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实验四 沉淀反应 双向扩散与免疫火箭电泳 实验课重点 掌握： 1.双向免疫扩散实验手工操作过程 2.火箭电泳原理及影响因素 熟悉： 1.双向免疫扩散实验结果分析 2.火箭电泳实验操作过程 实验一、双向扩散实验 原理：将抗原抗体 分别加在琼脂糖 不同的对应孔中 ，两者在凝胶中 自由扩散，在比 例合适处形成白 色沉淀线。 技术要点：平板玻璃上倾注一层均 匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔 径为3mm，孔间距在35 mm之间， 在相对的孔中加入10ul血清与抗血 清，放置湿盒371824h 后，观 察孔周围是否出现沉淀环。 鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一 双向扩散试验 （平板法） 试剂与器材 1.抗原：人血清 2.抗体：抗人IgG血清 3.生理盐水（1：21：64系列倍比稀释） 4.用生理盐水和琼脂粉配成1.1%的琼脂 5. 5*5cm的洁净培养皿 6.水浴箱，锥形瓶，打孔用小吸管移液器和 酒精灯等 实验一主要步骤 琼脂加热 制琼脂板 37度24小时 打梅花孔 加血清与抗血清 观察结果 应用 1.抗体效价的滴定 2.抗原或抗体纯度 的鉴定 双向扩散试验 （平板法） 实验一注意事项 1.琼脂要充分加热，倒板是要迅速且厚度掌 握在11.5mm（视线要在平皿侧面观察）。 2.打孔时要等琼脂完全冷却后，垂直打孔。 3.用针挑去孔内琼脂时要小心损伤孔边缘。 4.孔内加样要准确，不得使加样头碰到琼脂 孔边缘。 5.平皿要始终水平操作。 结果分析 A.Ag、Ab浓度及分子量相近；B. Ag、Ab浓度相近，分子量AgAb;D.浓度AgAb,分子量相近; E.浓度AgAb,分子量AgAb 电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的 抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减 少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原 抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄 ，形成一个形状如火箭的不溶性复合物 沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与 抗原量呈正相关。 原理 单向免疫扩散电泳,定量检测技术 实验二、火箭免疫电泳 试剂与器材 1.抗原：人血清 2.抗体：抗人IgG血清 3. 水浴箱，锥形瓶，移液器等 4.琼脂糖电泳槽 5.PH8.6巴比妥缓冲液 实验二主要步骤 PBS混合琼脂55 +抗血清 制琼脂电泳玻璃板 电泳槽加PH8.5PBS 取点样梳 电泳56小时 梳井内加血清 观察结果 PH8.6的巴比妥琼脂糖约55，加入 适量抗血清，混匀后制板，凝固后 取下点样梳，在梳井孔内加10ul标 准血清及待测样品血清，梳井样品 孔放负极侧， 电泳仪调节电势梯度 56V/cm，电流34mA，电泳56h后 观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲 线，求出待测样品浓度。 技术要点 火箭免疫电泳 1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状 不规则。 2.电泳终点时间的确定。 3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰 形. 4.IgG相反方向的电渗作用。 5.加样和琼脂中抗血清的浓度。 影响因素 火箭免疫电泳 火箭免疫电泳图 为标准抗原；为标本 - + 火箭免疫电泳示意图 定量结果判断 1.将待测电泳峰高度与1、2、3标准浓度血清 对比得出浓度。 2.将标准血清浓度与峰值高度绘制曲线图， 根据待测电泳峰高度，查处相应浓度。 实验二注意事项 1.琼脂要充分加热，倒板是要迅速且厚度掌 握在11.5mm，倒满整个玻璃挡板范围内。 2.要等琼脂完全冷却后，先从一侧慢慢取下 点样梳。 3. 加样要准确，要加到梳井孔内。 4.悬空加样，通电后不得用手触及电泳环境 中的缓冲液。 5.电泳一段时间后注意观察火箭沉淀现象。 火箭电泳应用的意义 火箭电泳作为抗原定量只能测定ug/ml以 上的含量，低于此水平则难以形成可见的沉 淀峰，若是使用少量 125I标记抗原或抗体，即使 含量低火箭峰不可见也可使用X线胶片显影的 技术显示火箭峰，测出ng/ml的含量浓度。 思考题 l火箭电泳实验结果不好,常会有哪些影响因 素,分别造成什么样的电泳图? 实验报告 实验一 1.实验报告标准格式 2.梅花孔图文描述（抗原与抗体复合物位置、形状 及代表意义；抗体效价浓度比例） 实验二 1.实验报告标准格式 2.火箭形状描述，失败或结果不好的原因 3.定量结果（与3个标准血清峰比较大致含量） 以上均以书面和图形表示在实验报告中 实验标本分类 实验一 1.美国贝克曼羊抗人血清igG试剂（每个大试 验台2支子弹头）共8支 2.人血清标本（每个大试验台2支子弹头）共 8支 3.5*5平板每人一个共56个 4.打孔吸管和挑取针（每个大试验台3附） 5.琼脂锥型瓶4个（每个大试验台1个） 实验标本分类 实验二 1.人标准血清1，2，3，和