组蛋白质立体结构的测定.ppt

第一組 蛋白質立體結構的測定 NMR X-Ray CD NMR (nuclear magnetic resonance ) 核磁共振 前言 簡介 約15,000 種蛋白質的三維結構已被解出 ，80%是用X-ray 解出，20%用NMR 解出 NMR 解出三維結構時不需要長單晶 (single crystal)，只要溶在水溶液當中即 可，比較符合生物巨分子的生理狀態。 NMR產生訊號的原理 1. C、N、H、S等atoms的同位素label l 不等於0 始可產生NMR訊號 補充 每個元素中的核子(nucleus) ，其磁自旋量子數 (magnetic spin quantum number)以I 來代表。 若 I 0 ，此核子在磁場中，會產生NMR 訊號 若 I = 0，此核子在磁場中，無法產生NMR 訊號。 質量數和質子數均為偶數的原子核，l=0 質量數為奇數的原子核，l=半整數 質量數為偶數，質子數為奇數的原子核，l=整數 核磁共振儀的射頻器(transmitter)打了一 個脈衝(pulse)，將此淨磁化量偏移z 軸， 此偏移的磁化量就沿著磁場方向(z 軸)做 進動(precession)。造成此磁化量形成陀 螺的軌跡，如下頁圖所示。此磁化量的軌 跡，會引導一個振盪電流而被記錄下來。 2 .從NMR的peak area 和高度比可知 特定原子的數量和原子鍵結的環境。 NMR的光譜分析 一維：H太多 訊號複雜 難以分析 二維：NOE效應 可得知原子間的距離 三維：NOE效應+TOCSY技術+NOESY技術 旋性、凡得瓦半徑、鍵角 輸入computer run出可能的三度結構 補充NOE 效應 (Nuclear Overhouser Effect) NMR 之所以能解出蛋白質分子在水溶液 的三維結構，主要的就是要靠NOE 效應 。 NOE(I I0) / I0 I 為質子對被照射時的intensity I0 為質子對未被照射時的intensity 如果NOE愈強，表示二質子間距離愈短。 NOE 的大小與質子對之間距()的6 次方 成反比：NOE 1 / 6 NMR的研究領域 一、蛋白質與分子之結合 (Interaction) 利用核磁共振技術我們可輕易地藉由 測量化學位移擾動(chemicalshift perturbation)的方式找出protein與 ligand 作用的殘基，亦可進一步解出整 個complex 的結構。化學位移的擾動 主要是因為protein與ligand 結合後某 些殘基會和ligand 接觸或作用，而使得 化學環境改變，藉由測量各個殘基化 學位移的變化情形，便能找出ligand 的 結合位置(活性位置)。 二、蛋白質分子之折疊 (Protein Folding) 自然界中所存在的折疊構形約只有1,000- 5,000 種。 且有許多蛋白質屬於同一個family，具有高 度的sequence homology。 定出這1,000-5,000 種蛋白質的折疊構形並 研究這些構形所具有的生化活性，便能提供 其他屬於同family 的蛋白質在結構與功能上 的資訊。 優缺比較 X-ray 繞射技術 快速且較不受分子量的限制 但是並不是每一種蛋白質都能得到良好 的結晶，(蛋白質結晶的取得仍是現今結 晶技術的一大挑戰) 核磁共振 找尋蛋白質結構較耗費人力及時間 圖譜分析的工作是既複雜又費時 X-Ray Crystallography l 原理:所謂 X-Ray繞射結晶法即是利用X-Ray射 向蛋白質晶體使X-ray 產生繞射，經由繞射使 照相底片曝光而產生一投影圖形，再將此繞射 圖案作分析，作出電子密度圖，經過一連串的 計算之後，即可判定出蛋白質的立體結構! l Why要使用X-Ray ? 我們採用X 光來決定蛋白質的結構，最大 的理由，即是因為X 光的波長10-12-10-8m 恰 好近似於蛋白質晶體的晶格大小，因而可以產 生繞射，且由於X 光無法聚焦，因此我們必須 使用底片曝光法來分析繞射所得的結果。 l X 光依形成的方式不同，分成兩種： (1)White radiation: 以經高壓加速之電子撞擊陽極靶 標，高速電子受到靶標原子的阻擋，急遽停止下來，其 部分動能即以X 光的形式釋出來。以急遽停止電子所產 生之X 光與原子之特性無關，而是以連續性不同波長同 時出現，其中最短波長取決於撞擊電子的最高能量。如 此產生的光譜，亦稱為白光光譜或連續光譜 (Continuous X-ray spectrum)。 (2)Monochromatic radiation: 高速電子在撞到原子時 ，很容易將能量傳遞給原子中的電子，而使原子離子化 。當原子內層軌域之電子被激發後，其空出之位置很快 會被外層電子的躍入填滿，在此電子躍遷過程中，由於 不同軌域間的能階差，X 光會隨著放出；此種過程所產 生的X 光與原子中電子軌域之能階有關，因此其波長與 原子種類有關，稱之為特性輻射，所形成之光譜則稱為 特性光譜(characteristic spectrum)。 蛋白質結晶製備! X 光繞射結晶法當中很重要的一個條件就是 sample 的製備，若是不可結晶，則鐵定不能進 行X 光繞射。蛋白質要結晶，首先必須要先大 量製備我們所要結晶的蛋白質，因此會裡用載 體將記載蛋白質序列的核酸輸入到生產蛋白質 的菌體中，如此便可大量製造出純度高的蛋白 質，而後氣相擴散法將此蛋白質結晶出來。 結晶方式:用氣相擴散法結晶(Vapor Diffusion Method)，也就是將含有高濃度的蛋白質溶液加 入適當的溶劑，慢慢降低蛋白質的溶解度，使 其接近自發性的沉澱狀態時，蛋白質分子將在 整齊的堆疊下形成晶體。 NMR 與 X-Ray的比較 X-ray 的缺點主要是結晶難結，也並非所有蛋白質都容 易結晶。一旦結晶了，又要擔心他跟平時會否有異，譬 如某些水溶性的蛋白質，原本水分子能協助固定有功能 的構型，將其結晶後，離開了水的環境，失去固定而變 成另一種沒有功能的構型。相對的，NMR 的原理不同， 並不需要整齊的晶體排列，而是看原子核的磁力矩。 NMR 不需要結晶，也就避開了許多X-ray 繞射的缺點； NMR 可以看到生物分子在正常生理狀態下的構型，可以 觀察到連續的動態結構，比較不會受到水分子的干擾。 有一點值得注意的是，NMR 用低能量的無線電波，而X- ray 繞射要用高能量的X-ray，能量差距相當的大。雖 然NMR 看似比X-ray 繞射有更多的好處，但NMR 有一個 嚴重的缺點：只能觀察20000 原子量以內的分子。因為 NMR 是觀察一個一個的原子，X-ray 繞射則是觀察一個 一個的晶格；NMR 的視野被侷限在原子大小，但是X- ray 可大可小，他能觀察金屬原子的晶體，也能觀察生 物巨分子的晶體。我們不能直接判斷NMR 跟X-ray 繞射 孰優孰劣，兩者是互補的關係。 水的影響 蛋白質結晶中常含4060%的水，其液態的 成分會使晶體易碎，且容易使蛋白質分子 在排列上有不規則的情形出現，造成繞射 數據的混亂。但是，若是完全除水的晶體 ，蛋白質的狀態又與自然環境下不同，因 此水是個很令人頭痛的問題。 Circular Dichrosim(CD) 圓二色光譜 Polariz er E vectors 平面偏振光 振動方向保持不變 振幅發生周期性變化 平面偏振光 兩束相互垂直而相位相差1/4的波長的 平面偏振光可以加和成一束圓偏振光 平面偏振光疊加成圓偏振光 振幅保持不變，而方向周期變化， 電場向量繞傳播方向螺旋前進 圓偏振光 (circular polarized light) 朝光源看， 電場向量方向按順時針方向旋轉的，稱為右圓偏振光； 電場向量方向按逆時針方向旋轉的，稱為左圓偏振光。 圓二色性(circular dichrosim) 光學活性分子對左、右圓偏振光的吸收也不同， 使左、右圓偏振光透過後變成橢圓偏振光， 這種現象稱為圓二色性。 CD的操作方法 左圓、右圓的平面偏振光照射有光學 異構的分子，會造成不一樣的吸光度 。而不同的結構有獨特的測出來的吸 收圖形，因此可以經由比對得知立體 結構 CD對蛋白質二級結構的研究 方法:將待測蛋白質溶於適當溶劑中，用特 定波長的UV測其吸收度，與已知的二級結構 的吸收度圖比對，即可查出未知之結構 建立資料庫:選取基本的二級結構，將各波 長不同的CD吸收值代入程式可得蛋