《酶工程制药》PPT课件-2.ppt

第八章 酶工程制药 第一节 酶工程概论 第二节 药用酶的来源和生产 第三节 固定化酶工程 第四节 酶工程应用实例 第五节 酶工程研究进展 第一节 酶工程概论 一、酶的定义和分类 二、酶的特性 三、酶的来源 四、酶的生产菌种 五、产酶菌株的制备和优化 一、酶的定义和分类 酶的定义-酶是生物体内具有特殊催化功能的 蛋白质。 酶的分类-分为6大类 1、氧化-还原酶 2、转移酶 3、水解酶 4、裂合酶 5、异构酶 6、连接酶（合成酶） 二、酶的特性 1、专一性强 2、催化效率高 3、反应条件温和 4、酶活性的调控机制复杂 醛糖还原酶的活性中心 三、酶的来源 （一）来源类别 （二）利用微生物生产酶制剂的优点 （三）各种能够生产酶的微生物 （一）来源类别 1、酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物、微生物中 ，可以直接从生物体中分离提纯而获得，早期酶的生 产多是以动植物为主要原料提取而得。 2、人工合成酶的方法，目前还受到试剂、设备条件的限 制。 3、利用动物、植物细胞和组织培养方法来生产酶，由于 周期较长、成本较高，也存在一定难度。 4、利用微生物生产酶制剂。 （二）利用微生物生产酶制剂的优点 （1）能够生产酶的微生物 种类繁多，有较大的选择 余地。 （2）微生物繁殖快、培养 周期短、培养方法简便， 培养过程容易控制， （3）微生物具有较强的适 应性，能够培育出新的高 产菌株。 （三）各种能够生产酶的微生物 1、氧化-还原酶 （1）葡萄糖氧化酶（来源于霉菌） （2）D氨基酸氧化酶（来源于霉菌、肾脏） （3）尿激酶（来源于酵母菌、肾脏） （4）过氧化氢酶（来源于细菌、霉菌、红血球） （5）近氧化物酶（来源于植物） 2、转移酶 （1）转氨基酶（来源于细菌、动物肝脏） （2）核苷磷酸转移酶（来源于细菌） 3、水解酶 4、裂合酶 5、异构酶 3、水解酶 脂肪酶（来源于细菌、霉菌、胰脏） 5-磷酸二酯酶（来源于霉菌） 淀粉酶（来源于细菌、霉菌、胰脏、麦芽） 果胶酶（来源于细菌、霉菌） 纤维素酶（来源于霉菌、蘑菇） 半纤维素酶（来源于霉菌） 溶菌酶（来源于细菌、鸡卵白） 蜜二糖酶（来源于霉菌） 乳糖酶（来源于细菌、霉菌） 转化酶（来源于细菌、酵母） 透明质酸酶（来源于细菌、动物睾丸） 凝乳酶（来源于霉菌、小牛胃、羊胃） 天冬酰胺酶（来源于细菌） 脲酶（来源于豆科植物） 青霉素酰化酶（来源于细菌、霉菌） 氨基酰化酶（来源于细菌、霉菌、牛肾脏） 橙皮苷酶（来源于霉菌） 蛋白酶（来源于霉菌、放线菌、动物内脏、植物瓜果） 裂合酶和异构酶 4、裂合酶 天冬氨酸-脱羧酶（来源于细菌） -酪氨酸酶（来源于细菌） 延胡索酸酶（来源于细菌） 谷氨酸脱羧酶（来源于细菌） 5、异构酶 氨基酸消旋酶（来源于细菌、霉菌、酵母 ） 葡萄糖异构酶（来源于细菌、放线菌 四、酶的生产菌种 1、对生产菌种的要求 2、目前常用的产酶微生物 1、对生产菌种的要求 （1）产酶量高 （2）不是致病菌 （3）性能稳定，不容易变异、退化、不易感染噬菌体。 （4）能够利用廉价的原料，发酵周期短、易于培养。 2、目前常用的产酶微生物 大肠杆菌-用来生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半 乳糖苷酶。 曲霉（黑曲霉、黄曲霉）-用来生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、 葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶、脂肪酶。 枯草杆菌-用于生产a-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶。 啤酒酵母-用来生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶。 青霉菌-用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5-磷酸二酯酶、脂肪酶 。 木霉菌-用于生产纤维素酶。 根霉菌-用于生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶。 链霉菌-用来生产葡萄糖异构酶。 五、产酶菌株的制备和优化 1、产酶菌株的培养条件 2、菌种的分离筛选 3、菌种的变异诱导技术 4、原生质体诱导实际生产例子 1、产酶菌株的培养条件 （1）产酶促进剂 （2）影响酶产量的各种因素 （3）诱导剂和抑制剂 （1）产酶促进剂 在酶制剂的生产过程中，如果添加少量的某种物质就能增 加酶的产量，则这类物质就称为产酶促进剂。 产酶促进剂多数是酶的诱导物、或者是表面活性剂，常用 的产酶促进剂有： （A）吐温-80 （B）脂肪酰胺磺酸钠 （C）聚乙烯醇 （D）糖脂 （E）乙二胺四乙酸（EDTA） （2）影响酶产量的各种因素 A、温度-各种产酶微生物对于温度的要求是各不相同的。 细菌：35-37度 霉菌：30度 酵母菌：30-35度 B、PH值-通过掌握原料的配比保持一定的C/N水平、或者通过添加缓 冲剂、能够控制发酵液的PH值。 C、通气量（供氧量） 讫今为止，产酶和微生物都是需氧性的微生物。 在液体深层发酵中，微生物利用的氧必须是溶解于培养基中和溶解氧。 空气中的氧气-培养基溶解氧-透过细胞膜进入原生质。 精确测定时采用溶氧仪。 D、搅拌-搅拌可将泡沫打碎、增加氧气的溶解速度、加强了液体的湍 流作用，有利于营养物质与菌体细胞的接触，促进细胞新陈代谢。 E、泡沫 E、泡沫 酶制剂发酵过程中泡沫较多。泡沫的存在会阻止CO2的排 除、同时直接影响O2的溶解。 排除常常采用：机械力消泡沫法、化学消泡剂消泡沫法。 常用的消泡剂有：天然油类、矿物油类、醇类、脂肪酸类 、胺类、酰胺类、醚类、磷酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷 等等物质。 国内酶制剂工业常用的消泡剂为： 甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚） 泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油醚） （3）诱导剂和抑制剂 某些酶反应，当培养基中不存在诱导物质时，其酶的合 成就受到抑制，而当添加诱导物质时，酶的合成就能顺 利进行，这类物质称作诱导剂。 使用某些酶的抑制剂常常能够促进酶的合成，如在多粘 芽孢杆菌的培养基中添加淀粉酶抑制剂S-AI，能增加淀 粉酶的产量。 在酶的生产中，加入适量表面活性剂，也能提高酶制剂 产量，如用爪哇真青霉生产纤维素酶时，如果添加0.1% 的吐温-80，则纤维素酶的产量可提高4倍。 2、菌种的分离筛选 （1）含菌样品质采集 （2）富集培养 （3）菌种纯化 3、菌种的变异诱导技术 （1）采用物理、化学方法进行诱导 物理方法-紫外线、X射线、-射线、高能电子、快速中子。 化学方法-亚硝基胍、亚硝酸。 （2）采用基因工程技术进行诱导 德国的生物技术人员，提取出大肠杆菌的青霉素酰化酶基因，通过质粒pBR233 ，克隆到宿主大肠杆菌中，新构建的工程菌，其产酶能力提高了50倍。 在国内，有人将产生葡萄糖异构酶的放线菌基因，通过质粒pBR233，克隆到宿 主大肠杆菌中，新构建的工程菌，其表观活力提高了5倍。 有人在研究霉菌的淀粉酶基因、或者纤维素基因克隆到酵母菌中，一旦获得成功 ，就能够利用淀粉、纤维素为原料，以酵母菌作为载体，通过发酵来生产酒 精。 （3）采用原生质体融合技术进行诱导 原生质体融合育种的频率要高于普通杂交的方法。不同种属之间也可进行融合。 在曲霉与曲霉、青霉与青霉、链霉菌与链霉菌、芽孢杆菌与芽孢杆菌之间的融合 应用较多。 4、原生质体诱导实际生产例子 蛋白酶产生菌种之间的原生质体融合共分为7步： A、使用的亲本菌株 B、菌株标记的获得 C、原生质体的制备 D、细胞的再生 E、原生质的融合 F、融合子的继代培养、检验和生产性能 A、使用的亲本菌株 二亲本为： （1）枯草杆菌AS1.398 （2）地衣芽孢杆菌AS1.807 二者都是野生型，对利福平和链霉素敏 感。 B、菌株标记的获得 采用紫外线进行诱变， 筛选营养缺陷型菌株、和抗药性菌株， 经过十代以上传代，形成稳定的突变菌株 。 C 、 原 生 质 体 的 制 备 二亲本接种入完全培养基，37摇瓶培养20小时 离心收集菌体，悬浮于0。55mol的NaCl溶液中 经4000r/min离心15分钟，洗涤2-3次，离心，弃去上 清液 菌体细胞悬浮于SMM缓冲液中 加入采用SMM液配制的溶菌酶1000单位/ml，置恒温水 浴溶解细胞壁， 定时取样镜检，并用计数板计数。 待原生质球形成之后，以4000-6000r/min离心2次，每 次15分钟， 洗涤2-3次、离心 放于无菌蒸馏水中，使原生质体膨胀 适当稀释，涂布于完全培养基上 32下、培养20小时 得原生质体 D、细胞的再生 取原生质体，放入0.55mol的NaCl溶液之中 适当稀释，涂布于完全培养基上 32下、培养24小时 得原生质体再生的细胞 E、原生质的融合 取等量的二亲本原生质体、加入SMM溶液混匀 经4000r/min离心25分钟，弃上清液 加入由SMM配制的、含30%的、分子量为6000的PEG2-4ml 在40下搅匀、保温2-3分钟。 加入3-10倍量的SMM缓冲液 取适量（0.1-0.25ml/皿）涂布到含有二种抗生素的高渗完全培养基上， 链霉素含量为2000单位/ml， 利福平含量为10单位/ml， 32下、培养20-36小时 得初步的原生质体融合子 F、融合子的继代培养和检验和生产性能 将初步的原生质体融 合子在含有链霉素+ 利福平的平板培养基 上连续传代，可以检 测出稳定的原生质体 融合子。 融合菌株的生产性能 比亲株高出30%。 第二节 药用酶的生产 一、激肽释放酶 二、双链酶 三、超氧化物歧化酶 四、链激酶 五、链道酶 六、弹性酶 七、胰酶 八、含糖蛋白酶 九、糜胰蛋白酶 十、淀粉酶 十一、菠萝蛋白酶 十二、-半乳糖苷酶 十三、天门冬酰胺酶 十四、尿激酶 一、激肽释放酶 1、药理功能-具有扩张血管的功能，并能提高血管通透 性，起到改善血液循环的作用。 2、临床应用-治疗动脉硬化、血管炎、四肢皮肤溃疡。 3、生产方法 （1）提取法生产-以猪的颔下腺为原料进行提取。 （2）提取法生产-以猪的胰脏为原料进行提取。 二、双链酶 1、药理作用-内含二种酶，二者合用可清除炎症物、脓块 、瘀血，促进外伤伤愈合。 （1）为链激酶（SK）、又称为溶栓酶。能溶解血栓和渗 出物的纤维部分。 （2）为链道酶（SD）、又称为脱氧核糖核酸酶。能够液 化死细胞 2、临床应用-治疗血肿、脓肿、骨髓炎、创伤性感染、溃 疡。 3、生产方法-细菌发酵法生产。 三、超氧化物歧化酶 1、药理作用-能专一性地清除人体内的超氧阴 离子自由基。 2、临床应用-治疗类风湿关节炎，自身免疫疾 病、心肌缺血、抗衰老、断肢再植、整形美容 。 3、生产方法 （1）提取法-从新鲜猪血中提取 （2）提取法-从玉米中提取 链激酶和链道酶 四：链激酶 链激酶（SK）称为溶栓酶。能溶解血栓和渗出物的纤维部分 。 生产方法-由-溶血性链球菌发酵生产 五：链道酶 链道酶（SD）又称为脱氧核糖核酸酶。能够液化死细胞。 发酵法生产-由-溶血性链球菌发酵生产。 六、弹性酶 1、药理作用-能够水解弹性蛋白、血纤维蛋白 、血红蛋白。 2、临床应用-用于治疗高血脂、慢性支气管炎 、动脉硬化、高血压、脂肪肝。 3、生产方法 提取法生产-以猪的胰脏为原料进行提取。 七、胰酶 1、药理作用-其成份为胰蛋白酶、胰淀粉酶、 胰脂肪酶。能够消化淀粉、蛋白质、脂肪。 2、临床应用-助消化，增加食欲。 3、生产方法 提取法生产-以猪的胰脏为原料进行提取。 八、含糖蛋白酶 1、药理作用-是一种蛋白质消化酶 2、临床应用-助消化，增加食欲 3、生产方法 提取法生产-以猪的胰脏为原料进行提 取。 九、糜胰蛋白酶 1、药理作用-是一种蛋白质消化酶 2、临床应用-助消化，增加食欲 3、生产方法 提取法生产-以牛羊的肠粘膜为原料进行提取。 十、淀粉酶 1、药理作用-是一种消化酶 2、临床应用-助消化，增加食欲 3、生产方法 发酵法生产-以黄曲霉发酵生产。 十一、菠萝蛋白酶 1、药理作用-具有消炎、抗水肿的作用 。 2、临床应用-治疗炎症、水肿、血肿、 支气管炎、肺之、乳腺炎、静脉炎。 3、生产方法 提取法生产-以菠萝的皮为原料进行提 取。 十二、-半乳糖苷酶 1：药理作用-消化酶，能够消化乳糖 2：临床应用-适用于婴儿乳糖消化不良。 3：生产方法 发酵法生产-以毛霉（米曲酶）发酵生产 。 十三、天门冬酰胺酶 （一）药理作用和临床应用 1、药理作用-对肿瘤细胞具有抑制作用 。 2、临床应用-抗肿瘤制剂 （二）生产方法 （二 ）生 产方 法 发酵法生产-以大肠杆菌发酵生产。 大肠杆菌种子级菌种 加入玉米浆，发酵罐、37下培养7小时 取发酵液，加入丙酮后压滤 滤饼风干，得干菌体 加入硼酸缓冲液，PH=8、37下提取 得提取液，加醋酸调节PH=4。3， 得沉淀物，即为干粗酶 加入甘氨酸，60热处理30分钟 得酶溶液，加入聚乙二醇，在不同的PH值下进行精制 得无热源酶液 冻干、无菌分装 得天门冬酰胺酶冻干制剂 十四、尿激酶 1、药理作用-是一种蛋白质水解酶，具 有溶血作用和降血压作用 2、临床应用-抗血栓 3、生产方法 提取法生产-以男性新鲜尿液为原料进 行提取。 第三节 固定化酶工程 一、酶和细胞的固定化 二、固定化酶的制备技术 三、固定化细胞的制备技术 四、固定化生物反应器 一、酶和细胞的固定化 （一）固定化酶的定义 （二）固定化生物催化剂的特点 （三）酶固定化的方法分类 （四）细胞固定化的方法分类 （五）固定化技术所用载体 （一）固定化酶的定义 固定化酶是指限制或者固定于特定空间位置的酶 ，具体来说，就是指经过物理、化学方法处理， 使酶变成不易随水流失的固定化催化剂。 制备固定化酶的过程称为酶的固定化。 酶可以采用经过分离后高纯度的提纯酶、也可以 是菌体细胞碎片上的酶系，甚至可以是死细胞上 的酶。 （二）固定化生物催化剂的特点 （1）固定化酶属于修饰酶，这种酶可以通过化学、生物 、分子工程手段加以改良。 （2）固定化酶的稳定性很高，可以多次连续使用。 （3）反应以后，产物中不含酶，易于纯化。 （4）反应条件易于控制，可实现连续化和自动控制。 （5）酶的利用率高，酶的实际使用量较少。 （6）固定化酶比水溶性酶更适合进行多酶反应。 （三）酶固定化的方法分类 1、载体结合法 2、交联法 3、包埋法 1、载体结合法 （1）物理吸附法 （2）离子结合法 （3）共价键结合法 （1）物理吸附法 A、物理吸附法的优点： （1）操作简单 （2）可选用不同的吸附剂 （3）酶失活之后，载体可以再生 B、物理吸附法的缺点： （1）酶的最适吸附量无规律可寻 （2）酶与载体之间的吸附力不强，酶容易脱落。 C、常用的吸附剂 C、 常用 的吸 附剂 活性炭 碳酸钙-每克载体能吸附1mg酶蛋白。 纤维素 多孔玻璃 酸性白土 漂白土 高岭石 氧化铝 硅胶 膨润土 羟基磷灰石 磷酸钙 金属氧化物-二氧化钛覆盖后的不锈钢颗粒，直径为 100-200um，每克载体能吸附17mg酶蛋白。 淀粉 谷蛋白 陶瓷 丁基葡聚糖凝胶 已基葡聚糖凝胶 单宁纤维素衍生物 （2）离子结合法 A、离子结合法的优点-操作简单、处理条件温和，酶的活性中心 不容易被破坏。 B、离子结合法的缺点-载体和酶的结合力较弱、常常发生酶脱落 的现象 C、常用的离子结合剂 树脂-阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、多糖类离子交换剂、合 成高分子类离子交换剂。每克载体能吸附50-150mg酶蛋白。 DEAE-纤维素 Amberlite-CG-50 Amberlite-XE-97 Amberlite-IR-45 Dowex-50 （3）共价键结合法 酶分子上的氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基与载体表面的反应基 团形成共价键，因而将酶固定在载体上的方法。 A、共价键结合法的优点-酶与载体结合牢固，酶不会发生脱落。 B、共价键结合法的缺点-操作复杂、反应条件苛刻，酶的活性中 心会遭到部分性的破坏。 C、共价键结合法的类别 重氮化迭氮化 酸酐活化法酰氯法 异硫氰酸酯法缩合剂法 溴化氰活化法烷基化法纪 硅烷基化法 2、交联法 （1）交联的优缺点 （2）交联法的类别和内容 （3）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂 （1）交联的优缺点 交联法是采用双功能、或者多功能试剂 ，使得酶与酶之间发生交联的固定化方 法。基团之间的交联通过共价键结合。 交联法的优点-交联后的酶活性较高 交联法的缺点-反应条件剧烈、酶的回 收率低。 （2）交联法的 类别和内容 类别 酶与酶交联法 酶与辅助蛋白交联法 吸附交联法 载体交联法 内容 分子内交联 分子间交联 酶与辅助蛋白分子之间交联 酶与载体之间交联 （3）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂 参与交联的酶蛋白功能团 N-末端的-氨基 赖氨酸的-氨基 酪氨酸的酚基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 常用的交联剂 戊二醛 双重氮联苯胺-2、2-二磺酸 1、5-二氟-2、4-二硝基苯 已二酰亚胺二甲酯 3、包埋法 包埋法的优点-不需要改变酶的高级结构，酶的 回收率较高。 包埋法的缺点-包埋酶容易导致酶的失活，包埋 法只适用于小分子底物的反应过程，大分子底物 由于无法进入凝胶，故不适用。 包埋法分为三类 （1）凝胶包埋法 （2）微囊化包埋法 （3）纤维包埋法 （1）凝胶包埋法 凝胶包埋法也称网格法，是指将酶包埋在高分子凝胶的 细策网格之中。凝胶包埋法是目前因定化技术中用得最 多的方法。所用的凝胶有： 聚丙烯酰胺 聚乙烯醇 光敏树脂 淀粉 明胶 胶原 海藻胶（卡拉胶） 角叉菜胶 （2）微囊化包埋法 将酶包埋在高分子半透膜中的方法，称为微囊 化包埋法。 微囊化固定化酶的优点-微囊化固定化酶的直 径为几微米到几百微米之间的球状体，其颗粒 较小，有利于大分子底物进行反应。 微囊化固定化酶的缺点-反应条件要求高，制 备成本也较高。 （3）纤维包埋法 此法适用于大规模生产。纤维包埋法所形成的聚合物，每克能够包 埋1500mg的转化酶，并且具有良好的稳定性。 制备时，先把含酶水溶液在高聚物（醋酸纤维素、聚氯乙烯）的有 机溶剂（二氯甲烷）中进行乳化， 然后将乳化液通过一多孔喷丝头挤压进凝结浴池中，形成纤维 酶溶液便被包裹在纤维内 将纤维编织成各种酶布，以适合反应器的要求。 （四）细胞固定化的方法分类 （1）交联法 （2）包埋法 （3）选择性热变性法-此法专用于细胞固定化 ，是将细胞在适当温度下处理，使其细胞膜蛋 白质变性，但不使其酶变性，从而使酶固定于 细胞内的方法。 （五）固定化技术所用载体 1、固定化载体必须符合的条件 （1）固定化过程不传统引起酶变性。 （2）对酸碱具有一定的耐受性。 （3）具有一定的机械强度。 （4）具有一定的亲水性，并且具有良好的稳定性。 （5）具有一定的疏松网状结构，颗粒均匀。 （6）进行共价键结合时，具有可活化基团。 （7）有耐受酶和微生物细胞的能力。 （8）廉价易得。 2、常用的固定化载体 （1）物理吸附载体 （2）离子吸附载体 （3）包埋法吸附载体 （4）共价键结合载体 （1）物理吸附载体 活性炭碳酸钙纤维素 漂白土高岭石石英砂 氧化铝硅胶矾土 膨润土胶棉羟基磷灰石 磷酸钙凝胶淀粉谷蛋白 陶瓷二氧化硅皂土 煤渣多孔玻璃酸性白土 金属氧化物（二氧化钛覆盖后的不锈钢颗粒） 丁基葡聚糖凝胶 单宁纤维素衍生物 已基葡聚糖凝胶 （2）离子吸附载体 阳离子交换树脂 阴离子交换树脂 DEAE-纤维素 TEAT-纤维素 羧甲基纤维素 DEAE-SephadexA50 Amberlite-CG-50 Amberlite-XE-97 Amberlite-IR-45 Dowex-50 （3）包埋法吸附载体 聚丙烯酰胺凝胶三醋酸纤维素 二醋酸纤维素甲壳素 硅胶聚乙烯醇 丙烯酸高取物琼脂 琼脂糖光敏树脂 淀粉明胶 胶原海藻胶 卡拉胶角叉菜胶 （4）共价键结合载体 纤维素SephadexA200 琼脂琼脂糖 苯胺多孔玻璃对氨基苯纤维素 聚丙烯酰胺胶原 尼龙多聚氨基酸 多孔玻璃珠金属氧化物 二、固定化酶的制备技术 （一）固定化酶的制备 （二）固定化酶的形状和性质 （三）固定化酶的活力测定方法 （一）固定化酶的制备 1、固定化方法的选择 （1）固定化酶应用的安全性，应该附合药用和食用标准。 （2）固定化酶的稳定性，能够长期反复使用。 （3）固定化酶的成本、水、电、气、设备、劳务等费用。 2、固定化酶的选择-目前在工业化大生产经常应用的有： （1）聚乙烯醇 （2）卡拉胶 （3）海藻胶。 3、固定化酶制备技术 3 、 固 定 化 酶 制 备 技 术 （1）物理吸附法-将酶的水溶液与具有高度吸附能力的载体 混合，然后洗去杂质和未吸附的酶，即得固定化酶。 （2）离子吸附法-将解离状态的酶溶液与离子交换基混合后 ，洗去杂质和未吸附的酶，即得固定化酶。 （3）凝胶包埋法-将凝胶材料（卡拉胶、海藻胶、琼脂及明 胶）与水混合，加热使之溶解，再降至其凝固点温度，然 后加入预保温的酶溶液、混合均匀，最后冷却凝固成型、 即成固定化酶。 （4）凝固包埋联合法-在进行聚丙烯酰胺包埋时，将酶、混 合单体、交联缓冲剂一起混合，再加入催化剂，在单体产 生聚合反应形成凝胶的同时，将酶限制在网格之中，经过 破碎后就成为固定化酶。 （5）脂质体包埋法-这是一种采用表面活性剂和磷脂酰胆碱 等物质，形成液膜来包埋酶的方法。 （6）纤维包埋法-即前面已经讲述的酶布包埋方法。 （7）共价键结合法-实质上是一种酶 与包埋剂之间的化学反 应过程 （8）界面沉降微囊包埋法 （9）界面聚合微囊包埋法 （10）交联法 （8）界面沉降微囊包埋法 采用与水不相溶的、沸点比水低的有机相A。 将酶液在有机相A中乳化、形成油包水的微滴。 再在乳化液中加入溶于有机溶剂的高聚物B。 再加入不能溶解高聚物B的另上种有机溶剂C。 结果使得高聚物在油水界面上沉淀、析出，形成 微囊型固定化酶。 （9）界面聚合微囊包埋法 含酶的、10%的血红蛋白溶液 + 已甲叉二胺水溶液-充分混合 加入1%的Span-85的氯仿-环已烷进行分散乳化， 再加入溶于有机相的癸二酰氯，酶和载体在油-水界面上发生聚合反应， 弃去上清液，加入Tween-20去乳化， 洗去有机溶剂用未聚合的单体， 将聚合物转移到水相之中，就成微囊。 所制得的微囊直径在1-300um之间，每1ml酶溶液可以制得2500cm2总表 面积的微囊。 （10）交联法 是指向酶液中加入多功能试剂，在一定的条件下使酶在 分子内、或者在分子间形成网络结构，最终形成固定化 酶的技术。 交联法可以分为： （1）酶与辅助蛋白交联法 （2）吸附交联法 （3）载体交联法。 如0.2%的木瓜蛋白酶和0.3%的戊二醛、在PH=5.2-5.7、 温度为0的条件下，24小时即完成酶的固定化。 （二）固定化酶的形状和性质 1、固定化酶的形状 2、固定化酶的性质 3、酶稳定性的变化 1、固定化酶的形状 固定化酶的形状-酶膜、酶管、酶纤维、微囊、颗粒状 的固定化酶。 （1）颗粒状的固定化酶-又可分为酶珠、酶块、酶片和酶 粉。其制备方法简单、颗粒比表面积大，转化效率高，适 用于各类反应器。 （2）纤维状的固定化酶-只适用于填充床式反应器。 （3）膜状的固定化酶-也称为酶膜，其表面积大、渗透阻 力小，可用于酶电极、破碎之后也可用于填充床反应器， 目前已经用于生产木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、 氨基酰化酶、脲酶等。 （4）管状的固定化酶-其机械强度大，切短之后可用于填 充床式反应器，也可组装成列管式反应器。 2、固定化酶的性质 （1）酶活力的变化-经过固定化之后，酶的活力大都发生下降。 （2）酶反应特性的变化-底物专一性，酶经过固定化之后，由于位 阻效应，其活性会下降。 （3）最适PH值-酶经过固定化之后，其最适PH值会发生变化。 （4）最适温度-酶经过固定化之后，其空间结构更加稳定，因此， 其最适温度也会提高。 （5）米氏常数-改变不显著。 （6）最大反应速度-会产生一定的差异。 3、酶稳定性的变化 （1）操作稳定性-当固定化酶的稳定半衰期达到1个月以 上时，就具有工业应用价值。 （2）贮藏稳定性-固定化的胰蛋白酶在20保存数月，其 活性不变。 （3）对热稳定性-由于加热提高了反应速度，从而提高反 应效率。 （4）对蛋白酶的稳定性-大多数天然酶在经过固定化之后 ，它们对于蛋白酶的耐受力均有大幅度提高。这在工业生 产中是极为有利的。 （三）固定化酶的活力测定方法 在酶促反应中，其底物或者产物具有光吸收、旋光、电位 差、荧光等变化，可以使用分光光度计进行直接测定。 （1）分批测定法 固定化酶在搅拌、振荡的情况下，每间隔一定时间取样， 过滤之后按常规方法测定。 （2）连续测定法 从反应器中引出反应液到流动比色杯中，在分光光度计中 进行连续测定。 或者通过测定反应过程中氧气、NH4、电导率、消化系数 来确定酶的活力。 酶活力测定仪器 三、固定化细胞的制备技术 1、固定化细胞的制备 2、固定化细胞的形状和性质 讫今为止技术上还没有过关的原因： （1）细胞培养技术存在着难题。 （2）固定化之后，细胞的生物学活性存在着障碍。 （3）细胞固定方法上在套用酶固定化技术，但是细胞不 同于酶的单分子蛋白质，技术共用难度很大。 在此只能作为标题介绍，不宜展开。 四、固定化生物反应器 1、酶反应器 2、固定化反应器 的类型和特点 3、固定化反应器 的选择依据 1、酶反应器 用于酶催化反 应的装置称为 酶反应器， 它可用于溶液 酶、也可用于 固定化酶。 2、固定化反应器的类型和特点 （1）间歇式搅拌反应罐（BSTR） （2）连续流动搅拌反应罐（CSTR） （3）填充式反应罐（PBR） （4）流化床反应器（FBR） （5）循环反应器（RCR） （6）连续流动搅拌超滤膜反应器（CSTR/UF） （7）其它反应器 （1）间歇式搅拌反应罐（BSTR） 也称为分批搅拌反应器。 其特点是结构简单、操作方便。 其缺点是，经过单一批次的反应之 后，酶就随着反应产物流失。 主要用于游离酶反应。当前食品和 饮料工业中常用这类反应器。 其方法是将酶和底物一起加入到反 应器中，控制反应温度，当达 到预期的转化率时，随即放料 。 （2）连续流动搅拌反应罐（CSTR） 这是一种连续进料、连续出料的反应器 。 结构上与间歇式搅拌反应器基本相同。 （3）填充式反应罐（PBR） 属于使用最普遍的反应器。主 要用于固定化酶生产的反应器 。 固定化酶通常以各种形状如球 形、碎片、薄片、丸粒填充于 反应层内。 固定化酶所使用的载体有多也 玻璃珠、珠状离子交换树脂、 聚丙烯酰胺凝胶、二乙胺乙基 葡聚糖凝胶，胶原蛋白薄膜片 。 填充式反应罐系统运转时，底 物按照向上流动的方向以恒定 的速度通过反应床。 （4）流化床反应器（FBR） 在流化床反应器，底物溶液以足够大的 流速向上通过反应床。使得固体颗粒处 于流化状态，从而来增加反应效率。 由于流化床反应器具有混合程度高，传 热性能良好等特点，因此可以用来处理 粘性较强的底物、或者用来处理含有固 体颗粒的底物。 （5）循环反应器（RCR） 这种反应器是让部分反应产 物流出，流出物再与原始底 物混合之后重新流入反应系 统的方法。 循环反应器能够提高液体的 流速，并能减少底物在固定 化酶表面沉积，从而达到较 高的转化效率。 当反应底物是不溶性物质时 ，可以采用循环反应器生产 。 （6）连续流动搅拌-超滤膜反应器（CSTR/UF） 连续流动搅拌-超滤膜反应 器=连续流动搅拌反应器 + 超滤膜装置。 超滤膜被安装在连续流动搅 拌反应器的出口处，这种膜 只允许反应产物、或者是未 曾反应的底物通过，而分子 量较大的酶就被截留在反应 器中，从而实现酶的反复利 用。 （7）其它反应器 淤浆式反应器 滴流床反应器 气栓式流动反应器 转盘式反应器 筛板反应器 复合类反应器 3、固定化反应器的选择依据 （1）根据固定化酶的形状来选择。 （2）根据底物的物理性质来选择。 （3）根据外界环境条件对于酶的稳定性来选择。 （4）根据操作要求和固定化酶反应器的投资费用来选择。 第四节 酶工程应用实例 一、L-天门冬酸生产工艺 二、固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 三、固定化酶法生产5-复合单核苷酸注射液 四、固定化酶法生产L-氨基酸 五、r-氨基丁酸的生产工艺 六、L-多巴的生产工艺 实例1、酶 工程产品益生源，用于饲料添加剂 例2、酶工程产品万寿胶囊，用于补充人体营养物质 例3、生态复合酶制剂，用于改善环境 例4、酶工程药品和化妆品原料 例5、膜反应器，用于污水处理 第五节 酶工程研究进展 一、酶的化学修饰 二、酶的人工模拟 三、有机相中的酶反应 四、基因工程酶的构建（略） 一、酶的化学修饰 1、关于酶的化学修饰 2、常用的化学修饰剂 3、化学修饰方法 4、修饰酶所具有的新特征 1、关于酶的化学修饰 （1）原因-但是由于酶是一种蛋白质，常常在应用过程中 出现异体蛋白的抗原性、容易被水解、容易受抑制、在 反应系统中半衰期较短等缺点。 因此提高酶的稳定性、解除酶的抗原性就成为技术关键。 （2）定义-酶的化学修饰就是在分子水平上，采用化学方 法对酶进行改造，通过添加一些化学基团，或者采用具 有生物相容性的大分子进行共价键联接，从而改变酶分 子性质的一种技术。 2、常用的化学修饰剂 化学修饰剂的要求-具有较大的分子量，具有良好的生物 相容性、具有水溶性，分子表面具有较多的反应基团。 （1）糖以及糖的衍生物-右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯、糖 肽、葡聚糖凝胶、聚乳糖。 （2）高分子多聚物-聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVA ）、聚N-乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸（PAA）。 （3）生物大分子-肝素、血浆蛋白质、聚氨基酸。 （4）双功能试剂-戊二醛、二异硫氰酸、二胺类。 （5）其它试剂-糖基化试剂、甲基化试剂、乙基化试剂。 3、化学修饰方法 （1）修饰酶的功能基团-如氨基、羧基、羟基、巯基、咪 唑基。来提高稳定性。 （2）在酶分子内进行交联、或者进行分子间的交联-提高 酶解能力、消除抗原性。 （3）修饰酶的辅助因子-提高稳定性。 （4）使酶与高分子化合物相结合-提高稳定性。 4、修饰酶所具有的新特征 （1）对热的稳定性有所提高。 （2）具有对抗各类失活因子的能力。 （3）抗原性消除。 （4）体内的半衰期有所延长。 （5）最适PH值发生改变。 （6）酶反应特性发生变化。 （7）在人体组织中的分布能力发生变化，有利 于被靶器官选择性的吸收。 二、酶的人工模拟 根据酶的作用原理，采用人工方法合成的，具有 活性中心和催化反应作用的、非蛋白质结构的化 合物，称为人工模拟酶。 人工模拟酶的构成条件： （1）具有能够识别底物的分子结构， （2）具有酶活性部位的催化基团。 1、环糊精 2、分子印迹技术 1、环糊精 它具有一个疏水的结合部位，能与有机分子形成包络物，同时，它还 能催化一些反应。 环糊精分子是一个椅子状的空穴结构，空穴的边缘是一些葡萄糖羟基 ，使得环湖精能够溶液于水。 空穴的中间则是疏水结构，能够将有机小分子束缚到空穴之中。 环糊精的酶促反应过程为-参与反应的底物先被环糊精分子包束，然 后再发生酶促反应。 环糊精所模拟的胰凝乳蛋白酶，其催化效率与天然的胰凝乳蛋白酶相 同。但是，环糊精的对热稳定性、对PH值稳定性则大大高于天然的 胰凝乳蛋白酶。 2、分子印 迹技术 分子印迹技术是制备针对某一特定 分子具有特异性结合能力的聚合物 的过程。 其实质已经接近于基因芯片技术 （1）分子印迹技术的过程 （2）分子印迹技术的应用价值 （1）分子印迹技术的过程 （1）特定分子 + 特异性结合 的功能单体，发生互补性 结合作用，形成特定分子- -功能单体复合物。 （