毕业论文：毛细管电泳法测扑热息痛的含量.doc

*大学 题 目： 毛细管电泳法测扑热息痛含量 院 系： 专 业： 班 级： 学生姓名： 指导教师： 摘 要扑热息痛国际非专有药名为Paracetamol，化学名为对乙酰氨基酚。它是最常用的非抗炎解热镇痛药，镇痛作用较弱，无抗炎抗风湿作用，是乙酰苯胺类药物中最好的品种。特别适合于不能应用羧酸类药物的病人。用于感冒、牙痛等症。对乙酰氨基酚，也是有机合成中间体，过氧化氢的稳定剂，照相化学药品。本文通过毛细管区带电泳法测定不同药物中扑热息痛的含量，在50 mmol/L硼砂(pH 9.23)运行缓冲液中，电压15 Kv，检测波长243 nm的优化电泳条件下，进行分析检测。扑热息痛样品在10 min内出峰，扑热息痛线性范围为10100 mg/mL，检出限为0.91 mg/mL，定量限为3.0 mg/mL，3次平行进样的相对标准偏差(RSD)为小于2.3%，加标回收率(n=3)为96%101%。该法快速、灵敏、可靠，结果令人满意。关键词: 毛细管区带电泳；扑热息痛；标准曲线法；含量测定AbstractParacetamol, the international non-proprietary medicine which is called acetaminophen in chemistry, is the most common non-anti-inflammatory antipyretic analgesics, with poor analgesic effect and no anti-inflammatory anti-rheumatic effect. As the best Acetanilide drugs, itis usually used to cure of colds, toothache embolism and so on, and particularly suitable for the patients who can not take carboxylic acid drugs. Moreover, acetaminophen is used as both the intermediates in organic synthesis and the stabilizer of hydrogen peroxide, as well as the photographic chemicals.In this paper, the content of paracetamol in different drugs was determinated by Capillary zone electrophoresis under the optimal condition of 50 mmol / L borax running buffer, pH 9.23, applied voltage of 15 Kv . Paracetamol arrived its peaks within 10 min, The linear range was 10100 mg/mL, the detection limit was 0.91 mg/mL, and the quantitation limit was 3.0 mg/mL, the relative standard deviation (RSD) of three parallel group 3.5%, the labeled recovery (n = 3) was 96%101%. The method was proved rapid, sensitive and reliable, and the result was satisfactory.Key words: capillary zone electrophoresis; paracetamol; calibration curve method; Content determination21目 录引言1一文献综述21.1 扑热息痛21.1.1 扑热息痛简介21.1.2 扑热息痛的药效学21.1.3 扑热息痛的药动学21.2 含量测定的分析方法31.2.1紫外可见分光光度法31.2.2 高效液相色谱法41.2.3 毛细管电泳法51.3 标准曲线法81.4 重结晶提纯固体方法91.5 本课题的研究目的与意义9二 实验部分102.1 实验仪器与试剂102.2 扑热息痛的提纯102.3 实验条件112.3.1波长的选择112.3.2电泳条件112.4 溶液的配制122.5 方法学验证122.5.1 线性范围122.5.2 准确度（回收率）132.5.3 精密度132.5.4 检出限和定量限132.5.5 样品稳定性13三 结果与讨论143.1 线性关系及检出限143.2 检出限及定量限143.3 精密度153.4 加标回收率153.5 稳定性163.6 实际样品分析163.7 小结16四 参考文献18致谢21附录22引言扑热息痛又名醋氨酚、对乙酰氨基酚、退热冰等。由于扑热息痛具有良好的解热镇痛作用，又被认为相对副作用小，故而应用广泛，且被许多复方制剂中列为主要成分。1893年，在某些服用了非那西丁的患者的尿液里发现了扑热息痛的存在，并浓缩成白色、稍有苦味的晶体。1899年扑热息痛被发现是退热冰的代谢产物，但是这些发现在当时并没有被重视。1946年美国止痛与镇静剂研究所拨款给纽约市卫生局研究止痛剂的问题。伯纳德布罗迪（BernardBrodie）和朱利叶斯爱梭罗德（JuliusAxelrod）被分配研究非阿司匹林类退热剂为何产生高铁血红蛋白症（一种非致命的血液疾病）这一副作用。1948年伯纳德和爱梭罗德发现退热冰的作用归功于它的代谢产物扑热息痛，因此他们提倡使用扑热息痛替代退热冰。1955年，扑热息痛在美国境内上市销售，商品名泰诺（Tylenol）。1956年，500 mg一片的扑热息痛在英国境内上市销售，商品名必理通（Panadol）。1963年，扑热息痛列入英国药典，并因其较小的副作用和与其它药物的相互作用而流行开来。毛细管电泳法1是近年来发展较快的一种分离、分析技术,是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。毛细管电泳法是一种快速、廉价、高分辨率的分析测试手段,在体内药物分析中的应用较为广泛。毛细管电泳法应用于体内药物分析的优越性比较明显:适应体内药物分析的痕量分析要求,分析速度快,试剂,样品的用量要求小等优点使毛细管电泳法具有广泛的应用前景。但是,体内药物分析自身的特点也制约了毛细管电泳法的广泛应用,其突出的矛盾在于体内药物分析的样品过于复杂,而毛细管电泳法分析测试的载样量过小,因此,解决样品制备的快速,自动化问题23将会大大促进毛细管电泳法在体内药物分析中的应用。本实验利用毛细管电泳法对扑热息痛标准样进行方法学考察，分别对其稳定性、精密度进行考察，探究扑热息痛含量测定的检出限及定量限，并探讨它们测量的线性范围。同时对不同样品中扑热息痛的含量进行测定，确定不同样品中扑热息痛的含量。一文献综述1.1 扑热息痛1.1.1 扑热息痛简介扑热息痛的化学名为对乙酰氨基酚又名4-（N-乙酰氨基）苯酚，英文名为Paracetamol 分子式C8H9O3N。结构式：扑热息痛属于乙酰苯胺类解热镇痛药, 1878年由Morse首次合成, 1893年由VonMering首先用于临床，在美国1955年就成为非处方药，我国于20世纪50年代末期开始生产4。对乙酰氨基酚是一种常用的解热镇痛药，其解热作用缓慢而持久，与其他药品相比，刺激性小、极少有过敏反应，毒性较低，尤其适合儿童服用。它是一种白色结晶或结晶性粉末，熔点168172 ，无臭，味微苦，在热水或乙醇中易溶，在丙酮中溶解，水中略溶，在45 以下稳定，但如果暴露在潮湿的空气中会水解成对氨基酚，然后进一步发生氧化，颜色逐渐变成粉红色，棕色，最后成黑色，因此应在阴冷干燥处密闭保存5。1.1.2 扑热息痛的药效学该品镇痛作用的机制尚未十分明了，可能是通过抑制中枢神经系统中前列腺素的合成(包括抑制前列腺素合成酶)以及阻断痛觉神经末梢的冲动而产生镇痛，后者可能与抑制前列腺素或其他能使痛觉受体敏感的物质(如5-羟色胺、缓激肽等)的合成有关。解热作用则可能是通过下视丘体温调节中枢而起作用，可能与下视丘的前列腺素合成受到抑制有关。1.1.3 扑热息痛的药动学口服后自胃肠道吸收迅速、完全( 在高碳水化合物饮食后服药可能降低吸收)，吸收后在体液中分布均匀，约有 25与血浆蛋白结合。小量时(血药浓度60 g/ml)与蛋白结合不明显，大量或中毒量则结合率较高，可达43。该品9095在肝脏代谢，主要与葡糖醛酸、硫酸及半胱氨酸结合。中间代谢产物对肝脏有毒性作用。半衰期一般为14小时(平均2小时)，肾功能不全时不变,但在某些肝脏疾患者可能延长，老年人和新生儿可有所延长， 小儿则有所缩短。口服后0.52小时血药浓度可达峰值， 剂量在650 mg 以下时血药浓度为520 g/ml， 作用持续时间为34小时。哺乳期间妇女服用该品650 mg，12小时报乳汁中浓度为1015 g/ml； 半衰期为1.353.5小时。该品主要以与葡糖醛酸结合的形式从肾脏排泄，24 小时内约有3以原形随尿排出。具有退热镇痛作用，通过升高痛阈而达到止痛目的；通过对下丘脑体湿调节中枢产生作用而达到退热目的。能有效地缓解疼痛和发热，用于头痛、关节疼痛、肌肉疼痛、牙痛、痛经、产后和手术后疼痛或感冒引起的发热及其它不适症状。格列本脲3.5 mg，结果显示两者的药动学参数没有变化，另外本品对葡萄糖和胰岛素的药效学没有影响，合用时不用调整剂量。抗真菌药伊曲康唑在酸性条件或餐后用药利于吸收，如与泮托拉唑合用，可随可乐饮料服用伊曲康唑。1.2 含量测定的分析方法目前用来分析样品含量的分析方法有滴定法、紫外分光光度法、荧光分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法等。据报道显示扑热息痛含量测定的方法主要有紫外分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法。1.2.1紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法6就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。它广泛用于各种物料中微量、超微量和常量的无机和有机物质的测定。目前广泛地应用于化工、冶金、地质、医学、食品、制药等部门及环境监测系统。紫外可见分光光度法比较成熟，可测元素多，灵活性强。有些大型仪器不易解决的分析问题，光度法可以发挥作用。它主要由光源、单色器、吸收池、检测器和记录仪组成。 紫外分光光度法的原理紫外-可见分光光度法是根据物质分子对波长为200800 nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立的光谱分析方法。单色光辐射穿过被测物质溶液时,被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比,即朗伯-比尔定律,这是吸收光谱法定量的理论依据,其关系式如下:A= eCL 1-1式中 A：吸收度；e：吸收系数，即单位浓度、单位液层厚度的吸收度数值； C：溶液浓度；L：液层厚度。 紫外可见分光光度法的特点1） 与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快；2 ）灵敏度高；对元素测定的灵敏度大大提高了一步。特别是由于多元络合物和各种表面活性剂的应用研究，使许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到几十万。3）选择性好；目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定，如钴、铀、镍、铜、银、铁等元素的测定，测定结果良好。 4）精密度和准确度较高；误差小，相对误差在13%范围内，若采用示差分光度法测量，结果将更精确。5）用途广泛。还有一点就是 分析成本低、操作简便、快速。1.2.2 高效液相色谱法高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。近年来，高效液相色谱法也应用于一些药物的含量测定，如扑热息痛，盐酸环丙沙星等7-11。 高效液相色谱法的原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 高效液相色谱法的特点 1高压：液相色谱法以液体为流动相(称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。2高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达110 mL/min。3高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。4高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。5适应范围宽：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物的分离分析。1.2.3 毛细管电泳法毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）又叫高效毛细管电泳12（HPCE），是近年来发展最快的分析方法之一。经典电泳技术作为一种工具出现已有近百年的历史，但直到1967年，毛细管区带电泳（CZE）才由瑞典科学家Hjerten13首先提出来。他最早在高电场、直径为3 mm的毛细管中进行自由溶液的电泳分离。1974年，Vertanen1415提出用200-500 m内径的毛细管作电泳分离，发展了Hjerten的方法。1981年Jorgenson和Lukacs16使用75 m内径的玻璃毛细管，利用电迁移进样和荧光进行在线检测，在30 kV下使丹酰化氨基酸得到了高效的分离，获得理论塔板数高达4105片/m的高分离性能，并且深入地阐明了CE的一些基本性能和分离的理论依据。这一开创性的成果成为毛细管电泳发展史上的一个里程碑，这便是我们今天所说的现代毛细管电泳。1984年，Terabe17运用含十二烷基硫酸钠（SDS）胶束的缓冲溶液分离了中性组分，从而建立了胶束电动毛细管色谱（MECC），使许多电中性化合物的分离成为可能，大大拓宽了CE的应用范围。1985年，Hjerten18首次引入了毛细管等电聚焦（CIEF）的概念。1987年，Karger19改进了凝胶填充技术，提高了CGE的分离效率。1988年以后，HPCE商品仪器的问世及高灵敏度柱上检测器的发展，使高效毛细管研究在世界范围内蓬勃开展，促进了HPCE技术和理论的迅猛发展。1991年，Jorgenson和Monnig首次提出了高速毛细管电泳(high-speed capillary electrophoresis或fast capillary electrophoresis,HSCE或fast-CE)技术,即采用细内径和较短的毛细管来实现高速分离。自此以后，CE的研究成为分析化学领域的热门课题，人们竞相展开了对毛细管电泳理论、仪器、柱技术、与其他分析手段联用技术及在生命科学医药食品应用上的全面研究。 毛细管电泳法的装置毛细管电泳系统的基本结构20,21:1、高压电源；2、毛细管；3、缓冲液池；4、检测器；5、加样系统。图1 毛细管电泳装置示意图 Figure 1 capillary electrophoresis schematic diagram进样压力：虹吸进样进样方式：正极进样，负极检测。进样高度差：10 cm。 毛细管电泳法的原理毛细管电泳的基本原理是基于离子或者荷电子在一定pH的自由溶液中以电场为驱动力，在毛细管中按照电泳淌度的不同进行分离的一种模式22。在毛细管电泳中有两种基本策略可以实现手性分离，一是构建手性分离环境，二是手性消除。由于手性消除反应需要昂贵的手性反应试剂，而且产物的手性可能不得恢复，所以多数人不愿意采取这种方法，转而采用构建手性环境的方法。手性环境可以通过三种方法来构建：1. 使用手性添加剂。2. 使用手性添加毛细管。3. 使用手性涂层毛细管。其中除毛细管等点聚焦外，其他分离模式都可以用于手性分离23，是较为有效的手性拆分技术。 毛细管电泳法的分离模式目前，根据分离机理不同，毛细管电泳大致分为有以下几种模式24 ：1. 毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)，又称毛细管自由电泳，用以分析带电溶质。为了降低电渗流和吸附现象，可将毛细管内壁涂层。它是毛细管电泳中最基本、应用最普遍的一种模式。前述基本原理即是毛细管区带电泳的基本原理。迄今为止 CZE 仍是应用最多的模式。2. 毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)。在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶，主要用于测定蛋白质、DNA等大分子化合物。另有将聚合物溶液等具有筛分作用的物质，如葡聚糖、聚环氧乙烷，装入毛细管中进行分析，称毛细管无胶筛分电泳，故有时将此种模式总称为毛细管筛分电泳25 ，下分为凝胶和无胶筛分两类。3. 胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC)。在缓冲液中加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠，形成胶束，被分离物质在水相和胶束相（准固定相）之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。本模式能用于中性物质的分离。4. 毛细管电色谱(capillary electrochromatogryphy, CEC)。它是将高效液相色谱的固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂布固定相，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程，此模式兼具电泳和液相色谱26的分离机制。5. 毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing, CIEF)。它是通过内壁涂层使电渗流减到最小，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别为酸和碱，加高电压后，在毛细管内建立了pH梯度，溶质在毛细管中迁移至各自的等电点，形成明显区带，聚焦后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH使溶质通过检测器。6. 毛细管等速电泳(capillary esotachophoresis, CITP)。采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离。以上各模式以1 、2 、3 种应用较多。此外，还有在这些CE基本分离模式基础上利用各种技术建立起来的特殊的分离模式，如亲和毛细管电泳(利用生物分子或其他受体分子与其相应的专一分子可逆亲和特性来进行电泳分离)，毛细管矩阵电泳27(大量毛细管平行分离)微毛细管电泳28(将微系统技术应用于CE，把化学反应的产物引入毛细管进行电泳分离)等。 毛细管电泳法的特点毛细管电泳除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外29，其仪器结构也比高效液相色谱简单。毛细管电泳只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。前三个部件均易实现，困难之处在于检测器，特别是光学类检测器。由于毛细管电泳溶质区带的超小体积的特性导致光程太短，而且圆柱形毛细管作为光学表面也不够理想，因此对检测器灵敏度要求相当高30。 毛细管电泳发在药物分析中的应用前景尽管毛细管电色谱(CEC)技术的发展历史并不长,但作为一个新兴的分离分析技术,其研究和发展的生命力最终必将体现在解决一些实际样品分离分析时所具有的优越性,因此,CEC技术发展到一定的阶段后必定会伴随着大量的实际应用,其结果又将促进CEC技术的研究和开发。本文将从已有的大量文献报道中筛选出一些比较有代表性的应用实例进行介绍。高效毛细管电泳（HPCE）已应用到分析、分离的各个方面，且具有高灵敏度、高速、样品耗用量少、重现性好、自动化等优点，随着商品化仪器的不断改进，必将在分析领域得到更为广泛的应用。1.3 标准曲线法标准曲线法也称外标法或直接比较法，是一种简便、快速的定量方法。具体方法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与待测组分相同的色谱条件下，等体积准确进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准曲线，此标准曲线应是通过原点的直线。标准曲线的斜率即为绝对校正因子。在测定样品中的组分含量时，要用与绘制标准曲线完全相同的色谱条件作出色谱图，测量色谱峰面积或峰高，然后根据峰面积和峰高在标准曲线上直接查出注入色谱柱中样品组分的浓度。标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。1.4 重结晶提纯固体方法重结晶提纯法31是有机反应分离固体粗产物的最常用的方法之一，其原理是利用混合物中各组分在某种溶剂中的溶解度不同，或在同一溶剂中不同温度时的溶解度不同，而使它们分离开来。重结晶提纯法的一般过程：选择溶剂；溶解固体；除去杂质；晶体析出；晶体的收集与洗涤；晶体的干燥32。其中，除去杂质步骤是重结晶操作关键步骤之一，主要采用趁热过滤的方法除去不溶性杂质，活性炭吸附有色或某些树脂状、悬浮状颗粒。趁热过滤是重结晶操作成功与否的关键，如果操作不当，会导致产品的大量损失。传统的趁热过滤操作是采用热水漏斗过滤，理论上说热水漏斗在能起到保温作用，使漏斗内滤纸上溶液的温度基本保持不变。但实际操作中发现，用热水漏斗过滤的方法很难保持过滤溶液的温度，特别是在环境温度不高的情况下，溶液受环境温度的影响非常大，溶液温度下降很快，在滤纸上很快就有大量的晶体析出。1.5 本课题的研究目的与意义以扑热息痛为研究对象，以毛细管电泳法3335为实验手段，用方法学做标准曲线，找出检测限、定量限、线性范围，检验其稳定性、精密度。同时测定不同样品中扑热息痛的含量。并与紫外分光光度法、高效液相色谱法3640进行比较。二 实验部分2.1 实验仪器与试剂HV-30I高压电源北京彩陆科学仪器有限公司UV-K-2501型紫外检测器北京彩陆科学仪器有限公司CL1030高效毛细管电泳仪北京彩陆科学仪器有限公司UV-1201型紫外可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司pHS-25型pH计上海精科雷磁公司DL-180型超声波清洗机浙江省象山县石油海天电子仪器厂BS210 S型电子天平北京赛多利斯天平有限公司二次蒸馏水实验室自制熔融石英毛细管（50 mm I.D.）河北永年锐沣色谱器件有限公司XT4A 显微熔点测定仪（控温型）北京市科仪电光仪器厂氢氧化钠（分析纯）沈阳化学试剂厂硼砂（分析纯）开源化学试剂厂扑热息痛实验室自制2.2 扑热息痛的提纯称取粗扑热息痛少量，置于250 mL烧杯中，加入适量纯水，加热至沸腾，直至扑热息痛溶解，若不溶解，可适量添加少量热水，搅拌并热至接近沸腾使扑热息痛溶解，稍冷后，加入适量活性炭于溶液中，煮沸510 min，趁热用放有折叠式滤纸的热水漏斗过滤，用一锥形瓶收集滤液。在过滤过程中，热水漏斗和溶液均用小火加热保温以免冷却。滤液放置冷却后，有扑热息痛晶体析出，抽气过滤，用玻璃钉或玻璃瓶塞压挤晶体，继续抽滤，尽量除去母液，然后进行晶体的洗涤工作。取出晶体，放在表面皿上晾干，称重41。用XT4A 显微熔点测定仪（控温型）测其熔点是172 ，即为扑热息痛标准品。2.3 实验条件2.3.1波长的选择将扑热息痛的标准品溶于二次蒸馏水制成约10 ug/mL的溶液，在200400 nm范围内紫外扫描，其紫外扫描图见图 1。扑热息痛在243 nm处有最大吸收，故选择243 nm为最佳检测波长。图2 扑热息痛在200400nm范围内的紫外扫描图Figure 2 ultraviolet scan of paracetamol in 200 400 nm range 2.3.2电泳条件实验考察了硼砂、硼砂-氢氧化钠、磷酸二氢钠硼砂等作背景电解质，结果表明50 mol/L硼砂为背景电解质时，扑热息痛样品峰型最好，基线噪音最小；实验继续考察了背景电解质溶液pH为8.69.5时扑热息痛样品出峰情况，得出最佳pH 9.23，此时基线较稳，信噪比较高且稳定，而且峰型也最好；同时实验考察了分离电压在1020kV范围内，扑热息痛出峰情况，最终选择分离电压15kV，在此条件下，扑热息痛样品10 min内出峰。由此得出最佳电泳条件：背景电解质溶液：精密称取0.4768 g硼砂适量溶于蒸馏水中，用10%磷酸和0.1 M 氢氧化钠调至pH=9.23。操作条件：背景电解质和样品溶液均经0.45 mm微孔滤膜过滤，并超声脱气。毛细管：总长50 cm，有效长度45 cm，内径50 mm。洗柱方式 ：毛细管柱依次用0.1 mol/L 氢氧化钠液、二次蒸馏水、背景电解质溶液各冲洗10 min后进样；进样间用二次蒸馏水、背景电解质溶液各冲洗5 min后进行下次进样。进样方式：采用虹吸进样，进样高度差10 cm，进样时间10 s，正极进样负极检测，检测波长243 nm。进样温度：室温（20 ）。2.4 溶液的配制标准品储备溶液的配制：精密称取扑热息痛标准品0.0100 g，置10 mL容量瓶中，以二次蒸馏水定容至刻度，摇匀，使其浓度为1.0 mg/mL，再移取5.0 mL 1.0 mg/mL的溶液, 置25 mL容量瓶中，以二次蒸馏水定容至刻度，摇匀，使标准品浓度为200 mg/mL ,4 冰箱保存。样品储备溶液的配制：分别精密称取10种扑热息痛样品0.0100 g，置10 mL容量瓶中，以二次蒸馏水定容至刻度，摇匀，使其浓度为1.0 mg/mL，再移取5 mL 1.0 mg/mL的溶液, 置25 mL容量瓶中，以二次蒸馏水定容至刻度，摇匀，使样品浓度为200 mg/mL 。样品供试溶液的配制：精密量取样品储备液4 mL，置10 mL容量瓶中，以二次蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得80 mg/mL ，4冰箱保存。硼砂适量溶于蒸馏水中，摇匀即可。0.1 mol/L 氢氧化钠溶液的配制：称取氢氧化钠约0.4 g，溶解于100 mL蒸馏水中，摇匀即得。2.5 方法学验证2.5.1 线性范围线性是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接成正比关系的程度，可用一储备液稀释或分别精密称样，制备一系列供试液样品的方法进行测定，至少制备5份供试样品。2.5.2 准确度（回收率） 准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率（%）表示，在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价。2.5.3 精密度精密度是指在规定的测定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，一般用偏差、标准偏差般或相对标准偏差表示。2.5.4 检出限和定量限检出限系指试样中被测物能被检测出的最低量。常用信噪比法确定检出限，一般以信噪比为3：1或2：1时相应的浓度或注入仪器的量进行确定；定量限系指样品中被测定物能被定量测定的最低量，一般以信噪比为10：1时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。2.5.5 样品稳定性对含药样品在不同条件下以及不同存放时间内进行稳定性考察，以确定样品存放条件和时间，一般偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。三 结果与讨论3.1 线性关系及检出限分别精密量取标准品储备液0.5mL、1 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL、4 mL、5 mL至10 mL容量瓶中，以二次蒸馏水定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度均为10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL、60 mg/mL、80 mg/mL、100 mg/mL的标准溶液。采用CZE进行检测，以峰面积A对分析物的质量浓度C（mg/mL）进行线性回归，扑热息痛的线性回归方程及其相关系数见表。以峰面积作纵坐标，浓度作横坐标，求得扑热息痛的标准曲线，见图，标准曲线r为0.9991，说明峰面积和浓度呈良好线性关系。表1 相关系数表Table 1 phase decimal relationshipc(ug/mL)AAA AverageRSD（%）102790268028292766.3332.28205520549256015537.6671.1040103601086310686105232.766016133167641692916608.672.148022240222452196022148.330.7010027862285602830228241.331.02图3 扑热息痛的标准曲线Figure 3 acetaminophen standard curve3.2 检出限及定量限 精密量取一定量的标准品储备溶液，用二次蒸馏水溶解稀释配制成0.520 mg/mL 的一系列溶液，进样10 s记录电泳图，以信噪比为3时的浓度为检出限，测得扑热息痛的检出限为0.91 mg/mL；当信噪比为10时的浓度即为定量限，测得扑热息痛的定量限为3.0 mg/mL。3.3 精密度分别精密量取标准品储备液1 mL、2.5 mL、4 mL至10 mL容量瓶中，以二次蒸馏水定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度均为20 mg/mL、50 mg/mL、80 mg/mL的标准溶液。低、中、高3个浓度的扑热息痛对照品溶液:重复进样6次。校正峰面积之比的日内精密度RSD在1.5%以内。表2 精密度Table 2 precisionc(ug/mL)AAAAAAAverageRSD(%)205596549055205492560155205536.50.825013799138751384513820138501390113848.330.488022160219962224022245219602236022160.171.333.4 加标回收率 分别精确量取1.5 、2.0 、2.5 mL 的扑热息痛标准品的储备液分别置于含有2.0 mL质量浓度为200 mg/mL的扑热息痛样品储备液的10 mL容量瓶中，用二次蒸馏水稀释定容，得到添加扑热息痛样品质量浓度均为40+30、40+40、40+50 mg/mL的低、中、高供试液进行加样回收实验，平行测定3次，计算方法的回收率和标准偏差，结果列于表。从表可以看出本方法具有良好的准确度和精密度。表3 实际样品回收率的测定（n=3）Table 3 real samples the determination of recovery (n = 3)Added（mg/mL）AAAAverageFound(mg/mL）Recovery(%)Average Recovery(%)RSD(%)40+3019706199742031219997 69.0272 96.76 99.861.52 40+4023954230802300223345 80.1320 100.33 2.26 40+5027102268302615826696 91.2479 102.50 1.82 3.5 稳定性 分别在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h取扑热息痛供试液60 mg/mL进样进行检测分析，记录电泳图，计算峰面积的精密度如表所示，峰面积的RSD为1.62%，说明样品8h内稳定。表4 峰面积的精密度Table 4 the precision of the peak areaAAAAverageAverageRSD（%）0h15394152521448115042 15320 1.621h16109141241400614746 2h14634153641484614948 4h15788158981377215153 6h15090161281708116100 8h16583150901612815934 3.6 实际样品分析精密称取实验室合成的扑热息痛适量，按的条件进行含量测定，共测试10种，结果见表，结果表明本方法可用于实际样品中扑热息痛的测定。表5 实际样品中扑热息痛测定结果（n=3）Table 5 actual samples in measuring results of acetaminophen (n = 3)SampleQuality(g)AAAAverageFound(mg/mL)Real value(mg/mL)%RSD(%)样品10.010222045200872203821390 73.65 72.20 90.255.28样品20.010222560224092253422501 77.33 75.82 94.770.36样品30.010223219231062516523830 81.74 80.14 100.179.21样品40.010024012220902082222308 76.69 76.69 95.867.20样品50.010022560224092130422091 75.97 75.97 94.963.10样品60.010322100223152214222186 76.29 74.06 92.570.42样品70.010224946230902507222186 83.15 81.52101.903.45样品80.010123903237862081322834 78.44 77.66 97.077.84样品90.010223219231062126522530 77.43 75.91 94.896.64样品100.010421658220452139721700 74.67 71.80 89.751.503.7 小结本文采用毛细管区带电泳法对扑热息痛的含量进行了研究。在缓冲溶液为50 mmoL硼砂（pH=9.23）、分离电压15 KV、检测波长243 nm的优化条件下进行检测。通过方法学验证，有良好的线性关系最优化的测定条件即扑热息痛线性范围为10100 mg/mL，检出限为0.91 mg/mL，定量限为3.0 mg/mL； 3次平行进样的相对标准偏差(RSD)小于2.30%，加标回收率(n=3)为96%101%，RSD小于2.30%，稳定性的RSD为1.62%，日内精密度RSD在1.50%以内。以上结果表明，此方法简便，可靠。通过建立简便快速的毛细管电泳测定方法以获得不同样品中的扑热息痛含量，可清楚的了解这些样品的含量差别。利用毛细管区带电泳法可以有效地控制药品的质量，保证产品质量的相对稳定，对实现其内在质量的综合评价和全面控制有着十分重要的作用。四 参考文献1 Blaine EH, Fanelli GM Jr, Irvin JD, et al. 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