[医药]国产血竭龙血素A和龙血素B的含量测定及二者的相关性分析.doc

国产血竭中龙血素A和龙血素B的含量测定及两者的相关性分析宓鹤鸣 孙胜利 （第二军医大学药学院药物分析教研室，上海 200433） 姚庆芳 吴茵铭 罗四清 郑有顺（广东名盛药业有限公司开发部， 广州 510240）摘要：目的:RP-HPLC法测定不同品牌国产血竭中龙血素A和龙血素B的含量，并对龙血素A和龙血素B含量进行相关性分析。方法 :采用反相高效液相色谱法，乙腈-冰醋酸（190）（40：60）为流动相，流速：1.0ml/min;UV检测波长：270nm；柱温：室温。结果：龙血素A浓度424g/ml范围内和峰面积呈线性相关，回归方程Y=855.8+8037.1X (r=0.9999)；龙血素B在20120g/ml范围内和峰面积呈线性相关，回归方程为Y=219.3+8081.8X (r=0.9999)。结论：所测6种国产血竭样品中龙血素B含量均未达到部颁标准的规定，龙血素A的含量明显高于龙血素B的含量，龙血素A和龙血素B的含量呈现明显的相关性。关键词： 国产血竭 龙血素A 龙血素B 含量测定 HPLC法 相关分析 血竭是珍贵的中药传统品种之一，该药性平，味甘、咸，有活血祛瘀、消肿止痛、收敛止血之功效，主要用于跌打损伤、内伤瘀痛、外伤出血、溃疡不敛等症。以往血竭一直依赖进口。70年代以来，我国著名植物学家蔡希陶先生在云南孟连县发现剑叶龙血树资源可提取血竭，从此开始了国产血竭的研究。目前，广西研究的“龙血竭”已获得国家一类新药证书，并已收载于卫生部药品标准1。国产血竭已替代进口血竭在各地广泛使用。国产血竭的质量标准虽已转为正式标准，但经我们的实际应用，发现存在一定问题。龙血素A和龙血素B化学结构相似，按现行标准的方法、条件，两者色谱峰混杂，很难分离。本文重新探讨提取流程，优化分离条件，并对指标成分龙血素B和干扰成分龙血素A进行定量分析，从中探讨新的质量控制方法。1. 样品的来源 柬龙牌龙血竭及原材料：由广东名盛药业有限公司生产，批号20010602；云杉牌国产血竭胶囊：云南个旧市制药厂，批号20000606；大公牌龙血竭胶囊：中国广东省肇庆市制药厂，批号010202；雨林牌国产血竭胶囊：中国科学院西双版纳热带植物园制药厂，批号000306；芒果牌国产血竭原料药：广西中医学院制药厂。2. 实验及结果2.1反相高效液相色谱法测定龙血素A的含量 2.1.1仪器和试剂 仪器：Waters 2487可变双波长紫外检测器，Waters 515型泵，CDMC-4色谱数据处理机 。 试剂：龙血素A对照品（本室自己分离得到，并经质谱和核磁共振鉴定结构，纯度99.9%），乙睛（色谱纯），其他所用试剂均为分析纯。2.1.2对照品溶液的制备：精密称取龙血素A对照品4mg，加乙腈10 ml溶解，制成每1ml含400g的溶液，作为标准贮备液。2.1.3色谱条件 色谱柱：DiamonsilTM C18, 5，250mm4.6mm，迪马公司；流动相：乙腈-冰醋酸（190）（40：60），流速：1.0ml/min；检测波长：270nm；灵敏度：1.00AUF；处理机衰减：2；柱温：室温。 系统适应性实验：在以上色谱条件下，注入供试品溶液，塔板数按龙血素A峰计算大于10000，龙血素A与龙血素B峰的分离度大于1.2。2.1.4标准曲线和线性范围1. 精密量取标准贮备液溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，定量稀释于10ml容量瓶中，摇匀，各取20l，注入液相色谱仪。色谱图见图1。 以龙血素A的峰面积为因变量（Y），龙血素A对照品浓度为自变量（X），求得回归方程为：Y=855.8+8037.1X（r=0.9999）； 峰面积与浓度在424g/ml范围内呈良好线性关系。2.1.5方法考察（1）日内精密度和日间精密度，精密量取龙血素A对照品溶液0.5ml，稀释于10ml容量瓶中，摇匀，一日内进样5次，测定，得日内精密度RSD为0.64 %，连续进样3天得日间精密度RSD为1.49 %。（2）加样回收率试验：在已知含量的样品中精密加入一定量的龙血素A，按样品测定的供试品溶液的制备和测定方法试验，计算得回收率为102.7 %（n=3）。2.1.6样品测定精密称取样品粉末约1g，加硅藻土2g混匀，置索氏提取器中，加石油醚（6090）100ml，水浴加热回流2hr，弃去石油醚部分，再加氯仿100ml，水浴加热回流6小时，得提取液，浓缩至干，加醋酸乙酯适量溶解，移至100ml量瓶中，用醋酸乙酯洗涤容器3次，洗液并入量瓶中并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，收集续滤液作为供试品溶液。精密量取供试液1ml，挥干乙酸乙酯，用乙腈定容于10ml容量瓶中，摇匀，取20l注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表1。色谱图见图2。表1 龙血素A含量测定结果(n=3)样品号123456龙血素A的含量（g/g）1.661.771.151.181.781.161. 柬龙牌龙血竭原材料； 2.云杉牌国产血竭胶囊； 3.大公牌龙血竭胶囊；4.柬龙牌龙血竭胶囊； 5.雨林牌国产血竭胶囊； 6.芒果牌国产血竭原料药 图1 龙血素A对照品 图2 样品 2.2反相高效液相色谱法测定龙血素B的含量2 2.2.1仪器和试剂 仪器：同龙血素A测定项下。 试剂：龙血素B对照品（购于广西中医药研究所），乙睛（色谱纯），其他所用试剂均为分析纯。2.2.2对照品溶液的制备：精密称取龙血素B对照品5.6mg，加乙腈10 ml溶解，制成每1m含560g的溶液，作为标准贮备液。2.2.3色谱条件 色谱柱：同龙血素A测定项下。 系统适应性实验：在以上色谱条件下，注入供试品溶液，塔板数按龙血素B峰计算大于10000，龙血素B与龙血素A峰的分离度大于1.2。2.2.4标准曲线和线性范围 精密量取标准贮备溶液各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，分别用乙腈稀释，定容于10ml容量瓶中，摇匀，各取20l，注入液相色谱仪。色谱图见图3。 以龙血素B的峰面积为因变量（Y），龙血素B对照品浓度为自变量（X），求得回归方程为：Y=219.3+8081.8X（r=0.9999）， 峰面积与浓度在20120g/ml范围内呈良好线性关系。2.2.5方法考察（1）日内精密度和日间精密度，精密量取龙血素B对照品溶液0.5ml，稀释于10ml容量瓶中，摇匀，一日内进样5次，测定，得日内精密度RSD为1.84 %，连续进样3天得日间精密度RSD为2.01 %。（2）加样回收率试验：在已知含量的样品上精密加入一定量的龙血素B，按样品测定的供试品溶液的制备和测定方法试验，计算得回收率为94.8 %（n=3）。 2.2.6样品测定精密称取样品粉末约1g，加硅藻土2g混匀，置索氏提取器中，加石油醚（6090）100ml，水浴加热回流2hr，弃去石油醚部分，再加氯仿100ml，水浴加热回流6小时，得提取液，浓缩至干，加醋酸乙酯适量溶解，移至10ml量瓶中，用醋酸乙酯洗涤容器3次，洗液并入量瓶中并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，收集续滤液作为供试品溶液。精密量取供试液1ml，挥干乙酸乙酯，用乙腈定容于10ml容量瓶中，摇匀，取20l注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表2。色谱图见图4。表2 龙血素B含量测定结果（n=3）样品号123456龙血素B的含量（g/g）0.310.310.230.250.290.231. 柬龙牌龙血竭原材料； 2.云杉牌国产血竭胶囊； 3.大公牌龙血竭胶囊；4.柬龙牌龙血竭胶囊； 5.雨林牌国产血竭胶囊； 6.芒果牌国产血竭原料药 图3 龙血素B标准品 图4 样品3.龙血素A和龙血素B含量相关性分析以龙血素A的含量为X，龙血素B的含量为Y，应用SAS软件进行相关性分析，结果如下： Simple Statistics Variable N Mean Std Dev Sum Minimum Maximum X 6 1.450000 0.316986 8.700000 1.150000 1.780000 Y 6 0.270000 0.037947 1.620000 0.230000 0.310000 Pearson Correlation Coefficients / Prob |R| under Ho: Rho=0 / N = 6 X Y X 1.00000 0.94440 0.0 0.0046 Y 0.94440 1.00000 0.0046 0.0上述相关性统计结果表明：国产血竭中龙血素A和龙血素B的含量呈现较好的正相关关系，对6个不同品牌国产血竭样品的统计结果，相关系数达到0.9444。也就是说，样品中，龙血素A含量高，则其龙血素B的含量也高，反之亦然。3. 小结与讨论3.1龙血素A与龙血素B的结构式非常接近，如下图5、图6。这使两者在较低柱效的色谱柱上很难分开，我们在塔板数5000的柱子上，按上述条件，两者合并为一个峰。以往文献报道中未出现此种情况可能是因为两者根本就没有分开，作为一个峰来定量，这势必就使龙血素B的定量出现严重偏差。 图5 龙血素A结构式 图6 龙血素B结构式 3.2本文优化HPLC分离条件，使这两个较难分离的化合物在常规色谱条件下即可分离定量，有利于该质量控制方法的普及应用。但色谱柱的柱效至少在10000以上，才能达到较好的分离效果。3.3本方法的柱前处理较以前质量标准规定的处理方法有了较大的改进，略去烦琐的薄层色谱分离，通过石油醚提取去除对柱子污染较严重的脂溶性杂质，并且对石油醚提取物按上述色谱条件进样，未发现龙血素A和龙血素B峰，说明石油醚去除杂质对龙血素A和龙血素B的提取没有任何损失。3.4从样品HPLC色谱图上可以看出，未经薄层色谱预处理直接进样，龙血素A和龙血素B色谱峰附近均无杂质峰干扰，可以很好的进行定量。3.5从含量来看，龙血素A的含量高于龙血素B的含量5倍左右，测定龙血素B时，因样品较浓，对色谱柱污染较严重，而测定龙血素A时，因样品较稀，对色谱柱污染较小。而且，因龙血素A不但含量比龙血素B高，紫外光谱同龙血素B相似，并且吸收强度比龙血素B高（灵敏度高），因此在测龙血素B时受龙血素A的干扰比较大，而测龙血素A时，受龙血素B的干扰就相对较小。所以，定量龙血素A比定量龙血素B更准确。3.6龙血素A和龙血素B的结构相似，两者药理活性有待于进一步比较，如果两者药理活性相似，可以考虑把龙血素A作为含量测定的指标性成分，这一部分工作我们正在进一步研究。3.7本实验研究结果表明：6种市售不同品牌国产血竭单就其龙血素B含量而言，均未达到部颁标准所规定的0.4%的标准，究其原因，当初确定限量时可能已把龙血素A混为龙血素B一起定量所造成的这一结果。我们认为这一问题应该引起重视，建议药典会尽快考虑对“龙血竭”质量标准进行再研究后做相应的修改。3.8从龙血素A和龙血素B含量相关性分析可以看出，龙血素A和龙血素B的含量具有很好的相关性，相关系数可以达到0.9以上，具有良好的统计学意义。为此，我们提出在一般的质量控制时，可测龙血素A的含量来替代龙血素B的含量，来相对反映和控制国产血竭的质量情况。参考文献：1 国家药品监督管理局国家标准WS3-082 (Z-016)-99(Z)2 黄捷、高辉、谢培德等 反相高效液相色谱法测定广西血竭中龙血素B的含量。药物分析杂志，1996 .16（4）:234236DETERMINATION OF LOUREIRIN A AND LOUREIRIN B IN RESINA DRACONIS BY RP-HPLC AND CORRELATION ANALYSISSun Shengli Mi HemingSchool of Pharmacy, Second Military Medical University(Shanghai, 200433)ABSTRACT Aims: A HPLC method of the quantitative determination of Loureirin A and Loureirin B in different brands of Resina Draconis has been developed. Correlation analysis of Loureirin A and Loureirin B has been adopted. Methods: A HPLC method has been developed. A UV detector wavelength is set at 270nm. The mobile phase is acetonitrile-acetic acid solution (40:60). Results: A good linear correlation is found in the range of 4 to 24g/ml of loureirin A. The regression equation obtained is Y=855.8+8037.1X（r=0.9999）; A good linear correlation is found in the range of 20 to 120g/ml of loureirin B. The regression equation obtained is Y=219.3+8081.8X（r=0.9999）. Conclusions: The quantity of loureirin B in six kinds of brands i