中药化学成分的结构研究.ppt

中药有效成分化学结构的研究方法 化合物纯度的判定方法 1结晶均匀、一致。 2固态：熔点明确、敏锐（0.51.0） 液态：沸程在5以内 3TLC (PC):两种以上不同展开剂展开，均呈现 单一斑点。 4HPLC、GC也可以用于化合物纯度的判断。 一、中药有效成分的理化鉴定 1. 物理常数的测定 物理常数的测定包括熔点、沸点、比旋度、折光率和比 重等的测定。固体纯物质的熔点，其熔距应在0.51.0的 范围内，如熔距过大，则可能存在杂质，应进一步精制或另 用不同的溶剂进行重结晶，直至熔点恒定为止。液体物质可 测定其沸点。液体纯物质应有恒定的沸点，除高沸点物质外 ，其沸程不应超过5的范围。此外，液体纯物质还应有恒定 的折光率及比重。比旋度也是物质的一种物理常数。中药的 有效成分多为光学活性物质，故无论是已知还是未知物，在 鉴定化学结构时皆应测其比旋度。 2. 分子式的确定 常用质谱法，高分辨质谱（HR-MS） 3.化合物的结构骨架与官能团的确定 一般首先决定化合物的不饱和度，准确计算出结构中可 能含有的双键数或环数。 用化学法推定分子结构骨架 二、四大光谱在结构测定中的应用 紫外 可见光谱（UV -VIS） 紫外 可见光谱（UV -VIS） 共轭体系特征 分子中电子跃迁（从基态至激发态）。其中，n- *、-* 跃迁可因吸收紫外光及可见光所引起， 吸收光谱将出现在光的紫外区和可见区（200700nm） 。 200nm 400 700nm 紫外区（UV） 可见区（VIS） 应用： 推断化合物的骨架类型 共轭系统 取代基团的推断 如：加入诊断试剂推断黄酮 的取代模式（类型、数目、排列方式） 用于含量测定（以最大吸收波长作为检测波长 进行含量测定） 红外光谱（IR） 分子中价键的伸缩及弯曲振动所引起的吸收而测得的 吸收图谱，称为红外光谱。 4000 3600 3000 1600 1000 625cm-1 特征频率区 指纹区 特征官能团的鉴别 化合物真伪的鉴别 羟基（酚羟基、醇羟基） 36003200 cm-1 游离羟基 3600 cm-1 氢键缔合羟基 34003200 cm-1 羰基 16001800 cm-1 酮 1710 cm-1 酯 17101735 cm-1 芳环 1600、1580、1500cm-1 有23个峰 双键 16201680 cm-1 两个化合物完全相同的条件 1、 特征区完全吻合 2、 指纹区也需完全一致 红外光谱（IR） 红外光谱对结构的鉴定，主 要用于功能团的确认和芳环 取代类型的判断。 1H-NMR（核磁共振氢谱） 信息参数： 化学位移（）、峰面积、峰裂分 （s 、d、t、q、m）及偶合常数（） （1）化学位移（C）020ppm 与1H核所处的化学环境（1H核周围的电子云 密度）有关 电子云密度大，处于高场，值小 电子云密度小，处于低场，值大 0.9-C-CH3 1.8-C=C-CH3 2.1-COCH3 3.0-NCH3 3.7-OCH3 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -COOH -CHO Ar-H -C=C-H 常见结构的化学位移大致范围 (ppm) 推断化合物的结构（含1H核基团的结构） （二）峰面积: 磁等同质子的数目 用积分曲线面积（高度）表示 磁不等同两个或两组1H核在一 定距离内相互自旋偶合干扰， 发生的分裂所表现出的不同裂分 符合 n+1 规律 ( n = 干扰核数目 ) 用偶合常数（J）表示 峰裂分的数目 峰裂分的距离 不同系统偶合常数 (J Hz) 大小 s 单峰 d 双峰 t 三重峰 q 四重峰 m 多重峰 1H-NMR核磁共振辅助技术 （1）重氢 (D2O) 交换 推断活泼质子（羟基） 的存在与否。 （2）核增益效应（NOE）：指在核磁共振中选择 性照射一种质子使其饱和，则与该质子在立体空间 位置上接近的另一或数个质子信号强度增高的现象 。（范例见P31） 13C-NMR（ 核磁共振碳谱 ） 信息参数： 化学位移（C） 碳谱的化学位移的定义及表达方式与氢谱 一致，所用内标也一样，但是化学位移的 幅度较宽，约200个化学位移单位，故信 号之间很少重叠，识别起来比较容易。 不同 13C 核C大小与13C 核所处的化学环境（周围电子 云密度）有关 用于13C 核类型的推断 ( C ppm ) 150220( c=o) 200 150 100 50 0 c=c Ar 5080 (c-o) 饱和碳原子（060） 主要结构13C 核C的大致范围 化学位移：大致范围（C）0200ppm 质谱（MS）: 1确定分子量（高分辨质谱 可将分子量精确 到小数点后三位）, 计算分子式。 2与标准图谱比较用于化合物的鉴别（相同 条件下，其裂解是符合一定规律的）。 3依据裂解特征及碎片离子，推定或复核未 知化合物分子的部分结构。 电子轰击质谱（EI-MS） 但对于热敏成分及难于气化的成分 （醇、糖苷、部分羧酸等） 大分子物质（多糖、肽类）难以气化 测不到分子离子峰 亦无法测得分子量 对热不稳定性的化合物乙酰化或三甲 基硅烷化（TMS化）制成热稳定性好 的挥发性衍生物进行测定 (2)化学电离质谱 CI-MS (3)场致电离 FI-MS ( 3 )场解析质谱 FD-MS (4)快原子轰击质谱 FAB-MS (5)电喷雾电离质谱 ESI-MS 电离新方法（样品不必加热 气化而直接电离） 第1节 苷类的结构研究 苷类结构研究的一般程序： 1.物理常数的测定。Mp. 等。 2.分子式的测定质谱分析法（广泛采用） 电子轰击质谱（EI-MS）：不易获得分子离子峰（极性大） 化学电离质谱（CI-MS） 场解吸质谱（FD-MS）：常用 快原子轰击质谱（FAB-MS）：常用 高分辨快原子轰击质谱（HR-FAB-MS）：能直接测出分子式 3.组成苷的苷元、糖的鉴定 （1）苷元的结构鉴定（见各章节） （2）糖的种类鉴定 纸色谱（PC）：分配原理，BAW系统，与对照品共色谱鉴定 薄层色谱（TLC）：硅胶（硼酸溶液或无机盐溶液制 - 增加上 样量） 气相色谱（GLC）：水解、制备TMS衍生物（具挥发性），用 对照品tR鉴定 NMR光谱： 苷中各糖的不同质子的、J 与标准糖数据进行比较鉴定 苷中各糖的不同碳原子的 与标准糖数据进行比较鉴定 （3）糖的数目的测定 光密度扫描法测定各糖斑点含量，计算各糖分子比， 推算组成苷的糖的数目 质谱法测定苷及苷元的分子离子峰（分子量），计算 其差值，求出糖的数目 1H-NMR谱: 端基质子的信号（大 - 处于低场）数目 或者 全乙酰化或全甲基化物乙酰氧基、甲氧基信号 （、J） 的数目 13C-NMR谱: 端基碳原子信号（90112ppm）的数 目或者苷分子总碳信号数目减去苷元的碳信号数目, 推算糖的数目 4.苷元与糖、糖与糖之间连接位置的测定 （1）苷元与糖之间连接位置的测定 13C-NMR谱法：利用苷化位移规律，将苷与苷元的碳谱 相比较即可鉴别 醇羟基苷化，苷元-碳向低场位移（+410ppm）， -碳向高场位移（-0.9-4.6ppm） 酚羟基苷化，苷元 -碳向高场位移 ，-碳向低场位移 化学方法: 将苷的全甲基化物进行甲醇解，鉴定（与对 照品共色谱）未全甲醚化的单糖，游离羟基所在位 置即糖与糖之间的连接位置。 （2）糖与糖之间连接位置的测定 13C-NMR谱法：利用苷化位移规律，将苷与相应单糖 的碳谱数据相比较即可鉴别 。 糖与糖相连，内端糖连接糖的碳原子移向低场（4 7 ppm）相邻碳原子移向高场（ -1-4 ppm） 5.苷中糖与糖之间连接顺序的确定 苷 缓和酸水解 酶解 乙酰解 全甲基化甲醇解 部分苷键断裂 的裂解产物 分 析推 断 波谱分析法 质谱（MS）法：主要利用质谱中归属于有关糖基的 碎片离子峰或各种分子离子脱糖基的碎片离子峰， 可对糖的连接顺序作出判断。 EI-MS ： (需作成全甲基化、乙酰化或三甲基硅醚化物) 常见各单糖及双糖的全乙酰化物、TMS衍生物 碎片离子峰见书。 FD-MS 或FAB-MS：常出现各种脱去不同程度糖基的 碎片离子峰。 6.苷键构型的确定 （1）利用酶水解法(酶的专属性) （2）利用开勒（Klyne）经验公式进行计算 MD = M D苷-M D苷元 与各糖的一对甲苷（ -、-）的分子比旋度相比较， 与 -甲苷接近，则该苷键构型为 -构型 与-甲苷接近，则该苷键构型为-构型 1H-NMR利用端基质子偶合常数的大小判断苷键构型 依据 相邻碳原子上质子偶合常数的大小与二者之间的立体夹角有关 H-2为键的糖 （葡萄糖、木糖、半乳糖） H-2为e键的糖 （鼠李糖、甘露糖） -苷键 -苷键 -苷键 -苷键 J12 = 23.5Hz J12= 69Hz J12= 2 Hz J122 Hz (Jae、60O) （Jaa、180） （Jee、60） （Jae、60O） J12不相等 J12相等 意义 可以用于构型的判断 不能用于构型的判断 （3）利用核磁共振（NMR）确定苷键构型 -D-葡萄糖苷 -L-鼠李糖苷 J12 = Jae = 23 Hz J12 = Jae = 2 Hz -D-葡萄糖苷 -L-鼠李糖苷 J12 = Jaa = 69 Hz J12 = Jae = 2 Hz 如表3-4，利用端基碳原子的化学位移判断苷键构型，除D-甘 露糖、L-鼠李糖外，绝大多数单糖甲苷，其 -型与-型的化学位移 相差4ppm。 如表3-5 利用端基碳原子与端基质子的偶合常数判断苷键构型 -甲苷 JC1-H1170Hz -甲苷 JC1-H1160Hz 10ppm 13C-NMR谱： 例题：确定苷键构型的方法为（ ） A利用Klyne经验公式计算 B1H-NMR中，端基氢偶合常数J=68Hz为-构型，J=34Hz为-构型。 C1H-NMR中，端基氢偶合常数J=68Hz为-构型，J=34Hz为-构型。 D13C-NMR中，端基碳与氢偶合常数J=160Hz为-构型，J=170Hz为-构型。 E13C-NMR中，端基碳与氢偶合常数J=160Hz为-构型，J=170Hz为-构型。 一、化学方法（辅助手段） 二、波谱技术：包括UV、IR、NMR、MS等四 大光谱技术。目前已成为醌类化合物结构研 究主要技术手段。 尤其在样品量比较少的情 况下，波谱技术为首选方法。特别是核磁共 振技术、质谱技术。 第2节 醌类化合物的结构研究 一化学方法 1锌粉干馏：母核推断 2氧化反应：取代基推断 3衍生物制备：甲基化物、乙酰化物 羟基蒽醌（-OH、-OH、醇OH、羧基）羟基数目、位置 * 甲基化试剂的选择性反应 * （乙酰化试剂） 推断 元素分析或波谱分析（NMR） 甲基化产物 确定甲氧基数目 （乙酰化产物） （确 定乙酰基数目） 1、紫外可见（UV）光谱：共轭特征 2、红外光谱（IR）: 官能团特征 3、核磁共振（13C谱）: 分子骨架 （ 1H谱）: 基团特征 4、质谱（MS ）：分子量（M+.） 二 波谱分析 苯 醌 240nm 强峰 285nm 中强峰 400nm 弱峰 （苯甲酰基） 245nm 251nm 335nm 萘醌 (醌样结构) 257nm （1）醌类化合物的紫外光谱特征 苯甲酰基： 252nm 325nm 醌式结构： 272nm 405nm 蒽醌母核的紫外光谱： 羟基蒽醌： 峰 位 与结构的关系 230nm左右 与总-OH数目有关 240260nm（苯） 262295nm（醌） 与-OH有关，lg 4.1 示有-OH，伴随峰红移 305389nm（苯） 400nm以上 （醌） 与-OH数目有关，数目 越多，红移越大 第一峰与羟基数目的关系： 第五峰与结构的关系： 羰羰基 苯环环 羟羟基 （16751653 cm-1 ） (16001480 cm-1) (36003130 cm-1) 羟基蒽醌 羰基与羟基( -OH)缔合 的影响 羟基蒽醌红外光谱（IR）特征 ： （ 2 ）红外光谱（IR） 缔和羟基 缔和羰基 游离羟基 游离羰基 吸收峰向低波数位移 游离羰基（高波数） 游离羟基（-OH ） （36003150cm-1） 缔合羰基（低波数） 缔合羟基（-OH ） （ 3150cm-1以下） 羰基峰的数目、 位置与-羟基的 数目及位置有关 -羟基数目及位置对羰基频率的影响： 3.核磁共振氢谱(1H-NMR谱) (1) 醌环上质子 醌环质子（2、3、5、6） 672（） 芳环质子 8.06(-H, 5、8) 7.73(-H, 6、7) 醌环质子 6.95() (2) 芳环上质子 萘 醌 苯 醌 蒽醌芳环上质子： -H （1、4、5、8） 8.07 -H （2 、3、6、7） 7.67 蒽醌 (3)取代基质子的化学位移及对芳环质子的影响 甲基质子 2.12.9 （或宽） （ 供电基，邻芳氢-0.15） （ 大黄素 ） -OH质子 1112 邻、对芳氢-0.45 -酚羟基质子（） 160ppm) C-7 (C-OH, s. 160ppm)，受羰基吸电共轭的影响 C-9 (季碳，C-O-, s. 149.0154.0ppm) C-10 (季碳，s. 110.0113.0ppm) C-4 (C=C, d. 143.0145.0ppm)，受羰基吸电共轭的影响 C-3 (C=C, d. 110.0113.0ppm) C-2 C-7 C-9 C-4 C-5 C-6 C-3 C-10 C-8 160以上 110.0 113.0 110以下 13C-NMR谱特征： （2）出现一系列失去CO的碎片离子峰，最主 要碎片离子峰是M-CO+ 峰。 （3）具有甲氧基取代的香豆素经常出现失去 甲基（-CH3）的碎片离子峰。 4质谱（MS）特征 （1）大多具有很强的分子离子峰M+，简单 香豆素和呋喃香豆素的分子离子峰经常 是基峰。 花椒毒内酯质谱裂解途径 一. 紫外可见光谱在黄酮类化合物结构测定中的应用 一般鉴定程序： 1、先测定在甲醇中的光谱。 2、再测定在加入各种诊断试剂后的紫外光谱。 3、如为苷类，则可水解或甲基化后再水解，并测 定苷元或其衍生物的紫外光谱。 4、将以上各种光谱数据（或光谱图）进行对比分 析，即可获得有关结构信息。 第4节 黄酮类化合物的结构研究 黄酮（醇）： 带 II、带I均强 母核光谱特征 二氢黄酮类 、异黄酮类 ：带 II强、 带I弱 母核的推 断 （甲醇） 查耳酮、橙酮：带 II弱、带I强 取代基：OH等，为助色团 依红红移规规律推断取代基团团 甲醇钠：强碱，所有酚羟基解离 醋酸钠：碱性弱，酸性强的酚羟基解离 加入诊断试剂 醋酸钠/硼酸：邻二酚羟基络和 相应吸收峰红移 三氯化铝：3-OH，4-羰基 5-OH，4-羰基 络和 邻二酚羟基 1.黄酮类酮类 化合物在甲醇中紫外光谱谱特征 苯甲酰酰系统统 桂皮酰酰系统统 （带带II 220280nm） （带带I 300400nm） 黄酮类酮类 化合物结结构中的交叉共轭轭体系 二氢黄酮（醇） 异黄酮（二氢） （由B环产环产 生的桂皮酰酰系统统不存在，带带I弱，带带II强） 黄酮类酮类 化合物在甲醇中紫外光谱谱特征 黄酮类酮类 化合物母核UV吸收特征 母核类型 带II （nm） 带I （nm） 备注 黄酮酮 250280（强） 304350（强） 典型的交叉共轭轭系统统 黄酮酮醇（3-OH游离） 250280（强） 358385（强） 3-OH供电电共轭轭，带带1红红移 黄酮酮醇（3-OH取代） 250280（强） 328357（强） 3-OH供电电减弱，使黄酮酮 异黄酮 245278（强） ( sh ) 桂皮酰系统破坏 二氢黄酮（醇） 270295（强） ( sh ) 查耳酮 220270（弱） 340390（强） 橙酮 230270（弱） 370430（强） 花青素（苷） 270280 465560（可见区） （2）取代基团对共轭吸收的影响 黄酮类核中引入-OH（酚羟基）等供电基团，使共 轭程度增强，相应的吸收峰红移。 一般，A环引入 OH，带II红移，B环引入 OH 带I红移。 羟基甲基化或苷化后，原酚羟基的供电能力下降 ，引起相应的吸收峰紫移。 3-OH甲基化或苷化，带I紫移， 5-OH（与羰基形成分子内氢键）甲基化，带I 、带II均紫移515nm， 4-OH甲基化，带I紫移310nm。 羟基乙酰化后，乙酰基的吸电作用，使原来酚羟 基对共轭系统的供电能力消失，对光谱的影响亦 将完全消失。 黄酮酮 、黄酮酮醇加入诊诊断试剂试剂 后吸收峰（带带I、带带II）的位移规规律 诊诊断试剂试剂 位移规规律 归归 属 NaOMe 带I红移4060nm，强度不降 示有4-OH 带I红移5060 nm，强度下降 示有3-OH、但无4-OH NaOAc 带II红移520nm 示有7-OH 2.加入诊断试剂后引起的位移及其在结构测定中的意义 NaOAc / H3BO3 带I红移1230nm 示B环有邻二酚羟基 带II红移510nm 示A环有邻二酚羟基 （不包括5，6-邻二酚羟基） 诊断试剂 位移规律 归 属 AlCl3 及AlCl3/HCl AlCl3/HCl谱图 = AlCl3谱图 示无邻二酚羟基 AlCl3/HCl谱图 AlCl3谱图 示可能有邻二酚羟基 AlCl3/HCl谱较AlCl3谱 带I紫移3040 nm 示B环有邻二酚羟基 若紫移20nm 示B环有邻三酚羟基 带I紫移5065 nm 示A、B环均可能有邻二酚羟基 AlCl3/HCl谱图 = MeOH谱图 示无3-及5-OH AlCl3/HCl谱图 MeOH谱图 示可能有3-及/或5-OH 带I红移3555 nm 示只有5-OH 无3-OH 仅红移1720 nm 示除5-OH外，尚有6-含氧取代 红移5060nm 示可能同时有3-OH及5-OH 异黄酮酮、二氢氢黄酮酮（醇）的吸收峰（带带II）位移规规律 NaOAc 异黄酮 带带II红移620nm 示有7-OH 二氢黄酮（醇） 带带II红移3437nm 示有5，7-二OH 带带II红移5158nm 示有7-二OH AlCl3/HCl AlCl3/HCl谱图谱图 与甲醇中的谱图谱图 比较较 异黄酮酮 带带II红红移1014nm 示有5-OH 二氢氢黄酮酮（醇） 带带II红红移2026nm 示有5-OH 诊断试剂 位移规律 归 属 查查耳酮酮、橙酮酮的吸收峰（ 带带I ）位移规规律 NaOMe 查耳酮 带带I红移60100nm，强度增加 示有4-OH 带带I红移60100nm，强度不增加 示有2-或4-OH 橙酮 带带I红移7095nm， 示有或6-OH AlCl3 及AlCl3/HCl 查耳酮、橙酮 （ AlCl3较 AlCl3/HCl谱图） 带带I 红移4070nm 示有B-环邻二酚羟 基 查耳酮（ AlCl3/HCl谱图较 MeOH谱图） 带带I 红移4060nm 示有2- OH 诊断试剂 位移规律 归 属 二1H-NMR谱在黄酮结构研究中的应用 测定溶剂 ： CCl4 - 样品需制备成三甲基硅醚化 衍生物，不能显示羟基质子特征，目 前已基本不被采用。 DMSO-d6 - 样品（苷、苷元）不需 制备成衍生物，可以显示各酚羟基质 子特征。 A 环质环质 子 B环质环质 子 C环质环质 子 糖上质质子 取代基团质团质 子 芳环质环质 子 芳环质环质 子 与类类型有关 端基质质子 -OH、-CH3、 其它质质子 -OCH3、 -OCOCH3 黄酮类化合物各质子的信号特征（、峰形状、J、峰面积） 6 8ppm，B-H位于较较低场场 5-H最大8.0 ppm（羰羰基去屏蔽） A-H 5.77.9 5-OH 12.40 B-H 6.57.9 7-OH 10.93 1H-NMR谱在黄酮结构研究中的应用 J邻 邻 6 9Hz 3-OH 9.70 J间 间 2 3 Hz 4-OH (10.01) J对 对 0 1 Hz（不计 计） 3-OH (9.42) 峰形状及J与取代有关 -OCH33.5 4.10(3H s) 6-CH32.042.27(3H s) 8-CH32.142.45(3H s) A-环环 B-环环 -OCOCH3 (羟羟基乙酰酰化) 5，7-二OH 4- 氧取代 糖上1.652.10(3H s) 7-OH取代 3，4- 氧取代 苷元2.302.50(3H s) 3，4，5- 氧取代 glu H-1 位于低场场 较较大4.85.70ppm 依、峰形（d、dd）、J 苷元-3-O-glu 5.80左右（1H.d.） J与构型有关Jaa=69Hz， Jae=23 A、B-环环取代方式推断 苷元-5、7、4-O-glu 5.0左右 rha C-CH3 0.8 1.20 ( d/m ) 黄酮 H-3 6.30（1H，s） 黄酮醇 C-环无质子 异黄酮 H-2 7.6 7.80（1H，s）受1-氧原子和4-羰 基吸电影 响,较大 二氢黄酮 H-2 中心5.2(1H,dd.Jaa =11.0Hz, Jae = 5.0Hz) 两个H-3 中心2.8 (1H,dd.J偕 =17.0Hz, Jaa =11.0Hz) (1H,dd.J偕 = 17.0Hz, Jae = 5.0Hz) 二氢黄酮醇 H-2 4.85.0（1H，d. Jaa= 11.0Hz） H-3 4.1 4.3（1H，d. Jaa=11.0Hz） 查耳酮 H-a 6.7 7.40 (1H,d.J反=17.0Hz) H- 7.0 7.70 (1H,d.J反=17.0Hz) 橙酮 =CH 6.5 6.70（1H，s） 取代基团团 1H-NMR谱在黄酮结构研究中的应用 三13C-NMR谱在黄酮类化合物结构研究中的应用 推断黄酮类酮类 化合物的骨架类类型 （一）黄酮类化合物骨架类型的判断 利用13C-NMR谱中黄酮类化合物的中央三个碳核 信号的位置以及它们在偏共振去偶谱中的裂分情况 13C-NMR谱 谱中黄酮类酮类 化合物结结构中的中央三碳核的信号特 征 C=O C-2（或C-） C-3（或C-a） 归归属 174.5184.0 (s) 160.5163.2 (s) 104.7111.8 (d) 黄酮类酮类 147.9 (s) 136.0 (s ) 黄酮酮醇类类 149.8155.4 (d) 122.3125.9 (s) 异黄酮类酮类 182.5182.7(s) 146.1147.7(s) 111.6111.9 (d) 橙酮类酮类 ( =CH- ) 188.0197.0 (s) 1