毕业论文-虎杖配方颗粒的HPLC指纹图谱研究.docx

湖北医药学院毕业设计（论文）题 目：虎杖配方颗粒的HPLC指纹图谱研究学 院： 药 学 院 专 业： 药 学 年 级： 11 级 学 号： 201110062003 姓 名： 冯 祝 婷 指导教师： 黄 良 永 2015年 5月 15日学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 学位论文作者： (手写) 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保障、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关学位论文管理部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权省级优秀学士学位论文评选机构将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：保密 ，在_年解密后适用本授权书。不保密 。（请在以上相应方框内打“”）作者签名： 年 月 日 教师签名： 年 月 日 目录摘要 11仪器与试剂32 方法与结果42.1测定方法42.1.1色谱条件：42.1.2 供试品溶液的制备52.1.3 色谱适应性试验 62.2 指纹图谱方法学考察72.2.1精密度实验 72.2.2重复性实验 72.2.3稳定性试验83 结果83.1 已知成分的鉴别和参比峰的确认83.2 指纹图谱的建立和相似度评价84.讨论154.1色谱条件的选择154.1.1流动相考察：154.1.2 波长的考察：154.2供试品提取方法的选择154.3 药材和颗粒的对比164.4 实验结论：16致 谢17参考文献18湖北医药学院本科毕业设计（论文）：虎杖配方颗粒的HPLC指纹图谱研究虎杖配方颗粒的HPLC指纹图谱研究冯祝婷（湖北医药学院药学院2011级）；指导老师 黄良永摘要 目的：建立虎杖配方颗粒的HPLC指纹图谱，为虎杖配方颗粒的质量控制和评价提供依据。方法：采用高效液相色谱-线性梯度洗脱法，测定了12批不同厂家的虎杖配方颗粒中虎杖苷和大黄素的含量，并建立了指纹图谱；色谱条件为 SunFire C18色谱柱 （ Waters,4.6250mm，5m），流动相为乙腈（A）和0.05%磷酸溶液（B），流速：1.0 mLmin - 1 ，柱温: 30 ，检测波长230nm，进样10l。结果: 采用国家食品药品监督管理局推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A 版)”计算处理，通过HPLC指纹图谱分析，虎杖配方颗粒有14个共有的色谱峰，相似度均大于0.98，并确认2个已知峰为虎杖苷和大黄素。结论：本研究所建立的虎杖配方颗粒HPLC指纹图谱稳定性、重复性好，可作为虎杖配方颗粒质量质量控制和评价提供参考。关键词：虎杖；配方颗粒；HPLC；指纹图谱；虎杖苷；大黄素；Study on the HPLC Chromatogram of Polygonum cuspidatum Dispensing Granule Feng Zhu-Ting (Hubei University of Medicine; Hubei Shiyan 442000,China)Abstract Objective: To set up HPLC fingerprint of Polygonum cuspidatum Dispensing Granule. Methods: 12 samples were analyzed by HPLC with references of Polygonum cuspidatum Anaysis was performed on an Waters SunFire C18 column（4.6mm250mm,5m) with mobile phase A: acetonitrile and mobile phase B: 0.05%phosphoric acid solution by gradient elution;flow rate was 1.0ml.min-1, wavelength was 230nm and column temperature was 30，injection volume 10L.Results: By analyzing the Chromatogram fingerprints with 14 characteristic common peaks including Polydatin and Emodin the similarities of them were more than 0.98. Conclusion:The method can provide more information for the quality control of Polygonum cuspidatum dispensing Granule.Keywords: Polygonum cuspidatum; Dispensing Granule; HPLC; Chromatogram fingerprint；Polydatin; Emodin 虎杖为蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSielb.etZucc.的干燥根茎和根。有利湿退黄，清热解毒，散瘀止痛，止咳化痰之功效。用于湿热黄疸，淋浊，带下，风湿痹痛，痈肿疮毒，水火烫伤，经闭，瘸瘕，跌打损伤，肺热咳嗽1。虎杖主要含有芪类、蒽醌类、黄酮类及酚类等成分，其中芪类成分目前研究较多的主要为白藜芦醇和虎杖苷，蒽醌类成分主要包括大黄素、大黄素甲醚和大黄酚等。虎杖具有广泛的药理活性，对人体多个系统多种疾病具有治疗作用。文献报道2,3,4,5虎杖具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老等作用。虎杖配方颗粒以虎杖药材为原料，经水提取、浓缩、喷雾干燥而制成的颗粒，临床供配方用；中药配方颗粒具有质量可控、疗效高、节约药源、调配、服用、储存、运输方便等优点，它可以替代中药饮片在临床上使用,并且越来越受到广大患者的欢迎。中药配方颗粒是中药饮片改革的一种必然趋势,是保持传统中药汤剂特色的一种标准化剂型,是传统中医药走出国门的有效载体；因此,虎杖配方颗粒的质量控制越来越重要，中药指纹图谱能全面的反映中药的整体化学特征，体现其内在的整体质量，特别适合虎杖这种活性成分多的配方颗粒的质量控制。目前, 中药指纹图谱已成为国际上公认的控制中药或天然药物质量的评价模式6。目前，虎杖配方颗粒的质量标准研究很少，有文献报道7，采用薄层色谱法对虎杖配方颗粒进行定性鉴别, 用高效液相色谱法测定虎杖苷和大黄素等成分含量，也有8学者建立中药配方颗粒特征图谱鉴定方法。本文采用高效液相色谱-线性梯度洗脱法对12批不同厂家的虎杖配方颗粒进行指纹图谱研究，并采用中国药典委员会推荐使用的“中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A) 进行相似度评价，建立了虎杖配方颗粒的HPLC指纹图谱，为虎杖配方颗粒质量评价和临床用药提供参考。1仪器与试剂DIONEX U3000四元高效液相色谱仪(美国戴安公司，四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器DAD、柱温箱)；Chromeleon色谱工作站；Waters SunFire C18色谱柱（美国WATERS公司，4.6mm250mm,5m，）；KM-410D超声清洗机(广东科盟家电公司，40KHz，240W功率可调)；GWA-10超纯水机（北京普析通用）；AUW120D电子天平(十万分之一，日本岛津)；乙腈、甲醇为色谱纯；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。虎杖苷对照品（批号111575-200502）、大黄素对照品（批号110756-200110）均由中国食品药品检定研究院提供。虎杖药材（批号20140501，湖北神农本草中药饮片有限公司提供）；配方颗粒12批（每袋装量1g相当于虎杖饮片15g，批号生产厂家见表1） 。 表1 虎杖配方颗粒批号及生产厂家样品编号批号生产厂家S11109001S华润三九医药股份有限公司S21206001S华润三九医药股份有限公司S31303001S华润三九医药股份有限公司S41308002S华润三九医药股份有限公司S51308003S华润三九医药股份有限公司S61402001S华润三九医药股份有限公司S71404001S华润三九医药股份有限公司S81207073江阴天江药业有限公司S91304021江阴天江药业有限公司S101309042江阴天江药业有限公司S111311072江阴天江药业有限公司S121403011江阴天江药业有限公司2 方法与结果2.1测定方法2.1.1色谱条件：SunFire C18色谱柱（Waters,4.6mm250mm，5m）；流动相为乙腈（A）和0.05%磷酸溶液（B），按表2程序进行线性梯度洗脱；流速：1.0 mL min - 1 ；柱温: 30 ；检测波长:230nm；进样10l。表2 流动相梯度表Tab 2. Mobile phase gradient tables时间/min乙腈/%0.05%磷酸溶液/%-101585015853035655065357080202.1.2 供试品溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称取虎杖苷对照品22.48mg置50ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得虎杖苷含量为0.4496mg.ml-1的对照品储备液；精密称取大黄素对照品17.32mg置20ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得大黄素含量为0.866mg.ml-1的对照品储备液。精密量取虎杖苷对照品贮备液20ml和大黄素贮备液4ml混合均匀，即得混合对照品溶液（大黄素含量0.1443 mg.ml-1，虎杖苷含量0.3747mg.ml-1）。 样品溶液的制备：精密称取虎杖饮片粉末和配方颗粒的粉末（均过四号筛）0.1g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，超声40min（150W，40KHz），放冷，称重，补足减失的质量，滤过，取续滤液，即得样品溶液。2.1.3 色谱适应性试验 精密取混合对照品溶液、虎杖药材样品溶液、虎杖配方颗粒样品溶液各10l，注入液相色谱仪，在“2.1.1”色谱条件下，虎杖药材和虎杖配方颗粒样品溶液在对照品色谱相同的位置有虎杖苷和大黄素的峰，二成分峰与其相邻峰的完全分离，二成分峰纯度经DAD检测器扫描对比符合度到99.5%，说明和对照品的峰完全一致。见色谱图1。 0.010.020.030.040.050.060.070.0min12 A0.010.020.030.040.050.060.070.0min12 B0.010.020.030.040.050.060.070.0min12 C图1色谱图（A 对照品溶液；B 虎杖饮片；C 虎杖配方颗粒；1 虎杖苷，2大黄素）Fig 1 HPLC chromatogram（A. standard solution; B.sample solution；1 Polydatin; 2 Emodin）2.2 指纹图谱方法学考察2.2.1精密度实验 取同一供试品溶液（1402001S），按“2.1.1”项下色谱条件连续进样5次，每次10L，记录色谱图，测定主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积,结果主要共有峰 1-14号峰相对保留时间的RSD为均小于0.3%，相对峰面积的RSD均小于0.7%，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度好。2.2.2重复性实验 取同一样品（1402001S）粉末6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下方法进样测定并分别测定其色谱图，结果其相对保留时间稳定, 主要共有峰1-14号峰相对保留时间的RSD小于0.15%，相对峰面积的RSD均小于1.12% ，说明本方法重复性较好。2.2.3稳定性试验 取同一样品（1402001S）溶液在0、4、12、24h分别按“2.1.1”项下方法进样测定并分别记录其色谱图，测定主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积, 结果主要共有峰1-14号峰相对保留时间的RSD均小于0.15%，相对峰面积的RSD均小于0.5% ，结果表明供试品溶液室温下24h内成分保持稳定，能满足指纹图谱测定的要求。3 结果 3.1 已知成分的鉴别和参比峰的确认 供试品溶液和混合对照品溶液在“2.1.1”色谱条件下得到的色谱图，通过色谱峰的保留时间比较和二极管阵列检测器的纯度检查比对，对指纹图谱中相应色谱峰进行确认，4号峰为虎杖苷；14号峰为大黄素。其中12号峰的保留时间适中，峰面积值较大且稳定，所以选择12号峰为参比峰（见图2）。3.2 指纹图谱的建立和相似度评价 取“2.1”项下12批虎杖配方颗粒样品溶液和混合对照品溶液，在“2.1.1”色谱条件下, 测定其色谱图。利用“中药指纹图谱相似度评价系统（2004 A版）”软件，采用自动匹配法生成共有模式对照图谱R并分析各样品之间共有峰和相似度，确定共有峰。结果发现12批供试品共有14个共有峰,见图3。各图谱与共有模式对照图谱R相似度见表3。以选定的12号峰为参比峰，设定其相对保留时间和峰面积为1，计算其他共有峰相对它的相对保留时间和相对峰面积，结果表4、5。14132129412387561011图2 虎杖配方颗粒共有模式对照图谱R（4 虎杖苷；14 大黄素）Fig2. Polygonum cuspidatum dispensing granule formula of model reference HPLC-R(4 Polydatin; 14 Emodin )图3 12批样品的HPLC指纹图谱相似度比较Fig3. The HPLC fingerprint similarity comparison of 12 samples表3 样品特征图谱与共有模式对照图谱R的相似度Tab3. HPLC fingerprint of Samples and formula of model reference HPLC-R similarityS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12对照指纹图谱S110.99910.980.9780.9780.9740.9790.9790.9850.9850.9770.994S20.999110.980.9790.9790.9740.9790.980.9850.9860.9780.995S31110.9810.980.980.9750.980.980.9840.9850.9770.995S40.980.980.98110.9990.9990.99710.9990.9670.9670.9630.993S50.9780.9790.980.99910.9990.9970.9990.9990.9660.9660.9620.993S60.9780.9790.980.9990.99910.9980.9990.9990.9660.9660.9630.993S70.9740.9740.9750.9970.9970.99810.9970.9970.9620.9620.9660.99S80.9790.9790.9810.9990.9990.997110.9660.9660.9610.993S90.9790.980.980.9990.9990.9990.997110.9660.9660.9620.993S100.9850.9850.9840.9670.9660.9660.9620.9660.966110.9930.988S110.9850.9860.9850.9670.9660.9660.9620.9660.966110.9930.988S120.9770.9780.9770.9630.9620.9630.9660.9610.9620.9930.99310.984对照指纹图谱0.9940.9950.9950.9930.9930.9930.990.9930.9930.9880.9880.9841表4 HPLC指纹图谱共有峰相对保留时间Tab4 Retention time of characteristic peaks峰号123456789101112RSD%10.239 0.240 0.239 0.240 0.240 0.241 0.240 0.241 0.240 0.240 0.240 0.238 0.370 20.297 0.299 0.297 0.297 0.297 0.300 0.297 0.299 0.298 0.298 0.299 0.296 0.341 30.347 0.349 0.347 0.347 0.347 0.350 0.347 0.348 0.348 0.348 0.349 0.346 0.313 40.475 0.478 0.475 0.477 0.476 0.477 0.475 0.477 0.476 0.477 0.478 0.474 0.254 50.496 0.499 0.496 0.498 0.496 0.498 0.496 0.498 0.497 0.498 0.499 0.495 0.250 60.589 0.592 0.589 0.591 0.590 0.592 0.590 0.591 0.590 0.591 0.592 0.588 0.205 70.632 0.634 0.631 0.633 0.632 0.633 0.632 0.633 0.632 0.633 0.634 0.630 0.169 80.664 0.665 0.664 0.665 0.665 0.665 0.664 0.665 0.664 0.665 0.666 0.663 0.143 90.718 0.720 0.718 0.719 0.719 0.719 0.718 0.719 0.718 0.719 0.720 0.717 0.111 100.835 0.836 0.835 0.836 0.836 0.837 0.836 0.837 0.836 0.836 0.837 0.834 0.102 110.961 0.961 0.960 0.961 0.961 0.960 0.961 0.961 0.960 0.960 0.961 0.960 0.027 121.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000 131.187 1.187 1.187 1.187 1.185 1.186 1.187 1.186 1.186 1.186 1.186 1.187 0.052 141.808 1.806 1.810 1.810 1.808 1.804 1.812 1.812 1.810 1.807 1.809 1.812 0.143 表5 特征图谱共有峰相对峰面积Tab5 Relative peak areas of characteristic peaks峰号123456789101112RSD%10.090 0.090 0.091 0.136 0.136 0.098 0.094 0.097 0.099 0.096 0.097 0.097 16.096 20.076 0.074 0.077 0.042 0.050 0.042 0.038 0.040 0.041 0.054 0.055 0.057 27.087 30.083 0.076 0.086 0.252 0.253 0.267 0.258 0.266 0.267 0.229 0.235 0.235 37.245 41.915 1.913 1.956 2.233 2.230 2.274 2.245 2.271 2.287 1.525 1.540 1.552 15.500 50.068 0.066 0.069 0.070 0.071 0.069 0.071 0.071 0.073 0.096 0.100 0.102 17.843 60.078 0.088 0.097 0.144 0.116 0.153 0.155 0.156 0.143 0.056 0.056 0.058 37.815 70.108 0.108 0.111 0.166 0.165 0.159 0.159 0.162 0.164 0.113 0.115 0.117 19.272 80.053 0.052 0.049 0.035 0.031 0.031 0.056 0.057 0.058 0.044 0.045 0.045 20.772 90.219 0.221 0.225 0.138 0.136 0.139 0.138 0.139 0.140 0.145 0.149 0.182 22.315 100.529 0.528 0.534 0.916 0.906 0.928 0.937 0.940 0.941 0.369 0.370 0.370 37.253 110.131 0.128 0.131 0.160 0.161 0.163 0.158 0.157 0.159 0.274 0.274 0.261 31.078 121.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000 130.162 0.168 0.176 0.176 0.171 0.167 0.166 0.164 0.163 0.156 0.162 0.161 3.647 140.315 0.314 0.319 0.598 0.596 0.602 0.602 0.602 0.603 0.314 0.314 0.315 32.531 4.讨论4.1色谱条件的选择4.1.1流动相考察：用乙腈-0.05%磷酸溶液系统和乙腈-0.1%磷酸溶液系统进行梯度洗脱，结果用乙腈-0.05%磷酸溶液系统分离度高，峰形对称性好。4.1.2 波长的考察：考察了不同波长下的指纹图谱，结果见表6，在230 nm处，虎杖含有的主要成分有较强的吸收，出峰数量多，故选择230 nm作为指纹图谱的检测波长。4.2供试品提取方法的选择 在供试品的制备上, 分别采用水、50%甲醇、50%乙醇、70% 甲醇、70%乙醇、100%甲醇、100%乙醇对虎杖配方颗粒进行提取，分别超声提取时间20min、30min、40min，结果100% 甲醇超声20min提取效率较高，色谱峰数量最多，色谱峰的强度较大, 虎杖苷、大黄素等特征性成分的出峰好，图谱稳定。表6波长峰面积230158.225414.228474.429092.9303119.84.3 药材和颗粒的对比 在“2.1”色谱条件下，分别建立了虎杖药材和虎杖配方颗粒指纹图谱，见色谱图2、3，通过对谱图的比较，其谱图的保留时间没有差异，但虎杖配方颗粒指纹图谱的峰数目比虎杖药材指纹图谱少，不过其主要指纹峰依然存在。虎杖配方颗粒指纹图谱的峰面积也比虎杖药材指纹图谱峰有所减小。这是因为药材和颗粒的加工过程不一样，虎杖颗粒还需用醇提取，故有少部分成分丢失，所以其指纹图谱有所差异。4.4 实验结论：12批样品的HPLC指纹图谱中,14个共有峰的相似度均大于0.9，说明虎杖配方颗粒的HPLC指纹图谱稳定可靠；各批号样品间14个共有指纹峰的相对保留时间比较吻合；