LAMP技术对猪呼吸道主要病原诊断.pptx

LAMP技术对术对 猪呼吸道主要病原诊诊 断的建立与应应用 学院：动动物科技学院 年级级：2009级级 姓名：夏伟伟 研究意义 猪支原体性肺炎是由猪肺炎支原体引起的一 种慢性肺炎，还还称作猪地方流行性肺炎，Mare 、Switzer和Goodwin等在1965年分别别从患 肺炎猪的肺组织组织 中分离出其病原，经过试验经过试验 后 成功复制了本病，将此病原被命名为为 M.hyopneumoniae。到目前为为止，猪支原体 性肺炎都被养猪业业人士看做是重要疫病之一，它 可能会造成重大经济损经济损 失，发发生频频次较较高，而 且该该病流行最广，是最难预难预 防的。本病虽虽然发发 现现的很早，但是近年来还还是由于经经常发发生，发发 生的方式是与PRRS、圆环圆环 病毒等其它病原引起 猪的混合感染，并且对对养猪业业造成重大的经济经济 损损失。 研究意义义 猪传传染性胸膜肺炎是一种接触性呼吸道传传染病 ，是感染猪胸膜肺炎放线线杆菌而引起的。主要的临临 床特征包括急性出血性纤维纤维 素性胸膜肺炎和慢性纤纤 维维素性坏死性胸膜肺炎。猪胸膜肺炎放线线杆菌 Actinobacilluspleuropneumoniae(App) 的血清型现现在大概有12种，其中有一些毒力较较弱且 不具有致病性，其他一些则则会引起严严重的疾病。检检 测测后毒力很强的是1、5、9、11和12型，而毒力 温和的是3、6型。胸膜肺炎放线线杆菌寄生在上呼吸 道和扁桃体。病原的传传播途径主要是通过飞过飞 沫或气 雾雾在短距离内传传播，胸膜肺炎放线线杆菌在体外只能 存活几天。 研究意义义 猪巴氏杆菌病（swine pasteurellosis ）又被称作猪肺疫、猪出血性败败血症，俗称为为“ 锁锁喉风风”，是一种因感染多杀杀性巴氏杆菌而引起 的传传染病，败败血症为该为该 病急性型的主要特征， 临临床症状包括咽喉部出现现急性肿胀肿胀 ，病猪呼吸困 难难；急性型的主要临临床特征是出现纤维现纤维 素性胸 膜肺炎；而慢性型的临临床症状并不明显显，一般表 现为现为 慢性肺炎、关节节炎和胃肠肠炎等，而且病猪逐 渐渐消瘦，国内的猪群主要是散发发性的感染。近些 年来，我国集约约化养猪业发业发 展迅速，进进而猪群感 染巴氏杆菌的报报道也逐渐渐增多。 研究意义义 在黑龙龙江地区的规规模化养猪场场，疾病控制一 直是十分棘手的问题问题 ，特别别是猪的呼吸系统统疾病 呈蔓延扩扩大态势态势 ，发发病率较较高，死亡率在5% 15%或以上，猪的各个日龄阶龄阶 段均存在呼吸 道疾病的危害。呼吸系统统疾病除直接造成死亡损损 失外，还还因饲饲料报报酬大大降低，继发继发 感染等而 造成治疗费疗费 用升高，给给集约约化猪场场和养猪户户造 成严严重的经济经济 损损失。把LAMP技术术运用对对猪病 进进行早期快速诊诊断和流行病学调查调查 意义义重大。 同时对规时对规 模化猪场场的发发病情况进进行流行病学调调 查查，根据黑龙龙江省规规模化猪场实际场实际 制定有效的 综综合防病措施，减少因呼吸道疾病给给猪场带场带 来的 损损失。 研究内容 猪呼吸道疾病的流行病学调查调查 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建立 LAMP方法的现场应现场应 用及综综合防治措施的制定 猪呼吸道疾病的流行病学调查调查 采集的病例主要来自黑龙龙江省不同地区的 18个猪场场，每个猪场场采取了不同的病料数，并 且了解记录记录 了猪场场内猪只的发发病情况。 猪呼吸道疾病的流行病学调查调查 采用血清学和PCR分子生物学检测检测 方法检测检测 病原菌 猪呼吸道疾病流行病学调查调查 黑龙江省各地区猪场猪呼吸道疾病流行病学调查柱状图 猪呼吸道疾病流行病学调查调查 经过统计经过统计 ，在黑龙龙江地区的养猪场场，90的猪场场都有猪的呼 吸道综综合症的发发生，在黑龙龙江屠宰场时场时 有发现发现 有肺炎病变变的猪肺。 猪场场爆发发猪呼吸道综综合症后很难难清除，它除了造成直接死亡之外， 更为严为严 重的是使猪增重缓缓慢，饲饲料利用率减少，出栏时间栏时间 推迟迟，并 长长期携带带多种相关病原体。有些猪场场PRDC的发发病率可达40%- 80%，直接死亡率在20%以上，增重下降或生长长停滞的可达 70%，有的猪场场甚至被迫将该阶该阶 段的猪全部淘汰。很多呼吸道综综 合症的病原体所引发发的临临床症状极为为相似，很难难通过临过临 床症状做出 正确的诊诊断。有些疾病（如猪蓝蓝耳病）已经经不能表现现出其临临床的特 异性症状，有些病原体还还有相当长长的潜伏期。因此更加难难以做出准 确的诊诊断。血清学诊诊断虽虽然能在一定程度上做出确诊诊，但时间较长时间较长 ，难难以满满足现场现场 需要。因此，研究出能够够同时对时对 多种病原进进行诊诊断 的方法势势在必行。同时对规时对规 模化猪场场的发发病情况进进行流行病学调查调查 ，根据黑龙龙江省规规模化猪场实际场实际 制定有效的综综合防病措施，减少因 呼吸道疾病给给猪场带场带 来的损损失。 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建立 引物设计与合成 猪支原体、猪胸膜肺炎放线线杆菌、 猪巴氏杆菌基因组组的提取 LAMP 诊诊断方法反应应条件的优优化 实验方法 PCR扩增及鉴定 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建立 重组质组质 粒的鉴鉴定结结果 pMD18-T-Mh载体PCR鉴定结果 1-2：扩增Mh基因；3-4：扩增App基因；5：扩增Sp基因；6：阳性对照；7：阴性对照 1-5: The PCR identification result of the pMD18-T-Mh、pMD18-T-App、pMD18-T-Sp plasmid6: The positive control; 7: The negative control M 1 2 3 4 5 6 7 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建立 LAMP 检测检测 方法反应应条件的优优化 猪肺炎支原体内外引物的优优化 外引物不同浓度下电泳结果 1-4的浓度：0.1 pmol/L、0.15 pmol/L、0.2 pmol/L、0.25 pmol/L； 5：阳性对照6：阴性对照 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 内引物不同浓度下电泳结果 1-4的浓度：0.4 pmol/L、0.5 pmol/L、0.6 pmol/L、0.7 pmol/L； 5：阳性对照6：阴性对照 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建立 猪放线线杆菌内外引物的优优化 外引物不同浓度下电泳结果 1-5的浓度：0.1 pmol/L、0.15 pmol/L、0.2 pmol/L、0.25 pmol/L； 5：0.3 pmol/L；6：阳性对照 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M 1 2 3 4 5 6 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M 1 2 3 4 5 内引物不同浓度下电泳结果 1-4的浓度：0.4 pmol/L、0.5 pmol/L、0.6 pmol/L、0.7 pmol/L ； 5：阳性对照 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建 立 猪巴氏杆菌内外引物的优化 外引物不同浓度下电泳结果 1-4的浓度：0.1 pmol/L、0.15 pmol/L、0.2 pmol/L、0.25 pmol/L； 5：阴性对照 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M 1 2 3 4 5 内引物不同浓度下电泳结果 1-3的浓度：0.4 pmol/L、0.5 pmol/L、0.6 pmol/L； 4：阴性对照 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M 1 2 3 4 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建立 dNTP+浓度的浓度的优化 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M 1 2 3 4 5 6 7 dNTP+不同浓度下电泳结果 1-4 的浓度：0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L； 5：阳性对照；6-7：阴性对照 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建立 Bst DNA 聚合酶用量的优优化 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M 1 2 3 4 5 6 7 M 不同Bst DNA聚合酶下电泳结果 1-5的体积：3 U、4.8 U、6.4 U、8 U、9.6 U；6：阳性对照；7：阴性对照 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建立 MgSO4 浓浓度的优优化 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp MgSO4不同浓度下电泳结果 1-5的浓度：2.5 mmol/L、3.75 mmol/L、5 mmol/L、6.25 mmol/L、7.5 mmol/L; 2.10：阳性对照；7：阴性对照 M 1 2 3 4 5 6 7 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建 立 优优化后建立 LAMP 检测检测 方法 组成体系（L） 外引物（支F3、支R3）（10 pmol/L） 内引物（支F1/F2、支R1/R2）（10 pmol/L） dNTP（10 mmol/L） MgSO4（25 mmol/L） 10LAMP反应缓冲液 Bst DNA 聚合酶（8 U/L） 模板DNA ddH2O 合计 0.4 1.0 1.0 3.0 2.0 1.0 1.0 10.6 20.0 LAMP 扩扩增反应应体系 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建 立 猪支原体肺炎特异性检测检测 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 特异性检验电泳结果 1：阳性对照；2：支原体肺炎；3-8：多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、 肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌；9：阴性对照 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建立 多杀杀性巴氏杆菌特异性检测检测 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M 1 2 3 4 M 特异性检验电泳结果 1：肺炎双球菌；2：副猪嗜血杆菌；3：多杀性巴氏杆菌4：阴性对照 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建 立 猪胸膜肺炎放线线杆菌特异性检测检测 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M 1 2 3 4 特异性检验电泳结果 1：阴性对照；2：肺炎双球菌3：副猪嗜血杆菌；4：猪胸膜肺炎放线杆菌 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建立 敏感性检验结检验结 果 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M 1 2 3 4 5 6 M 不同模板浓度下电泳结果 1-5的浓度： 10-5、10-4、10-3、10-2、10-1；6：10-6 猪呼吸道疾病的主要病原检测检测 LAMP方法的建 立 试验中以支原体肺炎、多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌基因组为模板 ，通过对内外引物的比例、dNTP+ 浓度、Mg2 + 浓度和Bst DNA聚合酶用量等条 件逐一优化。在1.2的琼脂糖电泳结果表明：其内、外引物的体积分别为1.0L 、0.4L，其dNTP+的体积为1.0L，其Bst DNA聚合酶的体积为1L，MgSO4 的 体积为3L，整个试验仅需约1h左右，比一些常规的方法时间上要短，在这个条 件下能够得到较为特异的目的梯状条带，与常规PCR 反应相比，大大缩短了检 测时间。并且LAMP的反应结果是一种梯状的条带，与肺炎双球菌、支气管败血 波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌相比，LAMP分析结果能够特异性的鉴别猪肺 炎支原体，该方法表现出了很高的可靠性，且操作简单。LAMP方法检测多杀性 巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌比常规方法检测及血清学检测时间要缩短很多， 而且明显增加了检测的敏感性和准确性。 从结果中表明可以成功建立了肺炎支原体、放线杆菌和巴氏杆菌的LAMP诊断 方法，为我们国家临床上诊断支原体肺炎、放线杆菌和巴氏杆菌提供了灵敏有效 的分子生物学的方法 。 LAMP方法的现场应现场应 用及综综合防治措施的制定 猪肺炎支原体的防制措施： （l）做好猪场环场环 境卫卫生工作：定期对对猪场场内进进行卫卫生清扫扫和消毒工作。采取 自繁自养的原则则，避免引进进种猪或仔猪时时从外地或其他猪场场引进进，特别别是 购购猪的车辆进车辆进 入厂区必须经过严须经过严 格消毒才能进进入。 （2）加强饲饲养管理：严严格注意猪舍内部的温度，预预防突发发情况，注意猪舍内 通风顺畅风顺畅 ，时时刻保持猪舍空气新鲜鲜。冬季每天查查看猪舍是否有漏风风，夏季 注意降低猪舍内的温度。做到合理的饲饲养密度：保育舍23头头/m2；育肥 舍0.8头头/m2；一个饲饲养小组应该组应该 在1013头头猪。饲饲养使用全价饲饲料， 这样这样 可以提高猪的抵抗力，同时时定期进进行驱驱虫。 （3）做好疫苗预预防：在仔猪出生721天，注射支原体活苗，通过过免疫接种 有效地预预防和控制支原体肺炎。这样对预这样对预 防支原体肺炎具有显显著效果。 （4）药药物控制：定期在饲饲料中添加某些药药物是预预防支原体肺炎的重要手段。 药药物有：土霉素、四环环素、大环环内脂类类、替米考星、林克霉素、泰妙菌 素、氟苯尼考、恩诺诺沙星、泰乐乐菌素、强力霉素等对对支原体都有较较好的预预 防效果。 LAMP方法的现场应现场应 用及综综合防治措施的制定 猪巴氏杆菌病的防制 （1）对对于本病的预预防要制定合理的免疫程序，及时预时预 防接种。目前主要使用 猪繁殖与呼吸综综合症灭灭活疫苗和猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联联苗进进行接种。 蓝蓝耳病疫苗在仔猪45日龄进龄进 行首免，每头头肌肉注射2毫升。首免后一个月 可用相同剂剂量的疫苗加强免疫一次，后备备母猪在70日龄龄前同仔猪一样样免 疫。怀怀孕母猪在分娩前一个月加强免疫一次，剂剂量为为每头头4毫升。种公猪在 70日龄龄前接种同仔猪一样样免疫，以后每隔6个月免疫一次，剂剂量为为每头头4毫 升。要注意的是已经发经发 病的猪和屠宰前21天的猪不宜接种。猪瘟、猪丹 毒、猪肺疫三联联苗在接种蓝蓝耳病疫苗后7天给给予接种。苗猪在阉阉割时时接种， 每头头1毫升，转转群或出售时时再用同样剂样剂 量免疫一次。公猪每隔6个月免疫一 次，每头头3毫升。母猪在苗猪阉阉割时时接种，每头头3毫升。 （2）对对混合感染的病例，建议联议联 合使用抗菌和抗病毒药药物。可用青霉素、链链 霉素、土霉素、强力霉素、头孢类药头孢类药 、环环丙沙星、氟苯尼考等药药物交替使 用。对对体温升高的重症病例，在使用抗生素的同时时，可在饮饮水中加入适量的 多种维维生素、葡萄糖、氯氯化钾钾、钠钠等补补液，以维维持机体的内环环境稳稳定。有 条件的猪场场可用干扰扰素、高免血清、免疫球蛋白等药药物进进行特异性治疗疗。 也可用中药药方剂剂清热败热败 毒散，拌料饲饲喂，有一定疗疗效。 LAMP方法的现场应现场应 用及综综合防治措施的制定 猪传传染性胸膜肺炎控制措施： （1）注意保持环环境卫卫生：环环境的变变化等应应激刺激可能会促进该进该 病的发发生，因此要减少 或避免各种应应激因素的影响，加强饲饲养管理，保持为为猪群提供足够够均衡的营营养。注意 保持饲饲养舍内通风风良好，空气清新，及时时清除粪粪便和垃圾，减少尘尘埃和氨的含量。 （2）加强饲饲养管理：如果条件允许应该许应该 采用全进进全出的饲饲养方式，即在猪出栏栏后对对圈 舍进进行彻彻底的清洁洁和消毒1周后才能再次使用。 （3）当引进进的公猪和后备备母猪时应该时应该 确保没有感染过过APP，或者引进进的猪接种过过3次 多价APP疫苗。而且接种的APP疫苗项项目应该应该 包括主要流行菌株和本场场分离株的灭灭 活疫苗。 （4）如果爆发严发严 重，应该应该 制定用药规药规 划。如在混群或进进行其它操作处处理前12d，应应 该给该给 与猪群一些敏感、广谱谱的抗菌药药物；也可以连续连续 5 d在饲饲料中添加 0.04%SM2+TMP。发现发现 有该该病发发生的养殖场场可以根据根据实际实际 情况，在发发病猪 群饲饲料中适当增加添加抗生素的剂剂量，如连续连续 35 d在饲饲料中添加土霉素600 g/t ，或连续连续 57 d添加 ( 林肯霉素+壮观观霉素)5001000 g/t，可防止新的病例 出现现。 （5）加强养殖场场疾病预预防，可以通过过剖检检和病原分离的方法确定本病是否在本养殖场场内 存在，一旦发现发现 患病猪，应该应该 立即隔离饲饲养。如果发现发现 病猪，应该应该 及时进时进 行治疗疗， 注射青霉素、新霉素、泰乐乐菌素、四环环素等疗疗效较为显较为显 著。感染本病较严较严 重的猪场场 可用血清学方法检查检查 ，逐步清除带带菌猪。并在饲饲料中添加药药物进进行防治，建立健康 猪群。 LAMP方法的现场应现场应 用 病料编号来源时间发病情况 病料 数 阳性结 果 1-3桦川县猪场2011.09 40日龄左右保育猪咳喘、消瘦33 4-9桦川县猪场2011.09 60日龄保育猪咳喘、贫血、死亡98 10-12肇东猪场2011.09 25日龄咳嗽、消瘦、衰竭死亡33 13-19桦川县猪场2011.1035日龄咳嗽、消瘦、衰竭死亡75 20肇东猪场2011.10 育肥猪咳嗽、喘、死亡11 21-26香坊猪场2011.10 50日龄左右群体性咳喘、死亡率高65 27-30肇源猪场2011.10 30日龄左右突然咳喘、发烧、厌食43 31呼兰猪场2011.10 80日龄生长猪腹式呼吸、用药无效11 32-33呼兰猪场2011.10 外购仔猪，群体咳喘、呼吸困难用药无效21 34-38安达猪场2011.11 断奶仔猪消瘦、贫血、治疗无效55 39-42肇东猪场2011.11 外购仔猪，群体咳喘、呼吸困难用药无效42 43-45大庆猪场2011.11 120日龄育成猪、咳喘、治疗效果差32 46-48双城猪场2011.12 45日龄保育猪突然死亡、其他咳喘33 49-50平房猪场2011.12 60日龄保育猪咳喘、贫血、死亡22 51-53肇东猪场2011.12 60日龄保育猪咳喘、贫血、死亡33 54-58宾县猪场2012.01 60-80日龄猪，顽固性咳喘、治疗效果差53 59-60肇源猪场2012.01 育肥猪慢性消瘦、治疗效果差、死亡22 61-63呼兰猪场2012.01 外购仔猪，突然群体发病，呼吸困难32 64双城猪场2012.01 保育40多日龄突然死亡10 合计6454 阳性率84.38% LAMP检测检测 肺炎支原体阳性结结果 LAMP方法的现场应现场应 用 来源时间发病情况病料数阳性结果 肇东猪场2011.0925日龄咳嗽、消瘦、衰竭死亡22 桦川县猪场2011.135日龄咳嗽、消瘦、衰竭死亡54 肇东猪场2011.1育肥猪咳嗽、喘、死亡22 香坊猪场2011.150日龄左右群体性咳喘、死亡率高11 肇源猪场2011.130日龄左右突然咳喘、发烧、厌食11 呼兰猪场2011.1外购仔猪，群体咳喘、呼吸困难用药无效21 安达猪场2011.11断奶仔猪消瘦、贫血、治疗无效32 大庆猪场2011.11120日龄育成猪、咳喘、治疗效果差33 双城猪场2011.1245日龄保育猪突然死亡、其他咳喘43 平房猪场2011.1260日龄保育猪咳喘、贫血、死亡11 肇东猪场2011.1260日龄保育猪咳喘、贫血、死亡11 宾县猪场2012.0160-80日龄猪，顽固性咳喘、治疗效果差33 肇源猪场2012.01育肥猪慢性消瘦、治疗效果差、死亡10 呼兰猪场2012.01外购仔猪，突然群体发病，呼吸困难22 双城猪场2012.01保育40多日龄突然死亡11 合计 3227 阳性率 84.38% LAMP检测检测 巴氏杆菌阳性结结果 LAMP方法的现场应现场应 用 LAMP检测检测 胸膜肺炎放线线杆菌阳性结结果 来源时间发病情况病料数阳性结果 肇东猪场2011.0925日龄咳嗽、消瘦、衰竭死亡11 桦川县猪 场2011.135日龄咳嗽、消瘦、衰竭死亡22 肇东猪场2011.1育肥猪咳嗽、喘、死亡10 香坊猪场2011.150日龄左右群体性咳喘、死亡率高54 肇源猪场2011.130日龄左右突然咳喘、发烧、厌食32 呼兰猪场2011.1外购仔猪，群体咳喘、呼吸困难用药无效11 安达猪场2011.11断奶仔猪消瘦、贫血、治疗无效44 大庆猪场2011.11120日龄育成猪、咳喘、治疗效果差