巯基的水平下降，表明机机械变形导致形成的结构内，自由巯基被埋在可溶性或不溶性蛋白质(Jazaeri et al., 2015)形成的难以接近的结构区域中，除非再次混合。再次混合使自由巯基的含量增加（图2）。大概水与添加面粉的竞争导致面团的流动性更大，且蛋白质在SDS中的可萃取性增加（表1），并因此显露了自由巯基。面团发酵和醒发的目的是通过酵母活动让面团达到最佳蒸制条件，使面团膨胀和延展。图2表明，在面团发酵和醒发期间，自由巯基的水平略有增加。面团延展性的增加可能与自由巯基的显露有关。如图2所示，蒸制5分钟自由巯基的含量显著降低，表明自由巯基快速氧化成二硫键，在某种程度上伴随着SH-SS交换反应。在蒸制的不同阶段，自由巯基表现出逐步减少的趋势，并在蒸制20分钟后几乎保持不变，表明链内/链间二硫键链接聚合物形成的增加。图2.中国馒头生产过程中自由巯基的水平：1、面粉；2、混合面团；3、醒发面团；4、再次混合面团；5、揉面团；6、再次醒发面团；7、面团蒸制5分钟；8、面团蒸制10分钟；9、面团蒸制15分钟；10、面团蒸制20分钟；11、面团蒸制25分钟；12、中国馒头3.4 激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）CLSM是为了可视化蛋白网络中气囊的形成，并且更深入的了解CSB加工过程中蛋白质微观结构的变化。在面筋蛋白网络和气泡的形态（暗区域）中观察到明显的区别。在蒸制之前，蛋白质组成了无定型矩阵，这是由嵌入式集群的淀粉颗粒和空隙组成的一个瞬态网络。4分钟的混合产生具有可见淀粉颗粒（绿色）的粗糙和不均匀的面筋结构（图3A-M）。这与Peighambardoust, VanderGoot, VanVliet, Hamer, and Boom (2006)的发现意见一致，他们观察到面团混合的早期阶段首先生成粗蛋白纤维。发酵使其形成一个均匀的蛋白质网络（图3A-F），并伴有较大的淀粉颗粒。然而，与混合和发酵时形成的蛋白质网络相比，再次混合使其形成不均匀和更紧致的结构。据报道，再次混合面粉限定了水的供应，并阻碍了面筋网络结构的优化发展，这与Li, Deng, Li, Liu, and Bian (2015)用扫描电镜观察研究的相一致。再次混合和随后揉捏的过程中，能量输入和限定水的供应导致了面团系统的重排，从而使不均匀气泡越来越小且相互接近，形成一个更紧致的蛋白质网络。进一步扩大面筋结构引起的延展和图3.用CLSM精心制作馒头屑（放大40倍）每个阶段的2D图片：（M）混合；（F）发酵；（RE）再次混合；（K）揉捏；（R）醒发；（S5S25）蒸制面团5 分钟，10分钟，15分钟，20分钟，25分钟；（CSB）中国馒头塌陷，有利于连续蛋白质网络的形成和发展。随后面团的醒发使其形成一个更加均匀的面筋结构，这意味着充分发展面团是为了准备蒸制。一些作者已经通过CLSM研究了面团和面包的微观结构(Drrenberger et al., 2001; Renzetti, Dal Bello, & Arendt, 2008)，但不是根据CSB生产中的蒸制时间。在这项研究中，观察到蒸制过程中蛋白质和淀粉在两种染色通道中的变化。在蒸制期间，同时在面筋网络和淀粉颗粒中观察到明显的区别。面筋网络变得连续，并要求在一定程度上蒸制5分钟，淀粉颗粒更可能从较小的颗粒膨胀成较大的颗粒。然而，它能清楚的看到面筋分子不均匀分布（图3B-S5）。蒸制10分钟，通过交联生成更均匀的和连续的蛋白网络（图3B-S10），这是由蛋白质在SDS中可萃取性的结果证实（表1）。同时，完整的淀粉颗粒在蛋白质网络中完全膨胀（图3B-S10）。随着蒸制时间的增长，这是可以看到完全膨胀和淀粉糊化形成的三维蛋白质网络结构。气泡趋向一个较大的直径，使其有足够的气体来支撑面筋网络。由于蒸制时淀粉糊化，淀粉颗粒的轮廓变得模糊。3.5 分析GMP的湿重和GMP的粒度一些研究已经表明，不溶性蛋白质聚合物的特性、面团的延展性和面包制作质量(Weegels, Hamer, & Schofield, 1997; Zhang et al., 2008)它们之间的关系密切。在选定的面团加工阶段，观察到面粉的GMP湿重有显著差异（P0.05）。混合使GMP湿重（图4A）和GMP粒度（图4B）明显降低。在混合时GMP的损失，伴随着可萃取麦谷蛋白的增加，这与先前的研究一致(Ong et al., 2010)。在发酵期间，GMP粒度减少，同时也观测到GMP湿重进一步损失。这是由于发酵过程中麦谷蛋白颗粒的溶解，且与蛋白质在SDS中可萃取性的发酵驱动增加相符合（表1）。再次混合的最后阶段，GMP湿重达到最低值，且GMP粒度再次下降。原因可能是再次混合与能量输入使麦谷蛋白颗粒进一步溶解（表1）。在CSB面团加工时的混合、发酵和再次混合中，GMP湿重连续下降而可萃取的蛋白质逐渐增加（表1）。在随后的醒发中，由于麦谷蛋白聚合物的重组(Weegels et al., 1997)，GMP的湿度和粒度显著增加（P0.05），这与先前观察到的面团特性一致(Aussenac et al., 2001)。GMP湿度的增加与SDS-可萃取麦谷蛋白的下降可能表明，较少的麦谷蛋白重聚合肯定与GMP湿重相关。此外，在混合与再次混合时，观察到面筋网络（图3AM，RE）粗糙且不均匀，而在发酵和醒发时，面筋网络（图3A-F，R）相对均匀。这些结构结合GMP湿重的变化表明，面筋网络的均匀性肯定与GMP湿重相关。原因可能在于GMP湿重的减少，诱导麦谷蛋白解聚，给予蛋白质与淀粉颗粒更多重排的可能性，导致面筋网络不稳定。考虑到酵母活性和面粉的再次混合，要注意GMP湿度和粒度恢复和损失时产生的深刻差异，这可能在CSB面团蒸制期间决定三维蛋白网络的形成起着主要作用。图4.在面团加工时，分析GMP的湿重（A）和GMP的粒度分布（B）：（FL）面粉；（M）混合；（F）发酵；（RM）再次混合；（R）醒发。3.6 GMP的流变特性图5所示，GMP的动态流变特性。储能模量G是凝胶弹性成分的测量，而损耗模量G是粘度的测量。GMP凝胶的G（图5A）高于G（图5B）的整个线性区域，呈现出卓越的弹性特性，并在面团加工的每个阶段遵循类似的趋势。混合使这两个模量的G和G减少，表明该凝胶的削弱。在发酵过程中，GMP的G和G与混合时相比有一定程度的增加，但仍低于对照组的GMP。再次混合使G降低，但G略有增加。再次混合后，醒发使这两个模量的G和G再次减少。在混合和醒发期间，大量可萃取蛋白质的减少表明谷蛋白发生聚合，但另一方面发酵和再次混合期间发生解聚，这由可萃取蛋白质的增加来证实。简单的说，在蒸制CSB时谷蛋白的聚合作用导致GMP的G和G减少。在CSB体系的发酵和再次混合期间，蛋白质发生解聚，并诱导GMP凝胶的G和G略有恢复。图5.（A）和（B）在CSB系统中面团加工时，GMP凝胶的（G和G）流变学性质：（FL）粉；（M）混合；（F）发酵；（RM）再次混合；（R）醒发。（C）在不同阶段GMP亚基的SDS-PAGE分析：（1）面粉；（2）混合；（3）发酵；（4）再次混合；（5）醒发。3.7 GMP亚基的分析 在还原条件下，采用SDSPAGE描述GMP蛋白质亚基的特性（图5C）。HMW-GS已经报道在GMP粒子的形成中起着重要作用(Ong et al., 2010)，并与不溶性麦谷蛋白的大小和数量密切相关。分离凝胶顶部的谱带强度略有增加。在面团的加工阶段，观察到HMW-GS的谱带强度降低，与之相应的是三个估计分子量为90-100KD的谱带，这与GMP湿重的减少相一致，并证实了之前的研究(Don et al., 2006; Weegels et al.,1997)，该报道称GMP的数量肯定与HMW-GS的内容相关。在混合和再次混合期间，观察到LMW-GS的降低，相当于范围为36-44KD的 MW的谱带强度。总的来说，在CSB体系的面团加工过程中，谷蛋白的较少解聚与GMP内HMW-GS和LMW-GS的含量成负相关。或许，谷蛋白的聚合和重聚合引起GMP内HMW-GS和LMW-GS的损失，并导致GMP湿重、粒度分布和G/G的变化。4 结论在这项研究中，检测CSB生产期间谷蛋白的聚合反应。在面团加工过程中，观察到谷蛋白的较少解聚，并伴随GMP特性的改变。结果表明，麦谷蛋白解聚作用与GMP湿重和GMP内HMW-GS和LMW-GS的含量成负相关。此外，谷蛋白聚合作用导致GMP的G和G减少，而谷蛋白解聚作用诱导GMP的G和G略有恢复。谷蛋白的较少解聚和GMP凝胶的削弱可能平衡面团的强度和弹性以达到最佳条件。在蒸制时，蛋白质在SDS中的可萃取性显著减少。首先，麦谷蛋白聚合，然后麦醇溶蛋白通过SS交联并入面筋网络。不仅是发面团存在一定的强度和延展性，而且在蒸制期间促进面筋蛋白聚合，这对于保留发酵、醒发和蒸制时产生的气体是至关重要的，从而提供抵抗粒子和限制淀粉膨胀。这个研究结果的目的是，丰富在CSB生产过程中对谷蛋白交联机制的认识，并为进一步研究控制CSB的质量提供理论依据。致谢这项工作是由中国国家自然科学基金资助(No. 31371849)，江苏省“协同创新中心的食品安全和质量控制”产业发展项目，青蓝工程，江苏省重点研发项目（现代农业）工程（BE2015327），中国博士后科学基金（批准号：2014年M560396）和江苏省规划的项目为博士后研究基金（批准号：1402072C）。参考文献Aussenac, T., Carceller, J.-L., & Kleiber, D. 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