丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计.ppt

丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇 试验的研究 低成本生产丁醇的必要性 生物燃料是可替代汽油等石油燃料的清洁能源。生物燃料 主要包括生物柴油、生物乙醇和生物丁醇等。生物丁醇是一种极 具潜力的新型生物燃料，被称为第二代生物燃料。与生物乙醇相 比，它具有能量高于乙醇，有较好的燃料经济性，可提高汽车燃 料效率和行车里程数等优点。丁醇的性质更接近于烃类，因此与 汽油的配伍性好，无需改造汽车。作为新型的生物燃料，全球对 于生物丁醇的需求量逐年增加，生物丁醇的研究也因此成为当前 可再生资源开发利用的热点之一 传统发酵法生产丁醇主要以玉米和糖蜜为原料，但对中国 这样的人口大国来说，粮食关系到国计民生，确保粮食安全是社 会稳定最基本的需求。开发粮食替代资源，不与人争粮，不与粮 争地，是我国大规模生物炼制技术开发和产业发展的基本国策。 原始农作物 玉米秸秆 植物秸秆主要成分是纤维素、半纤维素 和木质素。其中,纤维素、半纤维素是可发 酵糖的来源,含量占66% 75%(纤维质原料 的绝干重量)。 但丙酮丁醇梭菌是无法直接利用木质纤 维素为底物进行丁醇发酵,它需将木质纤维 素水解产生葡萄糖、木糖等单糖再用于丁 醇发酵。 本实验所用菌种 丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum ） 一种革兰染色阳性、细胞呈梭状、能产生 丙酮和丁醇等溶剂的厌氧芽抱杆菌。细胞大小 (0.6一0.9)um* (2.4一4.7)um，常含细菌淀粉粒 。以周生鞭毛运动。芽抱卵圆形，次端生。表面 菌落圆形、突起，直径3一5mm，边缘不规则，色 灰白，半透明，表面有光泽。严格厌氧。能分解 蛋白质和糖类;生物素和对氨基苯甲酸作生长因子 试验内容 一、玉米秸秆水解实验设计 二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵 条件优化 三、以玉米秸秆水解液为底物发酵产丁醇的 研究 一、玉米秸秆水解实验设计 实验研究玉米秸秆经不同试剂预处理 后对其酶水解的影响,以及pH值、时间、酶 用量、底物浓度等因素对酶水解率的影响, 从而得出最佳酶解条件。并利用最佳条件 下的水解液进行丁醇发酵,从而达到农业秸 秆的资源化利用。 1. 试验材料：玉米秸秆、纤维素酶、及其他试剂和器材 2. 试验方法： （1） 玉米秸秆的预处理。碱浸泡法: 3%的NaOH,固液比 为110,室温浸泡24 h,过滤,滤渣洗净后于60 烘干水分至恒重 。氨水浸泡: 10%的氨水,固液比为110,室温浸泡24h,过滤,滤渣 洗净后于60 烘干水分至恒重。以不作处理玉米秸秆作为对照 。 （2） 酶水解反应条件。称取1 g秸秆于250 ml锥形瓶,加入纤维素 酶溶液(0. 05 mol/L, pH值4. 8的柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲溶液) ,将 三角瓶置于恒温水浴振荡摇床上进行酶解反应,温度50 ,转速 100 r/min,反应时间36 h。反应结束,离心取上清液进行还原糖的 分析。 （一）实验材料与方法 (1)秸秆成分分析。测定预处理前后1 g秸秆粉中的 纤维素、半纤维素及木质素含量。 (2)还原糖的测定。DNS法。 (3)酶水解率测定。 酶水解率(%) = a 0. 9m (1 - w) 100 式中, a为还原糖质量,m 为秸秆质量,w为含水率。 （二） 分析方法 设计因素： 1.粉碎程度对酶水解的影响： 该试验采用15目、60目和200目的秸秆粉碎程 度考察粒径大小对酶水解的影响。 2. 温度对酶水解的影响： 设计30 、35、40 、45 、50 、 55 。七个梯度对酶水解的影响。 (三)酶水解工艺的优化 3.纤维素酶的用量对酶水解的影响： 分别设置200、400、600、800、1000、1200U g 六个梯度。 4.pH值对酶水解的影响: 分别设置pH=3、4、5、6、7、8进行试验。 5.底物浓度对酶水解的影响： 设置固液比为1：10、1：20、1:30、1:40、1:50、 1:60、1:70几种底物浓度做试验。 二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵条件优化 （一）实验设计： 1.培养基及培养方法 (1)培养基 A 种子培养基: 5%玉米醪，pH自然; B 原始发酵培养基: 葡萄糖 50 gL KH2PO4 0.5L 醋酸胺 3 g/ L MgSO7H2O 0.2g/L K2HPO4 0.5 g/ L 邻氨基苯甲酸 0.01 g/ L pH 自然 C 单因素实验发酵培养基(g/ L ):以原始培养基为基础组分，分别 改变初始糖浓度、初始pH值、碳氮比、发酵温度、转速、邻 氨基苯甲酸浓度; 糖浓度:40 、 60 、 80 、 100 、 120 g/L pH值: 4 、 5 、 6 、 7 、 8 碳氮比: 37、42、47、52、57 邻氨基苯甲酸浓度:0.0005、0.001、 0.0015、0.002、 0.0025和 0.003g/L 发酵温度:32 、 34 、 36 、 38 、 40 转速: 150、160、170、180、200r/min D 正交设计实验发酵培养基(g/ L ): 培养基选取葡萄糖为碳源，醋酸按为无机氮源，并添加适 量邻氨基苯甲酸。由于培养基的碳氮比C/N、初始pH、发酵温 度以及生长因子对微生物的丙酮、丁醇合成影响很大，故对发 酵培养基的C/N ，初始pH，邻氨基苯甲酸浓度，发酵温度进行 均匀设计实验，以达到优化发酵培养基和发酵条件的目的。 按照实验设计按下表配制; 试验号 C/N pH 邻氨基苯甲酸浓度 g/L 发酵温度 13740.000532 23750.00134 33760.001536 43770.00238 54240.000532 64250.00134 74260.001536 84270.00238 94740.000532 104750.00134 114760.001536 124770.00238 135240.000532 145250.00134 155260.001536 165270.00238 a.菌种活化培养:将lmL菌种接种于 20mL玉米醪试 管培养基中，沸水浴下热处理1一2min，37下 厌氧活化培养。 b.摇瓶培养(单因素实验):将活化好菌种以体积比 10%的接种量接种于 100mL单因素实验发酵培养 基中，充氮气 10min，于37， 150r/min摇床培 养。 c.摇瓶培养(正交设计实验):将活化好菌种以体积比 10%的接种量接种于 100mL正交设计实验发酵培 养基中，充氮气 10min，于37， 150r/min摇床 培养。 （2）培养方法 d.摇瓶培养(优化验证实验):将活化好菌种 以体积比10%的接种量接种于 100mL优化 培养基中，初始pH值5.5，充氮气 10min ，于37.5， 150r/min摇床培养。 e.发酵罐培养:将lL优化培养基加入1.5L发 酵罐中，121下饱和蒸汽灭菌20min，冷 却后，将活化好菌种以体积比10%的接种 量加入发酵罐内，通氮气 30min，设定温 度为37.5，转速150r/min，初始pH值 5.5的条件下发酵 (1)葡萄糖、果糖浓度的测定 采用DNS法测定 (2)丙酮、丁醇、乙醇浓度的测定 用气相色谱测定， (3)含氮量的测定 采用凯氏定氮法测定。 (4)菌体生物量的测定 采用酶标仪测定620nm下的菌体浓度 （二）实验结果分析 （2）对照组培养基: 碳源分别为葡萄糖和果糖，浓度和玉米秸秆水解 液保持一致，添加醋酸按(调好C/N比)，培养基 中其他组成同玉米秸秆培养基，初始pH5.5。 以上培养基均在121饱和蒸汽下灭菌15min。 三、以玉米秸秆水解液为底物发酵产丁醇的研究 实验方法 1.培养基的制备 玉米秸秆水解液的制备:根据先前玉米秸秆水解实验，按优 化的最佳条件水解，调最终浓度分别为5%，6%和8%。 （1）玉米秸秆水解液培养基 玉米秸秆水解液、MnSO4、 KH2PO4、 MgS