《赵有龙开题报告》PPT课件.ppt

学位论文开题报告 东亚蝎毒素AGAP中枢镇 痛机制的研究 报告人：赵有龙 指导老师：张双全教授 曹鹏博士 目 录 前言 选题依据及意义 国内外研究进展 研究目标和内容 技术路线 进度安排 预期结果及创新之处 前 言 东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch，简称 BmK )广泛分布于我国的辽宁、山东、河南 等省和东亚地区。中医临床所用的全蝎主要 是指东亚钳蝎，起主要生物活性功能的便是 全蝎尾部所产的毒液。 蝎毒素 蝎毒中含有多种生物活性成分，主要有由蛋 白质（蝎毒素）和非蛋白质两组分组成。 根据其肽链的长短可分为蝎长肽毒素和蝎短 肽毒素 蝎毒素按其作用受体的不同可分为： 钠离子通道蝎毒素 蝎长肽毒素 （ 6076 个aa） 钾离子通道蝎毒素 钙离子通道蝎毒素 氯离子通道蝎毒素 蝎短肽毒素 （2840 个aa） 东亚钳蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽(analgesic antitumoral peptide，AGAP)是刘岩峰在 2003年从东亚钳蝎蝎毒中分离纯化得到的单 组分活性肽。AGAP成熟肽含有66个aa，因 此属于蝎长肽毒素。 选题依据及意义 选题依据： 2003年刘岩峰等运用小鼠醋酸扭体模型和热 板法实验研究表明,AGAP活性肽具有较强的镇 痛活性。 本实验室于杰淼师兄通过小鼠醋酸扭体实验 证明原核重组表达的AGAP具有明显的镇痛作 用。而且，与相同质量的吗啡相比，重组 AGAP具有更好的镇痛效果。 重组AGAP对小鼠的镇痛作用的扭体实验 正常 扭体 扭体 扭体 1996年李宁等研究证明蝎毒素有很强的中枢 镇痛作用, 且镇痛作用强于吗啡4倍以上。 大量实验表明：与其他镇痛药相比， 蝎毒素 具有较好的修复受损神经的功效，无其他副 作用等优特点。 蝎毒素AGAP成熟肽同源性比较 AGAP与其他九种蝎毒素同源 性非常高，其中与 Bukatoxin的同源性最高， 达到86.36%。经文献考证， 这九种蝎毒素基本上均为钠 离子通道蝎毒素，由此推论 AGAP可能是一种钠离子通道 蝎毒素，影响细胞膜上的钠 离子电流。 钠离子通道简介： 钠离子通道由4个亚基 和2个亚基组成。 钠离子通道亚型分类 钠离子通道根据亚基的 不同分为十种，其中跟镇 痛相关的主要有Nav1.3、 Nav1.7、Nav1.8、和 Nav1.9。 鼠的亚基系统发生树 背根节神经元是疼痛感觉 传入的第一级神经元 下丘脑 大脑皮层 1997年张瑞德等研究了辽宁产东亚钳蝎毒的 某些活性物质对海马CA1区痛放电的抑制作 用，其作用途径：一方面通过激活内源性阿 片系统，另一方面还有其它途径；乙酰胆碱 、五羟色胺与增强蝎毒的镇痛作用有密切的 关系，蝎毒可增加乙酰胆碱的释放，从而协 同蝎毒的镇痛作用 选题意义： 由于AGAP与其他镇痛药相比具有更好的应 用价值，本文通过研究其镇痛作用的机制， 进而为AGAP作为镇痛药物应用于临床实验 提供科学依据。 国内外研究进展 国内研究进展 中医临床所用的全蝎主要是指东亚钳蝎，在我国中 医史上已有2000多年应用历史。 自宋代以来，东亚钳蝎全虫便被视为一种名贵中药 ，用于镇痉息风、治疗风湿麻痹痛等。 根据本草纲目记载，蝎子具有攻毒散结、通络 止痛的作用。 中国科学院上海生理所自70年代末开始了东亚钳蝎 神经毒素的生化与镇痛药理学研究。 我国自20世纪80年代以来对蝎毒镇痛作用开 展了广泛动物实验研究。 2003年刘岩峰等通过小鼠扭体和热板实验初 步研究表明AGAP具有镇痛效应。 国外进展： 目前，国外对蝎毒新成分的纯化、活性、机 理研究相当活跃，其中，蝎毒功能的研究中 离子通道是一个焦点。 研究目标和内容 研究目标： 应用多种分子生物学技术从神经中枢系 统方面研究AGAP作用的受体及其下游 的信号通路，确定AGAP中枢镇痛的分 子机制。 研究内容： 1、在体外分离单个背根神经细胞，借助Na+荧光染 料SBFI 和钠离子通道阻断剂TTX证明AGAP镇痛作 用的受体是钠离子通道 2、在体内，脊髓鞘内注射反义核苷酸研究AGAP作 用受体亚型的类别。从mRNA和蛋白质水平分析 AGAP的作用是否与受体亚型的表达量有关。制作 背根神经组织冰冻切片确定AGAP的镇痛作用是否 与受体亚型的重新分布有关 。 3、应用纳络酮特异性抑制阿片受体信号通路，检 验AGAP镇痛机制与阿片受体类型的关系。 4、小鼠侧脑室给药后分离脑组织测定5-羟色 胺(5-HT) 的含量说明AGAP是否通过提高中 枢5 -HT的含量发挥作用。 5、mRNA水平上测定胞内痛指标cfos的表 达量，用于说明AGAP镇痛是否与调节c-fos 基因的表达量有关 。 其镇痛作用是否 与其受体亚型 的表达量有关 激光共聚焦技术确定其受体为细胞 膜上的钠离子通道 确定作用于钠离子通 道受体亚型的类别 利用反义核苷酸 实时定量PCR 免疫组化 激光共聚焦技术 是否与钠离子通 道亚型在细胞上 的重新分布有关 细胞膜上受体的研究 AGAP 胞内信号通路的研究 （研究路线） 技术路线 背根神经 AGAP镇痛机制 是否与阿片受体 信号通路有关 AGAP镇痛机制是否 与中枢5 - 羟色胺的 含量有关 AGAP镇痛是否与 调节c - fos 基因的 表达有关 小鼠热板实验 脑组织中 5 - 羟色胺 含量的测定 实时定量 PCR 侧脑室给药 细胞内信号通路的研究 进度安排 2009年7月2009年10月：阅读文献设计实验方案 2009年10月2009年11月：证明AGAP作用于细胞 膜上的受体是钠离子通道 2009年11月2010年1月：研究AGAP作用于钠离子 通道亚型的类别以及是否与表达量和重新分布有关 2009年12月2010年1月：AGAP对脑中枢神经的镇痛 实验 2010年2月2010年6月：撰写毕业论文，准备答辩 。 预期结果及创新之处 预期结果: 1、AGAP作用于细胞膜上的受体是钠离子通道，且受体的亚型 可能是Nav1.7、 Nav1.8和Nav1.9中的一种。 2、AGAP镇痛机制与阿片受体信号通路无关。 3、AGAP通过提高中枢5-羟色胺(5-HT)的含量来发