RNA加工与核糖核蛋白复合体.ppt

第十章 RNA加工与核糖核蛋 白复合体 一、rRNA加工与核糖体 1. RNA的加工类型 成熟的RNA分子很少是转录形成的 大多数新生RNA分子经历多种修饰才成 为成熟的产物 RNA加工是对初生转录物进行修饰的总 称，常见的加工类型包括： 内切核酸酶和外切酶对核苷酸的切除 向初生RNA转录物或剪切产物的3端和 5端添加核苷酸 向某些特殊的核苷酸碱基或糖苷进行修 饰 primary transcriptprimary transcript mature RNAmature RNA. . Nucleus or Nucleolus Cytoplasm RNA processing Romoval of nucleotides addition of nucleotides to the 5- or 3- ends modification of certain nucleotides 2. 原核生物的rRNA加工 在E.coli中，有7种不同的rRNA操纵子 分散在基因组中 每一个操纵子都包含5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA序列各一个，还包含 14个 tRNA的编码序列 初生转录物的沉降系数为30S（约 6000nt），但存在时间很短 rRNA操纵子 Pre-16S rRNAPre-tRNA Pre-23S rRNA pre-5S rRNA Pre-tRNA Promoters Terminators 大肠杆菌rRNA转录后加工要经历一系 列步骤： 转录物通过内部互补序列间的碱基配对 折叠形成一些茎环结构。 茎环结构的形成使得一些蛋白与之结合 形成核糖核蛋白复合体（RNP）。 在结合完成以后，一些修饰就开始了。 3. 真核生物rRNA的加工 真核生物中的rRNA也是由一个长的单 链前体分子经过特定的修饰和剪切步骤 后形成 过程还不是十分清楚 在许多真核生物中，rRNA基因呈串联 重复排列，包含100个或更多的转录单 位，在核中由RNA聚合酶I转录。 在各种生物体中前体有特定的大小（酵 母菌中为7000nt，哺乳动物中为 13500nt)，在不同的生物个体之间也有 轻微的差异。 前体含18S、5.8S、及28S编码区域的各 一拷贝，后两者和起来相当于原核生物 中的23S rRNA。 真核生物的5S rRNA由聚合酶III转录散 在基因产生出121nt转录物，而且几乎不 需要加工。 4. 核糖核蛋白复合体及其研究 在细胞内，RNA分子通常与蛋白复合存 在，特定的蛋白与特定的RNA结合。这 种RNA与蛋白复合体称为核糖核蛋白（ ribonucleoprotein，RNP）。 核糖体是最大且最复杂的RNP，在加工 过程中由rRNA和特定的核糖体蛋白复 合而成。 用于研究RNP的方法有： 分离可将RNP纯化后分解为RNA分子与蛋白 ，然后在分别鉴定 重装配用来发现组分相应结合在一起的规则 ，如果这些组分可以被修饰，就可以获得一 些关于它们各自功能的线索 电子显微镜直接观察RNP RNP或它们单一组分的抗体来纯化，也可以 用来封闭RNP的功能，与电子显微镜联用可 以确定特定的组分在整个结构中的大致位置 RNA结合实验显示一种特定蛋白与某一 RNA的结合，然后用RNA酶处理RNA- 蛋白复合体可以显示出结合蛋白保护了 RNA的哪一部分（Raase保护实验） 运用紫外光照射经过和和未经过化学试 剂交联的交联实验，可以显示出哪一部 分RNA与蛋白分子在复合体中是紧密结 合在一起的 中子和X射线最终可以给出RNP完整的 三维结构 5. 原核生物的核糖体 大肠杆菌核糖体占干重的25%（总蛋白 的10%和总RNA的80%）。 70S核糖体约为2750KD 由一个50S大亚基和一个30S小亚基组成 6. 真核生物的核糖体 80S核糖体由一个60S大亚基和一个40S 小亚基 大亚基包含大约45种蛋白、一个5S rRNA分子、一个5.8 S rRNA及一个28S rRNA分子（后两者相当于原核生物23S rRNA) 小亚基包含18S rRNA和大约30种不同蛋 白。 每秒总共可以生成约100万个肽键。 二、tRNA的加工、RNA酶P和核酶 tRNA 3-D structure 1. 原核生物的tRNA加工 成熟的tRNA分子可以从操纵子的前体 转录物加工 初级转录本 RNase D,E,F and P 具有成熟末端的tRNA 碱基修饰 成熟的 tRNA 2 .真核生物的tRNA加工 真核生物酵母菌tRNA前体含有： 一个16nt 5端前导区 一个14nt 内含子 两个额外的3端核苷酸 初生的转录物形成一个具有特征茎环的 二级结构，内切酶正是识别这种结构并 切除5端前导区和2个额外的3端核苷酸 。 3端的两个核苷酸被切除后，tRNA核酸 转移酶将5-CCA-3序列添加到tRNA的 3端，产生出成熟的tRNA3端。（原核 生物成熟tRNA3端的CCA是基因编码的 ，但真核生物编码tRNA不属于这种情 况） 切除内含子，由内切酶将内含子两端切 除后，再将两个半个的tRNA分子连接 在一起。 酵母菌前tRNA中的内含子可在脊椎动 物细胞内加工，真核生物tRNA加工机 制在进化中可能是高度保守的。 3. 核糖核酸酶P RNase P是由一个RNA分子和一个蛋白 分子组成的一种内切酶，是一种很简单 的RNP。 作用：修剪前tRNA分子产生出成熟的5 端。 在原核和真核生物中均有发现。 真核生物中RNase P位于核内，是一种 核内小分子RNP（snRNP)。 在大肠杆菌中，由一个377nt RNA和一 个13.7kDa的碱性蛋白组成。 如果向试管中加入前tRNA ，单独的 RNA组分就可以行使内切核酸酶功能。 这种RNA是一种具有催化活性的RNA， 称为核酶，即使无蛋白存在也可催化化 学反应。 体外的RNase P催化反应比体内需更高 的镁离子浓度，因此在细胞内蛋白组分 可能有助于催化反应。 4. 核酶（ribozyme） 核酶是一种可以催化特定生化反应的 RNA分子。 RNase P是一种广泛存在可使tRNA成熟 的核酶。 自我 剪接（self-splicing) ：四膜虫 rRNA大亚基中有一个内含子，可在无 蛋白条件下，对转录物进行体外自我剪 接。 需要鸟苷或磷酸化的衍生物作为辅助因 子。 体外反应的效率只有体内反应的五十分 之一。 核酶可用做治疗用试剂： 纠正突变的mRNA 抑制某些基因的表达 杀死癌细胞 抑制病毒的复制 三、mRNA加工、 hnRNP和 snRNP 1. mRNA的加工 原核生物中mRNA转录物根本不需要或 很少需要加工。核糖体在mRNA分子的 合成未完成前就可以开始翻译。 从5端开始降解 真核生物RNA聚合酶II 转录产物的群体 统称为核内不均一RNA（hnRNA) 即将被加工成mRNA分子的转录物被称 为前mRNA 前mRNA分子经过5端加帽、3端剪切 及加多聚A尾巴、剪接和甲基化加工产 出成熟的mRNA分子 真核 mRNA 加工 2. hnRNP 由RNA聚合酶II合成的hnRNA主要是前 mRNA，并很快被蛋白包裹形成核内不 均一RNP(hnRNP)。 hnRNP蛋白被认为有助于保持hnRNA的 单链状态，并辅助各种RNA加工反应。 3. snRNP颗粒 snRNA常与特定蛋白形成snRNP 富含尿嘧啶，因此被命名为U1、U2等 大部分snRNP参与了前rRNA加工中甲基 化位点的确定 snRNP的构成过程： RNA聚合酶II在核中合成，并具有一个 正常的5帽子结构 进入细胞质，与核心蛋白以及其他特定 蛋白结合 转运核中，行使剪接功能 在5端帽子结构上得到两个碱基 4. 5端加帽 RNA聚合酶开始转录后不久，在RNA链 长度超过2030 nt之前，其5端经化学 修饰被加上一个7-甲基鸟苷残基，这种 修饰被称为帽子结构。 与正常的3-5连接方式不同，通过一个 GMP核苷酸以反方向加到新生的RNA转 录物上，从而形成5-5三磷酸桥。 催化这一添加核苷酸反应的酶是mRNA 鸟苷转移酶 阻止降解（帽子结构对5外切核酸酶形 成屏障，起到稳定转录物的作用） 增加翻译的效率 转运至细胞质中 剪切第一个外显子 5. 3端剪切及加尾 对于大多数前mRNA而言，成熟的 mRNA分子3端是经过剪切再加上一串 多聚A残基即poluy(A)尾巴而形成的。 剪切和聚腺苷酸化反应需要DNA和前 mRNA转录物上的特定序列，即5- AAUAAA-3聚腺苷酸化信号序列。 增加mRNA的稳定性 增加翻译效率 剪切最后一个内含子 6. 剪接 切除内含子将外显子连接在一起的过程 称为剪接 发生在核内，而且在成熟的mRNA分子 转运到胞质之前 内