《酶动力学》PPT课件.ppt

第10章 酶动力学 研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度 的各种因素，包括底物浓度、酶浓度、pH 、温度、激活剂与抑制剂等。 1903 Henri enzyme sucrose + H2O glucose + fructose 一、底物浓度对酶促反应速度的影响 （单底物酶促反应） （一） 中间复合物学说 中间复合物学说认为酶与底物先络合成一个中间产物，然后 中间产物进一步分解成产物和游离的酶。 中间复合物学说证据：p152 SE ES PE 1903年，Henri以蔗糖酶研究底物浓度与反 应速率的 关系，提出了酶与底物作用的“中间复合物学说”。 （二） “稳态理论” Briggs和Haldane 1925 稳态理论的贡献在于： ES的动态平衡不仅与 E+ S ES有 关，还与ES P + E有关。 所谓“稳态”：ES的形成速度与分解速度相等、ES的浓度保持不 变的反应状态 米氏常数： 当Km及Vmax已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底物浓 度的关系。 米氏方程： （三） 用稳态理论推导米氏方程 1.当S Km时: 3.当S=Km时: 根据米氏方程可以说明以下关系： 1.当S Km时: 3.当S=Km时: 根据米氏方程可以说明以下关系： 即Km是当酶反应速度达到最大反应速 度一半时的底物浓度，单位：molL-1 或mmolL-1。 复 习 1、 Km的物理意义 当反应速度v=1/2 Vmax时， Km = S， Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时的底物的浓度。 单位：molL-1或mmolL-1。Km是酶的特征常数之一，一般只与酶的种类 、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。因此，在特定条件下测 定酶的Km值，可以作为鉴别酶的一种手段。 一些酶的Km值（见表10-1）。 （四） 米氏方程中各参数的意义 有的酶可作用于几种底物，因而就有几个Km 值，其中Km最小的底物 称该酶的最适底物或天然底物。因为：Km愈小（达到Vmax一半所需的 底物浓度愈小）,表示V对S 越灵敏。 1 2 2、 Km可以判断酶专一性和天然底物 V S 1/2Vmax Km2 Km1 3、 Km 与底物亲和力 Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值。 v Km值近似表示酶与底物之间的亲和程度：Km值愈大，表示亲 和程度愈小。 4、 Km与米式方程的实际用途 如当S3Km时 （1）根据S求V V0.75 Vmax （2）根据相对速度推测酶活性中心饱和度Y： 当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，v与S无 关，只和E0成正比。 当v=1/2 Vmax时，表示酶活性部位有一半被底物占据。 5、 Kcat的意义：催化常数或转换数 Kcat是指当酶被底物充分饱和时，每秒钟每个酶分子转换 底物的分子数（称为转换数或催化常数），表示酶的最大 催化活力的量度。 一些酶的转换数见表10-2。 （五） Km和Vmax的求解方法 Lineweaver-Burk 双倒数作图法（最常用） 1/Vmax -1/Km 1/S 1/V 斜率=Km/Vmax （一）酶的最适pH 最适pH：使酶促反应速度达到最大时的pH称为该酶的最适pH 。 最适pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。 虽然大部分酶的pH酶活曲线是钟罩形，但也有半钟形甚至直线形。 二、pH对酶促反应速度的影响 （二） pH影响酶活力的原因 过酸或过碱会影响酶蛋白构象，使酶活性丧失。 影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影 响ES形成。 影响酶分子中一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性 及活性中心构象。 三、 温度对酶促反应速度的影响 （一）最适温度及影响因素 最适温度： 温度对酶促反应速度的影响有两个方面： 1. 温度升高，加快反应速度。 2. 温度升高，酶变性失活。 最适温度不是酶的特征常数，它与底物种类、作用时间、pH、离子强 度 等因素有关。 温血动物酶的最适温度3540；植物酶最适温度4050；微生 物差别大，如细菌Taq DNA聚合酶70。 温度系数Q10：温度升高10，反应速度与原来的反应速度之比，大多 数酶的Q10一般为12。 四、 激活剂对酶促反应速度的影响 （一） 无机离子的激活作用 无机离子： 1.金属离子：K+ 、Na+、Mg2+ 、Zn2+、Fe 2+ 、Ca2+等； 2.无机阴离子：Cl、Br 、 PO43等； 特点： 1.激活剂的选择性，即不同的离子激活不同的酶。 2.不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与K+、Mg2与Ca2之间 常常拮抗，但Mg2与Zn2 +常可替代。 3.激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，150mM 激活剂：凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。包括无机离 子或简单有机化合物。 许多金属离子是酶的辅助因子，是酶的组成成分，参与催化反应中的电子 传递。 有些金属离子可与酶分子肽链上侧链基团结合，稳定酶分子的活性构象。 有的金属离子通过生成螯合物，在酶与底物结合中起桥梁作用。 （二） 小分子有机物的激活作用 1.某些激活剂（如Cys、GSH）能还原巯基酶中的某些二硫键使 成-SH，-SH是巯基酶起催化作用所需的基团，提高了酶活性 。 2.金属螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)，可络合一些重金属离 子，解除它们对酶的抑制，从而使酶活升高。 五、 抑制剂对酶促反应速度的影响 失活 (inactivation)：凡是酶活力的降低或丧失都称为 酶的失活。 抑制 (inhibition)：使酶活力下降或丧失但并不引起酶 蛋白变性，它主要改变酶活性中心的化学性质。 抑制剂（inhibitor）：引起酶的抑制作用的物质称为 酶的抑制剂。 研究抑制剂对酶的作用有重大的意义： （1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发；抗癌药 （2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控或代谢控制发酵 ； （3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化学功能基 团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶 工业的基础。 （一）抑制程度的两种表示方法 1、相对活力 2、抑制分数 （二）抑制作用的类型 1、不可逆的抑制作用: 抑制剂与酶的必需基团共价结合，使酶的活性丧失，无 法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。 S + EESE + P + I EI 2、 可逆的抑制作用: 抑制剂与酶以非共价键结合引起酶活力降低或丧失，可 以用透折、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。 根据可逆抑制剂与底物的关系分为： （1）竞争性抑制 （2）非竞争性抑制 （3）反竞争性抑制 抑制程度是由酶与抑制剂之间的 亲和力大小、抑制剂的浓度以 及底物的浓度决定。 （1）竞争性抑制（Competitive inhibition） 酶活性部位是不能同时结合底物与抑制剂的。抑制剂 具有与底物相似的化学结构，竞争酶的活性中心，并 与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合；可以 通过增加底物浓度(即提高底物的竞争能力）而解除此 种抑制。 例如，丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争 性抑制剂。 琥珀酸丙二酸 （2）非竞争性抑制（noncompetitive inhibition） 底物和抑制剂可以同时与酶结合，但是，中间的三元复合物 ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低；抑制剂与 酶活性中心以外的基团结合，其结构与底物无共同之处；不能 用增加底物浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。 例如；某些重金属离子（Cu2+、Hg2+、Pb2+ ）对酶的抑制属于 非竞争性抑制。 酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。 E+SES+I ESI 常见于多底物的酶促反应中。 （3） 反竞争性抑制（uncompetitive inhibition） （三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别 1、看通过透析、超滤、凝胶过滤等方法能否除去抑制剂； 2、通过v E动力学曲线区分。 2 1 3 E v 不可逆与可逆 曲线1：无抑制剂 曲线2：不可逆抑制剂 曲线3：可逆抑制剂 （四）可逆抑制作用的动力学 推出三种抑制方程：（1）竞争性抑制 （2）非竞争性抑制 （3）反竞争性抑制 Vmax不变；Km变大，而且随I浓度的增大而增大 动力学方程： （Ki为EI的解离常数） 1、竞争性抑制： 交于y轴 2、 非竞争性抑制 动力学方程： 交于x轴 Km不变，Vmax降至Vmax/（1+I/Ki） 3、 反竞争性抑制 Km及Vmax都变小 动力学方程： 一组平行直线 有无抑制剂时酶促反应的最大速度与Km值的比较 类型 方程式 Vmax Km 反竞争性抑制 非竞争性抑制 竞争性抑制 无抑制剂Vmax Km 不变 增加 减小 不变 减小 减小 总 结 （五）一些重要的抑制剂 1、不可逆抑制剂 有机磷化合物 有机磷化合物的化学结构式 P Y O X R R O Y为氧或硫。含氧的为磷酸酯类，含硫的为硫代磷酸基类。 目前含硫的硫代磷酸酯类农药由于属剧毒类，现多已停止生 产。市场上农药多为磷酸酯类。 n有机磷农药呈油状或结晶状，淡黄至棕色，稍有挥发性。 n较易通过皮肤和黏膜、呼吸道及消化道吸收。 n在中毒死亡者中，因服有机磷农药中毒致死者占83.6%。 病 因 使用性中毒 生活性中毒 生产性中毒 有机磷化合物 n能与乙酰胆碱酯酶的活性部位的SerOH形成磷 酯键，强烈地抑制酶的活力，使乙酰胆碱不能够 被分解而过分积累，导致神经系统过于兴奋，引 起神经系统功能失调而中毒致死。 乙酰胆碱酯酶 磷酰化胆碱酯酶 有机磷杀虫药 中毒机制：有机磷农药和胆碱酯酶结合示意图 解毒剂：PAM（解磷定）可以把磷酰化胆碱 酯酶上的磷酸根除去，使酶复活。 青霉素：不可逆抑制糖肽转肽酶 Kcat型不可逆抑制剂（自杀性底物，suicide substrate） 这种抑制剂是根据酶的催化反应机制来设计的，它们与天然 底物的结构类似，其本身也是酶的底物，既能与酶结合，也 能被催化发生反应，但在其分子中具有潜伏反应基团，当酶 对它进行催化反应时，该基团会被暴露或活化，并立即与酶 活性中心内的必需基团共价结合，引起不可逆抑制。此种抑 制专一性强，又是经酶催化后引起，被称为自杀性底物。 例如：卤代-D-Ala是细菌中丙氨酸消旋酶的不可逆抑制剂 。 2、可逆抑制剂 竞争性抑制剂（Competitive inhibition） 一些竞争性抑制剂与天然代谢物结构相似，能选择性抑 制病菌和癌细胞在代谢过程中的某些酶，