大肠菌群的测定论文.doc

大肠菌群的测定论文目录1 普通光学显微镜的使用2 微生物大小的测定3 微生物直接计数法4 细菌的简单染色和革兰氏染色法5 常用玻璃器皿的清洗及包扎6 牛肉膏蛋白胨培养基的制备7灭菌8 微生物溶液的十倍稀释法9微生物平板菌落计数法10 微生物的分离、接种和培养大型实验： 水中细菌总数和大肠菌群的检测厌氧菌的分离、培养及鉴定第一节 普通光学显微镜的使用一实验器材普通光学显微镜，切片标本，香柏油，二甲苯，擦镜纸。二实验步骤图？ 显微镜的结构1-目镜 2-镜筒 3.物镜转换器 4.物镜 5.通光孔 6.聚光器 7.光圈8.反光镜 9.粗调节器 10.细调节器 11.镜臂 12.推进器 13.载物台14.倾斜关节 15.镜柱 16.镜座 17. 照明装置 18.粗调限位环凸柄(一)低倍镜的使用1. 把显微镜放在桌面的左侧，镜臂对向胸前，坐下进行操作。用手转动粗调螺旋，使镜筒上升，然后转动物镜转换器，使低倍镜对准镜台中央圆孔（当转动到听见“咔”声响，或同时亦感到有阻力时立即停止转动，说明物镜已与镜筒成一直线）。2. 对光：拨动聚光镜底部圆环的小柄，使光栏完全打开。旋转聚光镜升降螺旋，使聚光镜上升到和镜台相平。用左眼（两个眼睛都要睁开）在目镜上观察，同时用手调整反光镜，对好光源。要求视野达到完全均匀明亮。3. 放置玻片标本：取玻片标本放在镜台上，有盖玻片的一面朝上。玻片两端用移动器夹住，然后转动螺旋，使玻片上要观察的标本对准镜中央圆孔。注意，镜台上的刻度可以标示玻片的坐标位置。4. 调节物距：转动粗调螺旋，使低倍镜距玻片标本0.5mm左右。注意：必须从显微镜侧面观察物镜与玻片的距离。切勿用眼在目镜上观察的同时转动粗调螺旋，以防镜头碰撞玻片造成损坏。用左眼从目镜上观察，用手慢慢转动粗调螺旋下降镜台，当视野中出现物像时，再调节细调螺旋，直至视野中出现清晰的物像（许多椭圆形的红细胞）为止。如果物像不在视野中央，可稍微移动玻片位置（注意：移动玻片的方向与观察物像移动的方向恰好是相反的）。5、使用推动器移动标本认真观察标本各部分，寻找要观察的目标。(二)高倍镜的使用1. 一定要先在低倍镜下找到要观察的标本物像后，并把要放大的部分移至视野正中，同时调节到最清晰程度，才能进行高倍镜的观察。2. 转动物镜转换器，用高倍镜（40）观察。使高倍镜转到镜台中央圆孔处。转换高倍镜时速度要慢，要细心，并从侧面进行观察（防止高倍镜碰撞玻片）。如果高倍镜碰到玻片，说明低倍镜的物距没有调节好，应重新进行操作。3. 调节物距：转换好高倍镜后，用左眼在目镜上观察。这时物像往往不清楚、或者要观察的部分不在视野当中，可用细调螺旋慢慢向上或向下转动（切勿用粗调螺旋）即能清楚看到物像。一般只需转动半圈或一圈就能达到要求。注意：此过程中不动任何旋钮，只用细调节器稍加调节，就可获得清晰的图像。转动转换器时，不要用手指直接扳动物镜镜头。(三)油镜的使用1. 首先在高倍镜下找到所要观察的标本后，把所要观察的部分移至视野中央。2. 转动物镜转换器，移开高倍镜，调转高倍镜（40）和油镜（100）呈“八”字，在标本上所要观察的位置加一滴镜油（香柏油）。3. 转动物镜转换器，转换油镜，使之对准镜台中央圆孔处，旋进油镜。调节光线至最大光圈。4. 转换好油镜后，用左眼在目镜上观察。物像如不清楚，可用细调螺旋慢慢向上或向下转动，直至视野中出现清晰的物像。如仍看不清标本，需重新用低倍镜、高倍镜观察，然后再转换油镜。（四）观察完毕的处理油镜镜头：先用干净擦镜纸擦12次，然后用二甲苯润湿擦镜纸，再擦1次，最后再用干净的擦镜纸擦2次。擦拭镜头应顺着一个方向擦，不能来回擦拭。切片标本：先用吸水纸擦去香柏油；再滴一滴二甲苯在上面，用吸水纸擦去，最后用水清洗。显微镜：物镜镜头转成“八”字形，下降载物台至最低点，取下切片标本，关闭开关，拔掉电源线，如实填写使用情况，填罩上皮罩。将显微镜放回镜箱。搬动显微镜时应一手握镜臂，一手托镜座。（五）使用显微镜注意事项1. 持镜时要一手紧握镜臂，一手托住镜座，绝不能一把提起显微镜便走，以防目镜从镜筒滑出或反光镜脱落。2. 轻拿轻放，不要把显微镜放在实验台边缘，防止碰翻落地。3. 显微镜光学系统部件要用清洁的擦镜纸轻轻揩擦，切勿口吹、手抹或用粗布揩擦。4. 使用时先用低倍镜调整光线。观察活体标本或染色较浅的标本时，要适当关小可变光栏便视野变暗，方能看得清楚。5. 放置玻片标本时要对准镜台孔正中央，并且不能反放玻片，如标本玻片反放时高倍镜下看不到物像，并容易压坏玻片或物镜。6. 观察时要双目睁开，切勿闭上一只眼睛。左眼观察视野，右眼用以绘图。低倍镜用粗调螺旋调节物距，高倍镜要用细调螺旋，粗、细调节螺旋都不能单方向过度地旋转。单向上升粗调螺旋会压碎镜片和损坏物镜。7. 不要随便取出目镜，以防尘土落人物镜上。也不要任意拆卸任何零件，以防损坏。8. 使用完毕后，转动粗调螺旋使镜台下降，取下玻片，转动物镜转换器，使物镜离开聚光孔。再上升镜台使物镜接近镜台（不要对着镜台孔）。然后以右手握镜臂，左手托镜座轻轻放人镜箱中。9. 每次使用显微镜之前，先按显微镜登记卡片逐项检查显微镜各部分有无损坏。如发现损坏，应及时向教师报告。使用之后，认真填写显微镜使用登记卡片。2 微生物大小的测定一材料及器材菌种：酵母菌仪器及其他用具：目镜测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片，显微镜、吸水纸二方法与步骤(1) 装目镜测微尺。取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。(2) 校正目镜测微尺。 放镜台微尺。将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。 校正。先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用推动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别读出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数。用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数。观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。 计算。由于已知镜台测微尺每格长10m，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度（m）=10(3) 菌体大小测定。目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母细胞切片。酵母细胞切片的制作：载玻片、盖玻片的清洗、干燥。 滴酵母液。注意量要少，滴在载玻片中间部位。 盖盖玻片。盖玻片一边与酵母液接触，缓慢放下，避免产生气泡。 用吸水纸吸干余液。测定：先用低倍镜找到标本，换高倍镜测定酵母菌的宽度和长度。测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出酵母菌的宽和长所占目镜测微尺的格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺（用油镜时）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。(4) 测定完毕。取出目镜测微尺后，将目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。(5) 结果目镜测微尺每格长度（m）=103 微生物直接计数法一材料及器材酵母菌液、显微镜、血球计数板、载玻片、盖玻片二方法步骤1、镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，干燥后才能进行计数。2、加样品将清洁干燥的血球计数板盖上血盖片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴,让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液。样品要均匀充满计数室，不可有气泡。3、显微镜计数加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。计数左上、左下、右上、右下、中间共5个中方格，即计数80个小方格中的酵母细胞数。显微镜视野中的光线要暗一些，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边, 否则，不容易看清计数室的方格线,或只见竖线或只见横线。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有510个菌体为宜。计数时，对位于线上的酵母菌，可采用只计数两条边的办法，即遵循查上不查下，查左不查右的原则。当酵母菌芽体达到母细胞大小l/2时，即可计作两个细胞。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则1mL菌液中的总菌数=A/525104B=50000AB（个）同理，如果是16个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数=A/516104B=32000AB（个）4、出芽率的测定按前法，测定出酵母菌芽体数(小于母细胞1/2的)，计算出单位体积内测得酵母细胞的芽体占总数的百分率，即为酵母的出芽率。 出芽率=1005、酵母死亡率的测定滴一滴0.1吕氏美蓝液于载玻片中央，再加菌悬液少许，与美蓝液混匀，加盖玻片，立即在显微镜下检查，记数在一个视野中，已变蓝(死)和未变蓝(活)的细胞数。依法再计数23个视野中的细胞数。 死亡率=100死亡率是单位体积内死亡的细胞数占总细胞数的百分率。6、计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干。7、镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。4 细菌的简单染色和革兰氏染色法一材料及器材1、菌种：培养24h的大肠杆菌和葡萄球菌，培养1216h的枯草杆菌、牙垢。2、试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95乙醇、番红染液、香柏油、二甲苯。3、仪器或其他：显微镜，载玻片，吸水纸，擦镜纸，接种环，酒精灯。二方法与步骤1、简单染色法简单染色一般经过以下步骤：涂片干燥固定染色水洗干燥镜检(1) 涂片。用接种环以无菌操作(图1)从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层即可，或滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许菌体，与水滴混合均匀，涂成极薄的菌膜, ,注意滴的水滴要小，取菌要少,一般涂布直径1cm大小范围为宜。还可以用牙签取牙齿缝间的牙垢制涂片，以观察其中的螺旋菌。(2) 干燥。涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略微加热，使之迅速干燥。(3) 固定。用手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动34次，要求玻片温度不超过60脱使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其牢固附在载玻片上，不易落。以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜。(4) 染色。滴加结晶紫或其他染色液，覆盖玻片涂菌部分，染色1min。图1 无菌操作过程（18为操作步骤） 图2 涂片、干燥和热固定 (5) 水洗。斜置玻片，倒去染料，用细小的缓水流自标本的上端流下，洗去多余的染料，勿使过急的水流直接冲洗涂菌处，直到流下的水无色为止。(6) 干燥。将标本置于桌上风干，也可用吸水纸轻轻地吸去水分，或微微加热，以加快干燥速度。(7) 镜检。镜检顺序按由低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察。2、革兰氏染色法操作过程：涂片干燥固定草酸铵结晶紫初染路哥氏碘液媒染95乙醇脱色番红复染干燥镜检。(1) 制片。取要观察的菌体进行常规涂片、干燥、固定。(2) 初染。在菌膜上覆盖草酸铵结晶紫，染色l2min，水洗。(3) 媒染。用路哥氏碘液冲去残水，并用路哥氏碘液覆盖1min，水洗。(4) 脱色。用滴管流加95的乙醇脱色，直到流下的乙醇无紫色为止，时间为2030s，水洗。乙醇的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染色中关键的一步，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。(5) 复染。用番红复染液覆盖2min，水洗，(如图3)。(6) 镜检。干燥后镜检。干燥后用油镜观察，革兰阳性细菌呈蓝紫色，革兰阴性细菌呈红色。以分散开的细菌革兰染色反应为准，过于密集的细菌常由于脱色不完全而呈假阳性。 图3 革兰氏染色程序1加草酸铵结晶紫染色12min；2水洗；3碘液媒染lmin；4水洗；5乙醇脱色2030s；6水冼；7番红复染2min；8水洗；9用吸水纸吸干 注意：脱色是革兰染色关键的一步，可直接用95%酒精冲洗脱色，直到流下的酒精接近无色为止，然后立即用水冲洗，以免脱色时间过长而影响最终染色结果。另外，挑菌量，固定温度，染色时间也是影响结果的重要因素。阳性紫色阴性红色5 常用玻璃器皿的清洗及包扎一实验材料及仪器1、玻璃器皿：吸量管、培养皿、试管、三角瓶2、仪器：电热鼓风干燥箱、电热干燥箱、立式高压蒸汽灭菌锅二方法与步骤1、载玻片及盖玻片的清洗用纸擦去油垢，将盖玻片散入1的洗衣粉液中，煮沸lmin，待沸点泡平下后，再煮沸1min，如此反复(约30min左右)。冷却后用自来水冲洗干净。注意：煮沸时间过长会使玻片钙化变白且变脆易碎.2、含有琼脂培养基的玻璃器皿的清洗先用小刀或铁丝将器皿中的琼脂培养基刮下。如果琼脂培养基已经干燥，可将器皿放在水中蒸煮，使琼脂融化后趁热倒出，然后用水洗涤，并用毛刷沾肥皂擦洗内壁，然后用自来水洗去肥皂。是否已将油垢完全除去，可以这样检查：即将瓶子或试管的外壁擦干，如果水在内壁是均匀地分布一薄层，可以认为是将油垢除去了。如果经过这样洗涤的器皿，油垢还未洗净，就需用洗涤液来清洗。3、吸量管、移液管 清洗：将准备好的吸量管清洗。（以管内壁流下的水成线为标准）；洗好的吸量管竖于试管架上，自然干燥；包扎：取适量脱脂棉塞入1ml吸量管的后部约0.8cm。用上面准备好的宽约3-5cm长约12cm报纸条以3045的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量。（包扎要严密，保证不会松散）若干支吸管包扎成一束进行灭菌。使用时，从吸管中间拧断纸条，抽出吸管。4、培养皿清洗：将培养皿清洗干净（以皿上不挂水珠为标准）。将培养皿放入电热鼓风干燥箱中烘干。取出备用。包扎：用普通报纸将810个培养皿包扎紧密，必要时可用棉绳扎困。5、试管和三角瓶清洗：将试管、三角瓶用试管刷清洗；（以试管内壁流下的水成线为标准）将试管口朝下放入试管架自然干燥，或放入50左右电热鼓风干燥箱中烘干。包扎：用810左右方形棉花，制成棉塞（如图4），棉塞的长度不小于管口直径的2倍，应使棉塞长度的1/3在管口外，2/3在管口内。用左右方形牛皮纸覆盖棉花塞，用棉绳缠绕包扎；也可以23个试管为一组用一张牛皮纸包扎。图4 棉塞的制作6 牛肉膏蛋白胨培养基的制备一准备材料及器材1、 配制药品：牛肉膏、蛋白胨、琼脂条、NaCl；2 、调PH值用试剂：2mol/L NaOH、2mol/L HCl；3 、玻璃器皿：试管、三角瓶、烧杯、量筒、漏斗；4 、仪器：电炉、天平、高压立式蒸汽灭菌锅；5 、其他：纱布、棉花、牛皮纸、棉绳、pH试纸；二方法与步骤 1、称量牛肉膏1.5g、蛋白胨5g、琼脂条7.510g、NaCl 2.5g、水 500ml；注解：牛肉膏用玻璃棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。2、溶解烧杯中加入约400ml水，加热约80，加入牛肉膏、蛋白胨、NaCl，用玻棒搅匀，使其溶解。琼脂在溶液沸腾后加入。融化过程中不断搅拌，注意火力，以防将培养基烧焦使烧杯破裂或溢出。待药品完全溶解后，补足所需水分。3、调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入2mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达707.2。反之，则用2mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。4、过滤趁热用多层纱布过滤。以利结果的观察。如无特殊要求可省去此步骤。5、分装试管：将试管放于试管架上，插入玻璃漏斗，缓慢倾倒培养基，分装高度以试管高度的1/41/5（试管架底二层栏板处）左右为宜；三角瓶：玻璃漏斗插入三角瓶，装入一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜；注意：分装时勿使培养基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。6、加棉塞分装完毕后，在试管口、三角瓶口塞上棉塞。7、包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。8、灭菌将上述培养基12l，高压蒸汽灭菌20min。9、搁置斜面将刚灭过菌的试管培养基（趁热）管口端搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。图6 搁置斜面10无菌检查将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。7 灭 菌方法分为两类：干热灭菌和高压蒸汽灭菌一 、干热灭菌适于空的、干燥的玻璃器皿灭菌（比如移液管、培养皿）。培养基不适用。操作步骤：1、装入待灭菌物品 将包好的待灭菌物品放入电烘箱，物品摆放不要太挤，以免妨碍热空气流通。同时，灭菌物品也不能接触干燥箱内壁铁板，以防包装纸烤焦起火。关好箱门。2、升温 接通电源，打开开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100时，关闭排气阀。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停滞升温，如果此时还未达到所需温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节直至达到所需温度。3、恒温 当温度升到160170时，借恒温调节器的自动控制，保持温度2h。在干热灭菌过程中，严防恒温调节器的自动控制失灵而造成安全事故。4、降温 切断电源，自然降温。5、开箱取物 冷却至70时，打开箱门，取出灭菌物品。注意：未降至70以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂。二 、高压蒸汽灭菌对灭菌物品无特殊要求。操作步骤：1、接通电源，打开开关，取出内层锅，看水位指示灯是否为高水位，如果是低水位或缺水位灯亮则需从过上面注水，至高水位灯亮；2、装入待灭菌物品放回内层锅。向上抽提左侧螺栓旋进盖子，锁住；旋紧盖子上方螺旋盘，密闭，勿使漏气；3、打开排气阀。4、设定温度为120；时间为20min；5、待排气阀冒热气5min，锅内的冷空气排除干净，关上排气阀；6、停止加热，待压力表的压力降至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。注意：当压力不为零时，不能开盖取物，否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出三角瓶或试管，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼烧操作者。高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。8 微生物溶液的十倍稀释法一、实验材料及器材无菌9mL生理盐水、无菌lmL吸管、试管架、酒精灯、火柴、75%的乙醇、记号笔。 二、方法与步骤1、点燃酒精灯，试管架摆在酒精灯前方；用含有75%的乙醇的棉球擦手灭菌。2、取出灭过菌的10支吸量管（稀释几个浓度取几支吸量管）；从包装纸中间撕开一条（或者从中间拧断包扎纸），上半部分抽出；分别在上面做标签。标为0、-1、-2-93、把9支装有生理盐水的试管包扎纸去掉，然后插到试管架上，分别在上面做标签。从试管架左至右分别标为-1、-2、-3-9.4、原始样品振荡，菌液混匀；5、101稀释液：在原始样品中用1ml吸量管吸取1ml菌液，转入装有9ml生理盐水的试管，沿试管管壁释放，切勿插入液面。振荡摇匀。6、102稀释液：在10-1样品中用1ml吸量管吸取1ml菌液，转入装有9ml生理盐水的试管，沿试管管壁释放，切勿插入液面。振荡摇匀。7、10-310-9都可以依照2、3步骤操作。注意每稀释一个浓度换一支移液管。使用过的移液管放回标有相应液体浓度的包扎纸筒里。9 微生物的平板菌落计数一、材料及器皿1、菌种：过期牛奶2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基3、仪器或其他用具：3个浓度的稀释菌液、无菌培养皿、无菌lmL吸管、试管架、酒精灯、火柴、75%的乙醇、记号笔、玻璃涂布棒。 二、实验操作1、倒平板（1）培养皿、锥形瓶持法培养皿持法：左手，在酒精灯无菌区，无名指和小拇指托起皿底，大拇指打开皿盖；锥形瓶持法：右手，手握锥形瓶底部。瓶口用酒精灯外焰灭菌。（2）加培养基（加入量、污染皿壁、混匀）锥形瓶口伸入培养皿靠中间部位倾倒，15-20ml（大约占皿底3/4到4/5）；动作迅速，缓慢竖起锥形瓶（不要完全竖起），待没有液滴留下盖上皿盖，慢慢小幅度转动培养皿使培养基铺满整个皿底，放在桌上，冷却；拿起第二个培养皿同上操作。（3）酒精灯无菌区操作整个过程注意锥形瓶口不要远离酒精灯外焰。图7 倒平板(a)皿架法；(b)手持法2、按照微生物的十倍稀释法稀释2个浓度，即10-1、10-2；3、平板接种培养 平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种。(1) 混合平板培养法将无菌平板编上100、10-1、10-2号码，每一号码设置3个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-2稀释液各1mL放入编号10-2的3个平板中，另取一支1mL吸管同法吸取10-1稀释液各lmL放入编号110-1的3个平板中，再取一支1mL吸管吸取1100稀释液各1ml放入编号1100的3个平板中。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至4550的细菌培养基(图7)，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，在37条件下培养，菌落长出后即可计数。(2) 涂抹平板计数法。涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基融化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上(每个编号设3个重复)。再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀(图8)，每个稀释度用一个灭菌涂布棒，更换稀释度时需将涂布棒灼烧灭菌。将涂抹好的平板平放于桌上10min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒置，保温培养，至菌落长出后即可计数。 图8涂布法4、计算结果。从接种的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，统计平板上长出的菌落数，按下式计算每ml溶液中的含菌数。混合平板培养法：每ml样品的菌数=同一稀释几次重复的菌落平均数稀释倍数涂抹平板计数法：每ml样品的菌数=同一稀释几次重复的菌落平均数10稀释倍数注意：1、 平板菌落数的选择：选取菌落数在30300的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用三个重复，选取三个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。2、稀释度的选择：应选择平均菌落数在30300的稀释度，乘以该稀释倍数。若有2个稀释度生长的菌落数均在30300，则视两者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数；若比值大于2，则报告其中较小的数字。若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。若所有菌落数的平均菌落数均小于30，则应按稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数。若所有稀释度均无菌落生长，则小于1乘以最低稀释倍数。若所菌稀释度的平均菌落数均不在30300，则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数。3、细菌总数的报告：细菌的菌落数在100以内时，按其实有数报告；大于100时，用两位有效数字，在两位有效数字后面的数字，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示。10 微生物的接种培养一材料及器材1、菌种：大肠杆菌、枯草杆菌2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基3、仪器及其他：接种环、酒精灯、火柴、酒精棉、试管架、标签纸、恒温培养箱。二方法与步骤 （一）接种 (1)接种前的准备工作。 检查接种工具，进行环境消毒。 在欲接种的培养基试管或平板上贴好标签，标上接种的菌名、操作者、接种日期。 将培养基、接种工具和其他用品全部放在实验台上摆好，进行环境消毒。（二）接种方法（1）试管接种方法将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，使两只试管呈“V”字型。将接种环垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次。用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。试管口于酒精火焰附近。将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体，然后用环在菌苔上轻轻地接触，刮下少许培养物，并将接种环慢慢的从试管中抽出，并迅速地伸入另一试管中，在斜面上划线，使菌体沾附在培养基上。重新塞上棉塞。烧死接种环上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。重新塞上棉塞。烧死接种环上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。斜面接种 （2）试管菌种接种到平板培养基的方法用左手食指卡住装有菌种的试管在培养皿的盖子中间部位，试管口探出培养皿盖2-3cm；皿盖由左手大拇指、食指、中指控制；皿底由无名指和小拇指托起。右手松动试管棉塞，烧接种工具。右手小指与手掌边取下棉塞，取菌，打开平皿。将菌种接种到平皿上，立即盖上平皿。在酒精灯火焰上灼烧接种工具灭菌。棉塞过火，重新塞入试管。整个过程在酒精灯外焰3-5公分无菌区处操作。2、分离平板划线分离： 在无菌条件下，分别取一接种大肠杆菌和芽孢杆菌放入盛有无菌水的试管中，制成混合菌液。 在近火焰处，左手拿平板稍抬皿盖，右手持接种环蘸取一环混合液伸入皿内划线。图10 划线分离图A、B两种不同方式的划线方法1、2、3、4、5表示划线起始和终止位置(3) 培养。 将接种平板培养基倒置，放在3237恒温箱内培养24h观察。大型实验：水中细菌总数和大肠菌群的检测第一部分 水中细菌总数测定一、试剂及器皿1、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基2、器皿：试管架、酒精灯、火柴、涂布棒、无菌装有9ml生理盐水试管3支、无菌培养皿6个、二、实验步骤1、水样的采集河水，在距岸边5m处，取距水面1015cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。2、细菌总数的测定(1)水样稀释及培养：十倍稀释法稀释水样三个浓度梯度，即10-1、10-2、10-3将融化后保温在45的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平板。待琼脂凝固后，分别贴上浓度标签。接种10-2、10-3两个浓度，每个浓度3个培养皿，各接种0.1ml混匀的水样在相应标签的培养基上。涂布、静置10min。将平皿倒置于37培养箱内培养(241)h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得lmL水样中所含的细菌菌落总数。(2) 计算方法：做平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。第二部分 水中大肠菌群的检测一、试剂及器皿1、试剂：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、猪胆盐、乳糖、溴甲酚紫、革兰氏染色液2、器皿：显微镜、试管架、试管、无菌吸量管、150ml锥形瓶、玻璃漏斗、天平、称量纸、棉花、无菌培养皿、PH试纸、接种环、擦镜纸、吸水纸二、实验操作1、器皿的准备试管清洗、干燥，待用；吸量管、培养皿清洗、干燥，包扎，灭菌。2、培养基的制备及灭菌乳糖胆盐蛋白胨培养基成分：蛋白胨20g、猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g、乳糖10g、0.04溴甲酚紫水溶液25mL、水1000mL、pH7.4。制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每试管5mL，并倒置放入一个杜氏小管，包扎，121灭菌20min。 伊红美蓝琼脂培养基按水和成品培养基的比例溶解。 乳糖发酵培养基成分：除不加胆盐外，其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。制法：将蛋白胨、乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每试管5mL，并倒置放入一个杜氏小管，包扎，121灭菌20min。3、大肠菌群的检测步骤 初发酵试验：在3支装有5mL的乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管)，以无菌操作各加入水样1ml。摇匀后，37培养24h。 平板分离：经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37培养1824h。大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。 复发酵试验：将革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的剩余部分接于乳糖发酵培养基试管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落13个，37培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。3、检验程序（如图11）4、结果判定 (1) 挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。 紫红色，具有金属光泽的菌落。 深红色，不带或略带金属光泽的菌落。 淡红色，中心颜色较深的菌落。 (2) 凡是革兰氏阴性无芽孢杆菌，需要接种于乳糖蛋白胨半固体培养基，37培养6-8h，产气者，则判定为大肠菌群阳性。图11 检验程序图厌氧菌的分离、培养及鉴定一、介绍：厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，他们的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。二、厌氧菌的培养：在培养厌氧菌时，最需要控制的是厌氧条件，在pH=7.0,O2的浓度与1atm的氧平衡时，O2O2-反应的电位是0.81V，因此，在-0.33V时，O2浓度是大气压中O2浓度的10-75。每升饱和了空气的水中含有1.4810-55个O2。所以说，要保证厌氧菌培养时的低电位是很重要的。厌氧菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。本实验介绍的是一种简便的试管培养法亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术 因此他是世界上第一个分离纯化厌氧菌的人。以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌种都不会干扰厌氧条件。三 、实验材料与设备：1 、分离与培养：(1)菌种：待测样品；(2) 培养基：改良的PRAS培养基(氮素自加）配方组成NH4CL 1g,MgCl2 0.1g,K2HPO4 0.4g,KH2PO4 0.2g,甲酸钠5g,乙酸钠5g,甲醇3.5ml,Ph值为7.0,蒸馏水1000ml,1%的树脂刃天青（还原指示剂）1ml,121摄氏度灭菌20min.使用前每5ml培养基加入1%Na2S（还原剂）和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液（抑制剂）各0.1ml(3) 试剂：冰块 Na2S NaHCO3(4) 器材：高纯氮气 厌氧管 厌氧手套箱 注射器 恒温培养箱 铜柱除氧系统 定量加样器 厌氧罐 超声波破碎仪 酒精灯 冰块 水浴锅 记号笔 振荡器 等2、 菌种的鉴定：(1) 菌种：待测菌(2 )培养基；糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基（液体）；(3) 试剂；乙醚 吲哚试剂 卢戈氏碘液；(4) 器材：超净工作台 恒温培养箱 高压蒸汽灭菌锅 接种环 移液管载玻片 显微镜 等四、实验方法与步骤：（一）分离与培养1 、铜柱系统除氧 铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2 和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。 2、预还原培养基及稀释液的制备在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.55.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，于灭氧罐中灭菌备用。3、分离（1）编号取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-210-5。（2）稀释在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10-6，制成不同样品稀释液。通常选10-4、10-5、10-6三个稀释度进行滚管计数。（3）滚管分离滚管将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50恒温的水浴中，待用，当培养基从瓶中取出时，要用N2在培养基内中充气。再在试管中用N2充气，赶走所有管内空气，然后把培养基加入管内，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管内，及时拔出充气针头。用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。分离纯化生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。37培养，培养24h或更长时间或待培养