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外源基因在真核 细胞中的表达 Expression In Eukaryotic Host Cells DNA RNA protein Biological activity Gene copy number Promoter activity mRNA stability Ribosome binding site Codon usage Protein stability Many host-dependent factors 人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德 国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。 在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有 生物活性的蛋白质胰岛素。 随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各 种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之 有效。 而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核 表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工 业化生产等优点。业化生产等优点。 原核表达系统： 大肠杆菌表达系统、枯草杆菌表达系统 优势：高产量，操作简便 缺陷：较多哺乳动物蛋白基因很难在此系统表达 产生有功能的蛋白 原因蛋白表达后的正确折叠和修饰 真核表达系统： 酵母表达系统 yeast expression system- Pichia pastoris 昆虫表达系统 Insect expression system-Baculoviruses 哺乳动物细胞表达系统 Mammalian expression system 外源基因在真核表达系统中表达的3环节： 载体的构建； 构建的载体DNA在真核细胞中的导入； 表达产物的鉴定 真核表达载体至少要含两类序列： 原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起 始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等 ，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌 系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足 够使用的数量。 在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括 启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、 mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序 列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源 基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。 第一节外源基因在毕赤酵母中的表达 酵母是目前最常用的表达系统之一。 优点：成长快，易培养，成本低，遗传操作方便，能进 行翻译后加工和修饰 巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）用于基因工程表达外源 蛋白的优点：发酵密度高；外源基因表达量高； 可以建立有效的分泌型表达；（分泌型表达？） 减轻宿主的代谢压力，减少受蛋白酶降解 的危险，方便产物的纯化，也利于二硫键 的正确折叠。 影响外源基因在巴氏毕毕赤酵母中表达的因素 1、外源基因特性 外源基因在（巴氏毕赤酵母）Pp中表达时，其自身就 是影响表达水平的重要因素。 不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过 提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的 产量。 Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷拷 贝数贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。另外，许多高 A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录;不合适 的mRNA 5非翻译区的核苷酸序列和长度也可能会使基因 的表达不尽人意。 提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象， 譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表 达良好。因此，可以通过调整高A+T含量区的核苷酸组 成来避免提前终止的发生。而Sreekrishna等通过调整 人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5 非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的 5非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上 。 限于目前对Pp的了解程度，仍然无法预见某种外 源蛋白是否能在其中获得高产。 2、表达框的染色体整合位点和方式 虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转 化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载 体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细 胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制 整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得 多拷贝。 3、基因剂量 许多实例表明，含单拷贝表达框的宿主菌足以得 到最佳产量，而在大多数情况下，随着拷贝数的增加 表达产物量也会相应增加。Jeffrey等发现，重组 CD40L的最高产量是在含有8个以上表达框的菌株中获 得的。Clare等的实验结果也表明，重组鼠表皮生长因 子(mECF)在Pp中的表达量与其基因量成正相关，而高 拷贝、高表达量的宿主菌株可以通过一种快速DNA斑点 杂交的筛选方式获得。不过个别情况下拷贝数增加对 产量也会产生负效应，似乎表明分泌效率低的蛋白在 过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制。 因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的。 高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准 Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法，首先将 菌落转在醋酸纤维素膜上，再与硝酸纤维素膜叠放 在酵母固体培养基上，经过一段时间的培养，分泌 蛋白就印在硝酸纤维素膜上。再用此蛋白的抗体检 测，即可挑出最高蛋白量对应的克隆。用这种方法 ，每套滤膜可筛选100-1000个克隆，从而快速地从 大量重组菌株中筛选出高表达克隆，并从每升发酵 上清液中获得了255mg的重组cD40L。 4、分泌信号 对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌 方式生产是非常困难甚至是不可能的。但为了下游工 程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌 表达的方式。 有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了。如 果不能利用自身信号肽，那么酿酒酵母转换酶或a配对 因子(MFa1)的前导序列可以非常有效地引导体积稍小 的产物出胞。一般情况下，应用酵母特有的分泌信号 表达外源基因获得成功的可能性大。 但酵母表达基因工程产物的另一问题是信号肽 加工不完全，其表达的外源基因产物常比设计 的多几个氨基酸。这可能是酵母细胞自身调节 机制对外源基因高表达的应答表现。 Singh等通过定向缺失诱变MFa1和干扰素基因 连接处寡核甘酸导致了含有天然N端的成熟干 扰素的正确释放，可以成为解决这一问题的一 种好方法。 5.产物稳定性 酵母细胞膜上有一种KEX-2样蛋白水解酶，能专一性 水解a因子前体中羧基端的肽键，即连续两个碱性氨基酸( 如LySArg，LysLys，ArgArg)，酵母基因工程表达产物发 生降解现象的原因就在于此。 改变培养基的PH值、加入适量的酵母提取物和蛋白胨 或酪蛋白水解物，都能够提高外源蛋白的稳定性，而某些 酶抑制剂如EDTA，虽然也能增加其稳定性，但却常会使一 些原先并不明显的蛋白变得非常明显，影响其使用效果。 另外，使用蛋白酶缺陷株如SMD1163、SMD1165或 SMD1168亦可避免产物降解的发生。虽然并不是每一种 外源蛋白都会受内源性蛋白酶的影响，但在未知其有 无降解可能的情况下可以考虑使用此种宿主菌。 在另外一种情况下，如果基因工程产物会影响宿 主菌生长代谢活性的话，也可能出现高度降解的情况 。如重组人基质金属蛋白酶3(MMP-3)被认为有促使哺 乳动物上皮细胞凋亡的作用。它在Pp中高度降解，仅 当与其组织抑制物TIMP-1共表达时才能保持稳定。这 也提醒我们外源基因本身对产物稳定性的影响同样重 要。 6.翻译后修饰 一般情况下Pp能产生较酿酒酵母明显要短的高甘 露糖型寡糖链，且较均一，长度在814个之间，使产 物更加稳定，而这正是Pp表达外源蛋白的一个优势。 虽然糖基化对某些外源蛋白的活性没有太大影响，它 却可能在蛋白折叠和抗蛋白酶降解中起重要作用。然 而，糖基化也有其不利的一面。例如人红细胞生成素 受体的胞外配体结合区(EPObp)因糖基化程度不同而呈 两种状态(30X103和60X103);人组织因子则在SDS-PAGE 上以从37X103到45X103的3个条带存在。 另外，聚合体的存在也会成为产物不均一的原因，这 些都给基因工程产物的纯化和工业化生产带来一定困 难。 从药物应用的观点来看，不合适的糖基化和寡聚体可 能会在机体内产生免疫反应或毒副作用，并且会明显 影响纯化过程中产率的提高，因此，选用一种能够获 得单体均一形式的基因工程产物十分重要。这方面的 研究仍有待探索。 作为一种正在发展中的表达异源蛋白的宿主体，Pp酵 母菌兼有原核细胞的分子遗传操作和生长特性及真核 生物的翻译后修饰机制的长处。 虽然目前存在的诸多困难使得仍有许多蛋白难以在这 个系统中成功表达，但随着对它的利用和探索的不断 深入必将不断给我们增添新的见解，使巴氏毕赤酵母 系统不断完善。 重组（毕赤酵母）人干扰素1b 滴眼液、喷雾剂 干扰素具有广泛的生理作用，主要包括：抗病毒、抗肿瘤 、免疫调节、免疫佐剂、诱导细胞凋亡等，其中干扰素所 具有的广谱抗病毒作用已经得到国际医药界高度重视。 上海某公司称其研制的重组（毕赤酵母）人干扰素1b滴眼 液，在较低浓度（10%）时，体外药效学试验显示有抗 SARS病毒，保护被感染细胞的活性作用。 国内外上市的干扰素大多是通过大肠杆菌表达生产的，尚 无使用毕赤酵母表达体系进行重组干扰素1b上市，采用毕 赤酵母分泌表达， 具有工艺简单，纯化方便、产量高、产 品稳定等优点 第二节杆状病毒和昆虫细胞表达系统 昆虫杆状病毒（基因工程载体） Baculoviruses是对昆虫具有专一性的杆状病毒，对于其 他种类的細胞不具感染性。 它是一种长杆状的病毒，长 約200-400nm，宽約40-50nm，DS-DNA長度在80- 200kbp。 当病毒成熟時，在病毒鞘外会包裹一层 polyhedrin多角型蛋白， 包裹完整的baculovirus形成 Occlusion Body (OB封闭体)， 可以保护病毒抗UV与抗 旱。 已有些地区利用baculoviruses作为生物杀虫剂。 当細胞被病毒感染后，30 min后出現RNA，16-20 h后大量放出未包裹的病毒， 约在24 h后病毒进 行包裹，在60-72 h后細胞開始瓦解。下图的细胞 已是受感染80 h后的状态，在显微镜下可以观察 到盐粒状的多角体病毒。 左图是一只正常的菜虫幼虫，经过喂食OB后 ，于四至五天后造成虫体的死亡， 右图則为baculovirus造成虫体的细胞瓦解。 昆虫细胞和杆状病毒提供了已经被证明的 高水平表达哺乳动物全长蛋白的方法。 在昆虫细胞中很多翻译后修饰类 似于哺 乳动物细胞，而那些在大肠杆菌中不能 成功表达的蛋白也可以在昆虫细胞利用 杆状病毒系统进 行表达。 BES（杆状病毒表达系统统）具备备以下优优点： 具有真核细胞的翻译后修饰功能； 正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和 功能上更接近天然蛋白； 高表达量，最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%； 可表达非常大的外源性基因（200kD）； 具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个基因的能 力； 对脊椎动物是安全的。 昆虫表达系统的优点： 外源基因表达产量高，并多有和哺乳动物 细胞相似的翻译后修饰功能； 昆虫细胞培养条件简单； 生物安全性高。 第三节 哺乳动物细胞表达系统 一、影响外源基因在哺乳动物细胞中转录和翻译的序列 因素 Promoter，enhancer, RNA splicing site, intron, 5UTR,start codon, 3UTR 二、哺乳动物细胞的表达载体 病毒性载体：去掉部分病毒复制和包装所需的结构蛋白 基因，但保留包装识别序列和复制序列。为保证安全 性：病毒载体为自身复制缺陷型。 腺病毒载体、牛痘痘苗病毒载体、单纯性疱疹病毒载体 优点：效率高 缺点：操作复杂 非病毒哺乳动物表达载体: 质粒（pCDNA3等） 三、筛选标志基因 很少通过细胞的形态来鉴定和筛选被转染的 细胞，利用筛选标志基因的表达产物赋予细胞 的特性而区分细胞。 四、外源基因在哺乳动物细胞中的表达方 式 瞬时转染：外源基因导入到哺乳动物细胞 后14天，就可以检测到基因的表达情况。表 达完全由导入的质粒来执行，绝大多数质粒没 有整合到染色体上而被降解或随细胞分裂而丢 失。 永久转染：导入的基因整合到细胞的染色 体DNA中。 五、外源DNA导入哺乳动物细胞的方法 病毒感染：借用病毒的感染方式，将外源基因事 先插入到病毒的基因组中，并用适当的方式包 装成有感染活性的重组病毒颗粒，用于感染细 胞，从而将外源病毒导入到相应的细胞中。 常用：逆转录病毒，腺病毒；疱疹病毒等。 优点：效率高 缺点：重组病毒建立有一定难度；安全性；抗体 影响； 转染：外源核酸导入到细胞中的非病毒方法，通 常称为转染。分化学方法和物理方法。 理想的转染方法：操作简单、高效、低毒、对细 胞正常生理状况影响小、重复性好、成本低。 磷酸钙共沉淀法 DEAE-葡聚糖法 阳离子脂质体转染 显微注射法 电转移 基因枪 Transfection of D