酶工程 2.ppt

退出 Enzyme Engineering 酶工程 退出 第二章 酶学与酶工程 n第一节 酶的分类、组成、结构特点和作用机制 n第二节 酶作为催化剂的显著特点 n第三节 酶抑制作用的概念和分类 n第四节 可逆抑制作用 n第五节 不可逆抑制作用 n第六节 酶抑制剂的应用 退出 第一节 酶的分类、组成、结构特点和作 用机制 n一酶的分类： n二酶的组成和结构特点 n三酶的作用机制 退出 一酶的分类： n1氧化还原酶 n2转移酶 n3水解酶 n4裂合酶 n5异构酶 n6连接酶（合成酶） n7核酸酶（催化核酸） 退出 1氧化还原酶 (Oxidoreductase) n包括脱氢酶(Dehydrogenase) 、氧化酶 (Oxidase) 、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素 氧化酶等 退出 2转移酶(Transferase) n包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、 含氮基转移酶等 退出 3水解酶(Hydrolase) n脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需辅 酶 退出 4裂合酶(Lyase) n这类酶可脱去底物上某一基团留下双键，或可相 反地在双键处加入某一基团。 退出 5异构酶(Isomerase) n此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子 异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反 异构等 退出 6连接酶（合成酶）(Ligase or Synthetase) n这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸 腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅 助因子。分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、C-S键 （与脂肪酸合成有关）、C-C键和磷酸酯键。 退出 7.核酸酶（催化核酸） Ribozyme n核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够 催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。 退出 酶用于生物催化的概况 类别占总酶比例%利用率% 水解酶 hydrolases 2665 氧化还原酶 oxidoreductases 2725 转移酶 transferases 245 裂合酶 lyases 125 异构酶 isomerases 51 连接酶 ligases 61 退出 二酶的组成和结构特点 n1 单体酶 n2 寡聚酶 n3 多酶复合体 退出 3 多酶复合体的组成部分 n辅因子：酶蛋白中非蛋白质部分，它可以是 无机离子也可以是有机化合物。 n辅酶：有机辅因子与酶蛋白结合松散即为辅 酶。 n辅基：有机辅因子与酶蛋白结合紧密即为辅 基。 退出 三酶的作用机制 n1 酶的作用过程 n2 酶与底物的结合模型 n3 酶的催化作用 退出 1 酶的作用过程 n酶的活性部位： n是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个 酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽中可能相隔很 远的氨基酸残基形成的三维实体。 退出 2 酶与底物的结合模型 na 锁和钥匙模型 nb 诱导锲合模型 退出 a 锁和钥匙模型 退出 b 诱导锲合模型 退出 3 酶的催化作用 n（1） 研究方法 n（2）影响酶的催化作用 退出 （1） 研究方法 na.从非酶系统模式获得催化作用规律 nb.从酶的结构与功能研究中得到催化作用机理 的证据。 退出 （2）影响酶的催化作用 na. 广义的酸碱催化 nb. 共价催化 nc. 邻近效应及定向效应 nd. 变形或张力 ne. 酶的活性中心为疏水区域 退出 a. 广义的酸碱催化 n能供给质子的物质即为酸，能接受质子的物 质即为碱 n例 HA=A-+H+ HA为酸，A-为碱 n例 HA（酸）+A=AXH（酸催化） nAXH+B-（碱）=Y+BH+A-（碱催化） 退出 b. 共价催化 n底物与酶以共价方式形成中间物。这种中间 物可以很快转变为活化能大为降低的转变态 ，从而提高催化反应速度 退出 b. 共价催化 n亲电试剂：一种试剂具有强烈亲和电子 的原子中心。 n亲核试剂：就是一种试剂具有强烈供给 电子的原子中心。 退出 c. 邻近效应及定向效应 n所谓邻近效应就是底物的反应基团与酶的催 化基团越靠近，其反应速度越快。 退出 d. 变形或张力 退出 e. 酶的活性中心为疏水区域 酶的活性中心为酶分子的凹穴 此处常为非极性或疏水性的氨基酸残基 退出 第一节结束 n酶的分类： n酶的组成和结构特点 n酶的作用机制 氧化还原酶 转移酶 水解酶 裂合酶 异构酶 连接酶 单体酶 寡聚酶 多酶复合体 酶的作用过程 酶与底物的结合模型 酶的催化作用 广义的酸碱催化 共价催化 邻近效应及定向效应 变形或张力 酶的活性中心为疏水区域 锁和钥匙模型 诱导锲合模型 退出 第一节结束 n点击返回 退出 第二节 酶作为催化剂的显著特点 n一 催化能力 n二 专一性 n三. 调节性 退出 一催化能力 催化转换数：每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。 一般为103min-1，碳酸酐酶最高为3.6* 107min-1 有酶加入比无酶参加反应速度一般要高107-1013 退出 二专一性 n1绝对专一： 只催化一种底物进行快速反应 ，甚至是立体专一性 n2 相对专一性：基团专一和键专一 退出 三. 调节性 n1. 酶浓度的调节 n2 激素调节 n3. 共价修饰调节 n4. 限制性蛋白水解作用与酶活力调控 n5. 抑制剂的调节 n6. 反馈调节 n7. 金属离子和其他小分子化合物的调节 退出 第二节结束 催化能力 专一性 调节性 酶作为催化剂的显著特点 绝对专一 相对专一 1. 酶浓度的调节 2 激素调节 3. 共价修饰调节 4. 限制性蛋白水解作用与酶活力调控 5. 抑制剂的调节 6. 反馈调节 7. 金属离子和其他小分子化合物的调节 退出 第二节结束 n点击返回 退出 第三节 酶抑制作用的概念和分类 n一 概念 n二 抑制程度的表示 n三 抑制作用的分类 n四 抑制作用的定义 退出 一 概念：能降低酶催化反应速度的因素 n1. 失活作用 n2. 抑制作用 n3. 去激活作用 n4. 阻遏作用 退出 1. 失活作用 n失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂 部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶 蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。 退出 2. 抑制作用 n抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于必 需基团或活性中心化学性质的改变而引起的 酶活性的降低或丧失。 退出 3. 去激活作用 n去激活作用，某些酶只有在金属离子存在下 才有活性，去除金属离子也会引起这些酶活 性的降低或丧失。 退出 4. 阻遏作用 n阻遏作用指某些因素（如激素或药物等）使 细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低 是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化 效力并无变化. 退出 二抑制程度的表示 一般用反应速度的变化来表示。若以不加抑制 剂时的反应速度为 Vo，加入抑制剂后的反应 速度为Vi，则酶的抑制程度有下列几种表示 方法： 退出 二抑制程度的表示 n1 相对活力分数（残余活力分数） a=Vi/Vo n2 相对活力百分数（残余活力百分数） a%=Vi/Vo*100% n3 抑制分数 指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1-Vi/Vo n4 抑制百分数 i%=(1-a)*100%=(1-Vi/Vo)*100% 通常所谓抑制率是指抑制分数或 抑制百分数。 退出 三. 抑制作用的分类 n不可逆抑制作用（非专一性不可逆抑制作用；专一性不 可逆抑制作用） n可逆抑制作用（竞争性抑制作用，非竞争性抑制作用， 反竞争性抑制作用，混合型抑制） 退出 四. 抑制作用的定义 n1 不可逆抑制作用 n2 可逆抑制作用 退出 1 不可逆抑制作用 n抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失 ，不能用透析，超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂 而使酶复活者，称为不可逆抑制作用。 退出 2 可逆抑制作用 n抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的 降低或丧失，能用物理的方 法除去抑制剂而 使酶复活者称为可逆抑制作用。 退出 五可逆抑制和不可逆抑制作用的鉴别 n除了根据上述透析，过滤等物理方法视其能否去除抑制 剂来区别不可逆抑制和可逆抑制作用外，还可以利用下 列两种动力学方法来加鉴别。 退出 退出 方法1 退出 方法2 退出 第三节结束 n一 概念 n二 抑制程度的表示 n三 抑制作用的分类 n四 抑制作用的动力学方法鉴别 1. 失活作用 2. 抑制作用 3. 去激活作用 4. 阻遏作用 1 不可逆抑制作用 2 可逆抑制作用 1 相对活力分数 2 相对活力百分数 3 抑制分数 4 抑制百分数 退出 第三节结束 n点击返回 退出 第二章 酶学与酶工程 n第一节 酶的分类、组成、结构特点和作用机制 n第二节 酶作为催化剂的显著特点 n第三节 酶抑制作用的概念和分类 n第四节 可逆抑制作用 n第五节 不可逆抑制作用 n第六节 酶抑制剂的应用 退出 第四节 可逆抑制作用 n一 竞争性抑制作用 n二 反竞争性抑制 n三 非竞争性 n三 其他可逆抑制 退出 一 竞争性抑制作用 n1.竞争性抑制作用的含义 n2. 竞争性抑制作用的机理 n3. 竞争性抑制作用举例 n4过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂 退出 1.竞争性抑制作用的含义 退出 2. 竞争性抑制作用的机理 n竞争性抑制的机理 1 抑制剂与底物在结构上有类似之处 n2 可能结合在底物所结合的位点（如结合基团）上，从而 阻断了底物和酶的结合 n3 降低酶和底物的亲和力。 退出 3. 竞争性抑制作用举例 n举例某些药物或体内代谢物对酶的竞争性抑制作用 药药物（抑制剂剂）被抑制的酶竞竞争底物临临床应应用及机理 磺胺药 二氢叶酸合成酶（细 菌） 苯甲酸 抗菌作用（抑制四氢 叶酸） 氨基蝶呤二氢叶酸还原酶二氢叶酸抗白血病 5-氟尿嘧啶（5-FU） 尿嘧啶核苷磷酸化酶 （胸腺嘧啶核苷 磷酸化酶） 尿嘧啶（胸腺嘧啶 ） 抗癌作用（抑制核苷 酸合成） 别嘌呤醇黄嘌呤氧化酶黄嘌呤，次黄嘌呤 抗通风（抑制尿酸生 成） 6-氨基已酸纤溶酶-赖氨酸-氨基酰 止血，抗纤溶（抑制 纤溶酶） 苯丙胺（麻黄素）单胺氧化酶 肾上腺素（去甲肾上 腺素） 中枢兴奋，抗哮喘 退出 4过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂 n所谓过渡态底物是指底物和酶结合成中间复 n合体后被活化的过渡形式，一般用S*表示， n由于其能障小，和酶结合就紧密得多。 退出 4过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂 退出 4过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂 退出 二. 反竞争性抑制 退出 2. 反竞争性抑制举例 n2举例： n单底物酶：如芳香基硫酸基的肼解 n 氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用 n多底物：如双底物乒乓机制中，任何一个底 物的竞争性抑制剂也是另一底物的反竞争性 抑制剂。 退出 三. 非竞争性抑制 nKi=Ki 退出 2. 非竞争性抑制举例 退出 四混合型抑制 退出 五 其他可逆抑制 n1 部分抑制 n2 底物抑制 n3 产物抑制 退出 1 部分抑制 n1 部分抑制：假如混合型抑制中ESI复合物 也能释放产物即为部分抑制。 退出 2 底物抑制 退出 3 产物抑制 n3 产物抑制：产物对酶反应的抑制作用在生 物体中较为常见，在细胞内，酶反应的产物 虽然不断被另外的酶作用，但S和P总是同时 存在的，因此，考虑产物对反应速度的影响 ，可能具有一定的意义。 退出 第四节结束 n竞争性抑制作 用 n反竞争性抑制 n非竞争性抑制 n混合型抑制 n其他可逆抑制 1竞争性抑制的含义 2竞争性抑制的机理 3竞争性抑制举例 4过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂 1概念 2举例 1 部分抑制 2 底物抑制 3 产物抑制 退出 第四节结束 n点击返回 退出 第五节 不可逆抑制作用 n不可逆作用可分为 n非专一性 n专一性 退出 一. 非专一性的不可逆抑制作用 n1 概念：抑制剂能和酶上的一类或几类基团 反应。 n2 类型：酰化剂、烃基化剂、含活泼双键 的试剂、 亲电试剂、 氧化剂、 还原剂 退出 二 专一性不可逆抑制剂 n专一性不可逆抑制剂的类型: n1 Ks型结合型不可逆抑制剂 n2 Kcat型催化型不可逆抑制剂（自杀 底物） 退出 1 Ks型结合型专一性不可逆抑制剂 n抑制剂只能专一地与某种酶结合而引起的不可逆抑 制作用 n举例： n1 对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮抑制胰凝乳蛋白酶 2 对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮抑制胰蛋白酶 n 退出 2 Kcat型催化型不可逆抑制剂（自杀 底物） n抑制剂能专一地与某种酶结合并发生催化反应，而反应 的产物中含有一个基团可以与酶分子活性中心的基团共 价结合，导致酶分子不可逆地丧失催化活性。 退出 Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物） n（1） 天然酶的自杀底物 n（2） 治疗用人工合成的酶自杀底物 退出 （1） 天然酶的自杀底物 Ackee(Blighia sapida) 植物未成熟果实的假种 皮中含有一种有毒的降糖氨酸（即甲叉环丙基丙氨 酸） 退出 （2） 治疗用人工合成的酶自杀底物 n治疗高血压；癫痫；抗青霉素的菌株；在肿 瘤治疗上；治疗震颠麻痹症；痛风症的自杀 底物疗法。 退出 第五节结束 n非专一性的不 可逆抑制作用 n专一性不可逆 抑制剂的类型 酰化剂 烃基化剂 含活泼双键的试剂 亲电试剂 氧化剂 还原剂 Ks型专一性不可逆抑制剂 Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物） 退出 第五节结束 n点击返回 退出 第六节 酶抑制剂的应用 n一 医学上的应用 n二 农业生产上的应用 n三 工业生产上应用 退出 一 医学上的应用 n1 青霉素类药物 n长期使用青霉素，细菌中产生-内酰胺酶，可水解青霉 素中的内酰胺环，使之成为不杀菌的青霉酸酰。（不能 形成D-丙氨酸-D-丙氨酸结构，丧失了杀菌能力） 退出 1 青霉素类药物 退出 1 青霉素类药物 n两者结构类似，故可竞争性地抑制转肽酶，导致胞壁合成障碍。 退出 传统化学法生产内酰胺抗生素路线 图 1.1 传统化学法生产内酰胺抗生素路线 Figure 1.1. An overview of the traditional, chemical synthesis of -lactam antibiotics 退出 酶法生产-内酰胺类抗生素路线图 图 1.2 酶法生产-内酰胺类抗生素路线图 Figure 1.2. The network of enzymatic modification of -lactam antibiotics PGA for penecillin G acylase; 6-APA for 6-aminopenicillinic acid; 7-ADCA for 7- aminodeacetoxi-cephalospornic acid; 7-ACA for 7-aminocephalospornic acid 退出 青霉素G酰化酶在大肠杆菌中的合成与后加工 图1.3 青霉素G酰化酶在大肠杆菌中的合成与后加工 Fig. 1.3 Synthesis and maturation of penicillin G acylase in E. coli.：The pac gene from E. coli encodes a polypeptide precursor (preproPAC) which is composed of, in the direction of N-terminus to C-terminus, a signal peptide (S), subunit (), connecting peptide (C), and subunit (). 退出 青霉素酰化酶的三维结构图 图 1.4 青霉素酰化酶的三维结构图 Figure 1.4. The three-dimensional structure of penicillin acylase MOLSCRIPT representation of the heterodimer. The A chain is shown in red wrapped aroud the B chain (blue)。 （Duggleby, H.J. Nature, 1995, (373):264-268）. 退出 青霉素酰化酶的结构 n不同来源的青霉素酰化酶都有，两个亚基组成，亚基 的分子量在24k左右，亚基的分子量在65k左右。 nE. coli来源的PGA结构基因全长2538个核苷酸，编码846 个氨基酸组成的前体蛋白，包括26个氨基酸组成的信号 肽，209个氨基酸组成的亚基，54个氨基酸组成的连接 肽和557个氨基酸组成的亚基。 退出 青霉素酰化酶的催化活性中心 n采用多底物竞争性抑制 n用X晶体衍射测定了复合物（青霉素酰化酶和底物苯乙酸，3，4二羟 基苯乙酸，2，5二羟基苯乙酸，p硝基苯乙酸)的三维结构， n这些复合物揭示了底物结合区域构象的变化可能作为酶自催化的开 关。显示了催化中心中的Asn B241的作用。PGA活性高度依赖于 Asn B241，在催化中心里，B241 Asn导致形成阳离子的洞，包括底 物与Ser B1。Arg A263参与了与底物的结合并协助Asn B241的定位 。Phe 146是底物进入活性中心的开关，所以准确地说，青霉素酰化 酶的催化活性中心是Ser-Asn二联体。 退出 青霉素酰化酶催化机制 图 1.6 青霉素酰化酶催化水解青霉素G机理示意图 Figure 1.6 The mechanics of hydrolysis of penicillin G by penicillin acylase The carbon