非洲猪瘟实验室诊断.pptx

非洲猪瘟实验 室诊 断 国家外来动动物疫病研究中心 中国动动物卫卫生与流行病学中 心 African Swine Fever, ASF 定 义 非洲猪瘟是家猪、疣猪、欧洲野猪和美洲野猪的一种传传 染性极强的出血性疾病。所有年龄龄的猪都易感。 世界动动物卫卫生组织组织 可表现为 最急性、急性、亚急性和慢性 四 种形式 严重程度与毒株、猪种及流行时间的长 短 有关 急性型以高热、食欲废绝、皮肤发绀 、 网 状内皮系统出血为特征，发病后2-10 天内 死亡，病死率可高达100% 临床上，与古典猪瘟非常相似，难以区 分 目前没有疫苗！ 2017/5/15 只感染猪 家猪和欧亚野猪非常易感 感染后存活的猪可能变为无症状的携带者 非洲的野生宿主能持续感染很长时间 并 且 没有临床症状 软蜱是自然界中的贮主并且可以作为传 播 媒介 法典中将非洲猪瘟的潜伏期定为15天。 2017/5/15 重要性 OIE动物卫生法典要求必须报告的动物疫病 我国动物疫病名录一类动物疫病 我国中长期动物疫病防治规划（2012-2020年） 明确重点防范的外来动物疫病 病原 非洲猪瘟病毒科中唯一成员 Asfarviridae Asfivirus ASFV 兼具虹彩病毒和痘病毒的某些特性 唯一核酸为D N A 的虫媒病毒 只有一个血清型 特点之一：基因组 大 170190kb 蓝耳病病 毒 15kb 12 倍 猪瘟病毒 12kb 15 倍 Genome CSFV 口蹄疫病毒 8kb 24 倍 Genome FMDV 病原 病原 特点之二：基因多变 基因组两端各有一个高变区，基因型多达22 个 特点之三：抵抗力强 温度： 6020分钟； 5670分钟 25-37 数周 4 1年 冻冻肉数年到数十年 pH： 411.5 无血清 413.4 有血清 未熟肉品、腌肉、泔水中可长时长时间间存 活 病原 乙醚、氯仿等脂溶剂可破坏囊膜使其失 活 临床症 状 最急性型 急性型 亚急性 型 慢性型 2017/5/15 临床诊 断 最急性型 无临床症状，突然死 亡 急性型（强毒株） 发烧 （41-42C） 食欲减退 不愿活动 局部皮肤变红或变蓝 色 腹泻 呕吐 呼吸困难 流产 死亡率高（10-100%） 仔猪发生ASF，耳、鼻、唇、腿发红 ，神经症状，数小时内死亡 。 Mityana, Uganda, 2010 临床诊 断 亚急性型（中等毒力毒株 ） 症状同急性型，但较 轻 死亡率低 持续时间长 （3周） 慢性型（低毒力毒株） 消瘦或发育迟缓，体弱 偶见体温升高，波状热 呼吸困难，湿咳 怀孕母猪流产 多处皮肤局部红斑、溃疡 耳部、腹部、大腿内侧可能凸起或坏 死 易继发感染，如继发引起肺炎和关节 炎 感染后能康复，但终身带毒 死亡率低，可见血清转阳 临床诊 断 各种毒力的毒株均可导致流 产 胎儿可能全身水肿 胎盘、皮肤、心肌或肝脏可能有淤血点 诊断 病理诊断 脾脏 肿大 易 碎 暗红色至黑色 胃、肝、肾各部位淋巴结 肿 大、出血； 水肿 肺、肝、膀胱 胆囊充盈 结肠系膜 肾皮质出血点、出血 斑 出血 瘀点 瘀斑 慢性型 纤维 素性心包炎，并可见出血 点 肺局部肉变，实 变 肺部局部肉芽肿，形成结 节 图图1：ASF猪尸体底部的发绀发绀 病变变。图图2：耳尖的发绀发绀 病变变 。 图图3： 血性腹泻 （血痢）。 图图4：急性ASF死猪肺小叶间间的水肿肿 。 图图5：胃的基底膜淤血（急性） 图图6：典型肿肿大脆化脾 。 （黑浆浆果脾，急性ASF ） 图图7：病猪脾（上）与正常脾大小的比较较。（急性ASF ） 图图8：急性ASF猪肿肿大的褐色脾。（巴西品种） 图图9：肾肾淤斑及出血点（急性 ） 图图10：肾肾盂及肾肾乳头头部的 出 血斑（急性） 图图11：肾肾盂处处散在的出血点（急性ASF） 图图12：肿肿大、出血的肝胃淋巴结结，可出见见有血凝块块。（急性 ） 图13：肝胃淋巴结切面，肿大并呈暗红色。（急性ASF） 图14：心包积液及心包肌层有散在的出血点。（急性ASF ） 图图15：胆囊水肿肿（急性ASF ） 图图16：肺部可见见肉芽肿肿病变变 ， 形成一结节结节 （慢性 ASF） 图图17：肺实变实变 区（慢性ASF ） 图图18：心包脏层脏层 附有纤维纤维 素 ， 而且可见见出血点（慢性 ASF） 鉴别诊鉴别诊 断 高致病性蓝耳病 猪皮炎肾炎综合征（PDNS）由PCV-2引 起 细菌性败血症 香豆素中毒 真菌毒素中毒 。 2017/5/15 VirusAb 感染表现出临床症状携带者 病毒血症: 感染后2-3天到8天，持续很长时间（数月） 特异性抗体: 从感染 后的7-11天至数月，甚至数年 排毒:从 感染早期（第2天）以后持续很长时间 。甚至康复后。 ASF感染的主要特 征 猪 (野猪和家猪) 软软蜱 实验室诊 断 实验 室诊 断 病原学血清学 病毒分离 血细胞吸附试 验 直接免疫荧光法 （FAT） 普通PCR和荧光定量 PCR 双抗体夹心ELISA 测 定ASFV抗原 间接ELISA测定 ASF 特异性抗 体 阻断ELISA检测 ASF 特异性抗 体 唯一确诊单诊单 位：国家外来动动物疫病研究中 心 免疫印迹 间接免疫荧光测抗 体 实验室诊 断 血清样样 品 析出的血清 不合格血液样品 分离好的血清单 独 包装，并一一 编号 合格血液样 品 实验室诊 断 病原学样样 品 抗凝血 淋巴结 脾脏 肾脏 骨髓 实验实验 室诊诊断的安全原 则则 保障人员的安全 穿戴：眼罩、手套、实验服、口罩和鞋套等 行为：洗手、禁止聊天，实验室内禁止食用 食 物和饮料等 了解化学试剂的特性和潜在的危险 保障样品的安全 防止样品交叉污染 一次性手套 2017/5/15 良好的工作区域 第一步 实验前清洁试验 区域（台面、移液器等） 注意消毒剂的期限 第二步 划分不同的区域 样品处理（BSL-3提取病毒DNA） PCR检测（Mix配制、加DNA、扩增等） ELISA检测区域（加血清、洗涤、终止等 ） 2017/5/15 GLP (good laboratory practice) 原则则 制定一整套标准以确保质量、可靠性和完整性 ， 可核查结论 和可追溯性数据的报告。 要点 资源：组织、人员、设施和设备 特征：检测项 目和测试系统 规则：试验步骤、标准操作程序（SOP） 结果：原始数据、最后报告和档案 质量保证：独立监测的研究过程 2017/5/15 实验实验 室诊诊断技术储术储 备备 278bp 257bp 英国Pirbright 实验室比对实 验 建立了猪瘟、非洲猪瘟的荧光定量P C R 鉴别诊 断方 法 双抗体夹心ELISA检测抗 原 阻断ELISA检测抗 体 间接ELISA检测抗 体 间接ELISA检测病毒抗 原 商品化试剂 盒 INGEZIM K3 (Ingenasa, Spain) 价格比PCR便宜 不需要复杂的操作 适用于基层实验 室 敏感性低（慢性或亚急性） 2017/5/15 分子生物学检测方 法 O 2 0 u 1 7 r / a 5 , / 1 C 5 . A., L. Edwards, and C. A. Batten. 2013. Virological diagnosis of African swine fever-comparative study of available tests. Virus research 173:150-158. 荧荧光PCR检测检测 病毒 DNA 荧荧光PCR工作 单单 样品的可追溯性！ 2017/5/15 荧荧光PCR检测检测 病毒DNA-试试剂剂准 备备 病毒DNA提取试剂 盒 非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试 剂 盒 荧荧光PCR检测检测 病毒DNA-试试剂剂制 备备 冻冻干蛋白酶K:将蛋白酶K溶解在4.5 ml灭菌后的 蒸馏水中，将溶液以500 l分装，在 -10C温度下 储存，直到使用。 除抑制物缓缓冲液:将20 ml无水乙醇加入原始小瓶 中混匀并进行相应的标记和日期记录。室温储存。 冲洗缓缓冲液:将80 ml无水乙醇加入原瓶中混匀并 进行相应的标记和日期记录。室温储存。 荧荧光PCR检测检测 病毒DNA-仪仪器设设 备备 水浴锅或金属浴 匀浆仪 和匀浆管（陶珠 ） 台式离心机 荧光PCR仪 移液器 荧荧光PCR检测检测 病毒DNA-样样本处处 理 组织样 本 取100 mg组织剪碎，加入1ml PBS研磨或匀浆，然后1050 g或2000 rpm离心10分钟取上清 全血（抗凝血）或血清 直接吸取200 l 提取病毒DNA 将200 l结合缓冲液（绿盖）和40 l蛋白酶K（ 20 mg/mL）加入到1.5 ml离心管中。 加入200 l样本。每个提取程序都加入E+ 和 E- (200 l水)对照。 立即混匀并在722C 温度下孵育10分钟。 将1.5 ml微离心管简单离心操作，除去管盖内部 的 水珠。 将100 l异丙醇加入样样本试试管，混匀。 将过滤管放入收集管中，并将样本移入过滤管。 提取病毒DNA （2） 将过滤管以8000 g离心1分钟。如果样本依然留在过滤管中 ， 重复离心操作。 扔掉收集管，将过滤管加入干净的收集管中。 将500 l除抑制物缓冲液（黑盖）放入过滤管，以8000 g离 心 1分钟。 扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。 将500 l冲洗缓冲液（蓝盖）加入过滤管，以8000 g进行1分 钟离心操作。 扔掉收集管，重复冲洗步骤（500 l冲洗缓冲液加入过滤管 ，以8000 g进行1分钟离心操作）。 扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。以13,000 g进 行10s离心操作以去除残余的冲洗缓冲液。 扔掉收集管，将过滤管放入干净的1.5 ml微离心管中。 提取病毒DNA （3） 将50 l100 l预热的消毒蒸馏水加入过滤管（ 注意不要使用试剂盒中Elution buffer），以8000 g 进行1分钟离心操作。 将DNA溶液在-10C温度下储存（有效期：12个 月），备用；如果DNA溶液在1-2小时内用于 PCR 操作，在43C温度下短暂储存，然后冻 存。 荧荧光PCR检测检测 病毒DNAOIE方 法 配制反应应体系： 反应液溶解后，每个反应管中加入18 l反应液 ， 然后再加入2 l模板； 每次试验需设立反应阳性对照（R+，绿管中的 反 应阳性对照）和反应阴性对照（R-，灭菌水 ） 荧荧光PCR检检 测测 程序设设 置 荧荧光PCR检测检测 病毒DNA-实实验结验结 果 荧荧光PCR检测检测 病毒DNA-结结果判 定 有效性：提取阳性对照（E+）和反应阳性对照R+的 Ct值应 小于35，且提取阴性对照（E-）和反应阴性 对 照（R-）无Ct值，则试验 有效。 阳性和阴性：当样品的扩增结果有典型的扩增曲线 且 Ct值小于37时可判定为阳性。当样品的扩增结果在 背 景信号之下或Ct值37时，判定为阴性结果。 可疑样样品：当样品的Ct值大于35小于37并且扩增曲 线 呈指数时被判定为可疑，当扩增曲线呈线性时判 为阴 性。可疑样品应当重新提取病毒核酸检测，如 仍为可 疑，可判为阳性。 实时荧实时荧 光 RPA 重组酶聚合酶扩增技 术 等温扩增（3742C ） 用时短：20分钟 灵敏度高 操作简单 ，便携式仪 器 2017/5/15 实时荧实时荧 光RPA检测检测 ASFV 特异性强 与其他病毒无交叉反应 敏感性高 能检测出不同基因型的毒 株 2017/5/15 实时荧实时荧 光RPA检测检测 ASFV 2017/5/15 与荧光PCR具有较高的相关性 概率回归分析：最低可检测出17个拷 贝 ASFV的基因型 22个基因型 非洲22个型：西非I型为主，东非基因型复 杂 欧洲- I型意大利撒丁岛，II型东欧和俄罗 斯 2017/5/15 2017/5/15 血清学检测检测 方 法 没有疫苗！抗体=感染 没有中和抗体。 感染早期既可以检测出抗体（7 - 12dpi） 抗体持续很长时间 2017/5/15 血清学检测检测 方 法 筛选 （Screening by ELISA tests） 1. OIE-ELISA 间接ELISA 基于半纯化病毒抗原 2.商业化ELISA试剂盒 INGEZIM PPA COMPAC K3 (INGENASA)使用 VP73特异性单抗的阻断ELISA SVANOVIR 间接ELISA（重组抗原p30蛋白） ID Screen 间接ELISA（包被p32、p62和p72蛋白 ） 2017/5/15 确诊 免疫印迹(Immunoblotting)：半纯化病毒抗原 间接免疫荧光（IFI）：E70毒株感染的传代细 胞 免疫过氧化物酶试验（IPT）：病毒感染的细 胞 对操作人员的要求较高 血清学检测检测 方 法 免疫印迹（IB）方法 2017/5/15 间间接免疫荧荧光（IIF ） 病毒感染细胞后加入待检测血清，再加入 标 记荧 光素的蛋白A。 2017/5/15 免疫过过氧化物酶（IPT ） 非洲猪瘟间间接ELISA抗 体 检测试剂检测试剂 盒国家外来动物疫病研究中心研 发 使用p30蛋白的优点 适用于早期感染 敏感性和特异性较高 Cubillos C, Gomez-Sebastian S, Moreno N, et al. 2013. African swine fever virus serodiagnosis: a general review with a focus on the analyses of African serum samples. Virus Res 173:159-167. 编编号名称装量用法 1预包被酶标板5块直接使用 2酶标抗体（100）300L/管1瓶用稀释液做100倍稀释 3阳性血清25L /管1管用稀释液做40倍稀释 4阴性血清25L /管1管用稀释液做40倍稀释 5稀释液55mL/瓶1瓶直接使用 6洗涤液（20）100mL/瓶1瓶用双蒸水做20倍稀释， 按0.5比例加入吐温-20 7吐温-201.5mL/管1管直接使用 8底物溶液30mL/瓶1瓶直接使用 9终止液30mL/瓶1瓶直接使用 组组分与用 法 非洲猪瘟间间接ELISA抗 体 检测试剂检测试剂 盒 原理 ASFV重组p30蛋白作为抗原包被奇数条作为检测 孔，使 用 抗原稀释液包被偶数条作为对照孔，样品同时加入到 检测 孔与对照孔中，所测OD值之差用于结果判定。 非洲猪瘟间间接ELISA抗 体 检测试剂检测试剂 盒 123456789101112 A S5S5 B S6S6 C S7S7 D S8S8 E S1S1S9S9 F S2S2S10S10 G S3S3S11S11 H S4S4S12S12 注：P表示阳性血清对照孔；N表示阴性血清对照孔；S1、S2、S3、S4等 表 示待检血清孔。 检测检测 步骤骤 1. 待检血清与阴阳对照血清使用样品稀释液做40倍稀释。 2. 在A1、A2和B1、B2孔中加入稀释后的阳性血清，50L/孔。在C1、C2和D1、D2孔中加入稀释后的 阴性血清，50L/孔。在E1、E2加入稀释后的待检检血清，50L/孔。 3. 37孵育60min。 4. 弃去反应孔中的液体。每孔用洗涤液清洗4次，洗涤液（1）300L/孔。每次除去洗涤液后，在吸 水 纸上拍打，除去残留的液体。 5. 每孔加入酶标标抗体（1），50L/孔。 6. 37孵育30min。 7. 重复步骤4。 8. 每孔加入底物溶液，50L/孔。 9. 室温避光作用10min。 10.每孔中加入50L终终止液，终止所有的反应。 11.用酶标仪在450nm的波长下测定各孔OD450nm值，计算OD差。OD差=OD奇数孔-OD偶数孔 结结果判定 阳性对照OD差0.5，阴性对照OD差0.2，试验结果有效；否则，应重新进行试验。待检样品OD差 0.5，判为阳性。待检样品OD差0.5，判为阴性。 非洲猪瘟间间接ELISA抗 体 检测试剂检测试剂 盒 血清学诊诊断小 结结 商品化和OIE-ELISA对较高质量的血清样 品 检测