分子生物学课件第16讲.ppt

Nanjing University 三、阻遏蛋白与操作子的相互作用 （一）操作子上与阻遏蛋白结 合的位点 1，lacI基因的表达特点 2，lac操作子（lacO）与阻遏 蛋白的结合 （1）阻遏蛋白与lacO结合的实 验证据 Nanjing University （2）lacO与阻遏蛋白结合的位 点及其结构 A，DNA内切核酸酶消化实验证 明：受阻遏蛋白保护区域位于 -5 +21(26bp) B，阻遏蛋白保护位点 C，lacO 的结构及其与阻遏蛋 白的结合性质 Nanjing University Nanjing University 3，阻遏蛋白对RNA聚合酶功能 的影响 （1）阻遏蛋白和RNA聚合酶可 同时与DNA结合 （2）阻遏蛋白与DNA的结合能 增强RNA聚合酶结合启动子的 能力（RNA聚合酶与的平衡常 数从1.9*107增加到2.5*109） Nanjing University （3）阻遏蛋白有效地使RNA 聚合酶与lac启动子上形成 一个很强的关闭式的转录起 始复合物，阻止转录的起始 （4）阻遏蛋白的这种作用对 操纵元的诱导也有促进意 4，上述模式不一定适用于其他系 Nanjing University （二）阻遏蛋白上与操作子结合 的位点 1，阻遏蛋白单体的结构 （1）长头片段（long headpiece） （2）短头片段 （3）核心片段（core） （4）铰链区 Nanjing University 2，阻遏蛋白四聚体的结构 3，阻遏蛋白与操作子的结合 4，阻遏蛋白需要组成四聚体才能实现 完全的阻遏作用 （1） lac系统存在多个操作子 （2）阻遏蛋白四聚体可以同时与两个 操作子结合 （3）阻遏蛋白结合第二个操作子影响 阻遏的水平 Nanjing University （三）阻遏蛋白与操作子的解离 1，诱导物与操作子上的阻遏蛋白直接 结合的证据 2，诱导物与阻遏蛋白的结合 3，阻遏蛋白与不同DNA的结合 （1）不同形式的阻遏蛋白与不同DNA 结合的特异性 （2）细胞内阻遏蛋白的结合位点 （3）细胞内阻遏蛋白的存在 Nanjing University （四）影响阻遏蛋白与操作子相互作用 的突变体 1，i-突变体 2，iS突变体 3，it突变体 4，i-d突变体 等位基因互补 5，Oc突变体 Nanjing University 第四节 分解代谢产物抑制涉及 的启动子正调控 一、分解代谢产物抑制 1，某些启动子转录的起始需要辅助 蛋白质 某些启动子缺乏保守的RNA聚合酶 识别位点（-35序列 / Sextama 框）和结合位点（-10序列 /Pribnow 框），需要辅助蛋白质 参与转录的起始 Nanjing University 最常见的是大肠杆菌对碳 源利用有关的一组操纵元 ，受一种代谢产物激活蛋 白（catabolite activator protein， CAP）控制，在葡萄糖 存在时保证细菌优先利用 葡萄糖 Nanjing University 2，分解代谢产物抑制 含义：葡萄糖会引起许多操纵元 （包括乳糖操纵元、半乳糖操纵 元和阿拉伯糖操纵元）表达的阻 遏 原因：葡萄糖引起cAMP含量下 降，使分解代谢产物激活蛋白失 活，从而抑制依赖该蛋白的利用 其他碳源的代谢相关酶的表达 Nanjing University 二、CAP对启动子的正调控 1，cAMP在分解代谢产物抑制中 的作用 葡萄糖引起cAMP水平下降是分 解代谢产物抑制的原因 cAMP由腺苷酸环化酶（ adenylate cyclase，cya）合 成 cya基因突变体对葡萄糖变化没 有反应 Nanjing University 2，CAP的作用 （1）CAP的结构特征 CAP是同源二聚体，由两个 22.5KD的亚基构成 CAP单体含DNA结合区及转录 激活区 Nanjing University （2）CAP结合的DNA位点 CAP二聚体结合启动子中一个约22bp的 序列 阻止CAP作用的突变位于保守的五核苷酸 序列中（TGTGA），该序列可能是识别 的必需成分 Nanjing University CAP与有两个（相反的）五 核苷酸序列的位点结合最强 ，因为这样两个单体均可结 合DNA Nanjing University 相对于 RNA聚合 酶的结合位 点，CAP 可以与不同 的DNA位 点结合 Nanjing University （3）CAP 的激活 只有当 cAMP存 在时， CAP才具 有活性 Nanjing University （4）CAP对转录的激活作用 A，CAP激活转录的途径 直接与RNA聚合酶作用 作用于DNA，以某种方式改 变其结构以利于RNA聚合酶 的结合 Nanjing University B，CAP与DNA和RNA 聚合酶的作用 CAP二聚体结构保证了 一个亚基可与RNA聚合 酶接触，哪一个亚基以 何种方向与DNA结合无 关紧要 Nanjing University C，CAP对RNA聚合酶的作 用取决于两者的相对位置： CAP位于启动子内部（如 gal）时，可提高闭合复合 物向开放复合物的转化速率 当CAP位于启动子临近位 置（如lac）时，其主要作 用是提高最初结合的速率， 以形成开放复合物 Nanjing University 第四节 操纵元的其他调控形式 一、具有双启动子的半乳糖操纵元 （一）半乳糖代谢 1，半乳糖代谢相关的酶 （1）半乳糖激酶 （2）半乳糖转移酶 （3）半乳糖表异构酶 Nanjing University 2，代谢步骤 （1）半乳糖+ATP 半乳糖1-磷酸+ADP+H （2）半乳糖1-磷酸+UDPGlu UDPGal+葡萄糖1-磷酸 （3） UDPGal UDPGlu 总反应：半乳糖+ATP 葡萄糖1-磷酸+ADP+H 半乳糖激酶 半乳糖转移酶 半乳糖表异构酶 Nanjing University （二）gal操纵元 1，gal操纵元组成 （1）结构基因（galK，galT，galE ） （2）调节基因（galR） 与结构基因相距很远 诱导物：半乳糖 galR突变：造成组成型表达 （3）P/O位点 galOC突变：造成组成型表达 Nanjing University 2， gal操纵元的启动子（图89） （1）gal P1 转录起始位置：S1（+1） 转录依赖cAMP-CAP 功能：葡萄糖不存在时负责gal操纵元 的转录 （2）gal P2 转录起始位置：S2（-5） 转录不依赖cAMP-CAP 功能：葡萄糖存在时负责gal操纵元的 转录 Nanjing University （三）cAMP-CAP对galP1和gal P2的控制 1，gal启动子的cAMP-CAP结合位 点 （1）位置：-76-47 （2）序列特点（图810） 具有保守性和对称性 Nanjing University 2，cAMP-CAP对S1转录的激 活及对S2转录的阻遏 对galP1：有激活作用 对galP2：cAMP-CAP结合位 点离galP2较近，妨碍RNA 聚合酶与galP2的结合 Nanjing University （四）Gal阻遏蛋白的作用 机制 1，gal阻遏蛋白的作用位 点 galOE：位于-60左右 galOI：与gal OE相距 90bp Nanjing University 2， gal阻遏蛋白可能的作用机制 （1） gal阻遏蛋白与galOE结合 ，可能通过以下途径发挥作用： 妨碍了cAMP-CAP与其位点的结合 或改变cAMP-CAP对转录的促进作 用 Nanjing University（） gal阻遏蛋白与 galOI结合可能导致两个 操作子之间的DNA形成环 状结构，两个阻遏蛋白通 过相互作用而强化了阻遏 效应 Nanjing University （五）gal操纵元双启动子的意 义 1，半乳糖的双重作用 （1）作为细菌的碳源 （2）UDPGal是细菌细胞壁的重要 前体 2，双启动子的作用 （1）galP1保证细菌可以利用半 乳糖作为碳源 （2）galP2保证有葡萄糖存在时 ，细菌可以合成UDPGal Nanjing University二、阿拉伯糖操纵元：具有 双重功能（正调控和负调 控）的调节蛋白 (一)阿拉伯糖代谢酶基因 的操纵元 1，阿拉伯糖调控元 Nanjing University （1）三个参与阿拉伯糖代谢的酶 的基因的操纵元 ara BAD araE，araFG：E，F，G编码膜结 合蛋白，与阿拉伯糖的结合与转 运有关 调节基因：araC （2）调控元：由一个调节基因控 制几个操纵元的系统 Nanjing University 2，araBAD操纵元的组成 （1）结构基因 araB：编码L-核酮糖激酶 araA：编码L-阿拉伯糖异构 酶 araD：编码L-核酮糖-5-磷酸 -表异构酶 Nanjing University （2）操纵元结构（图8-11 ） araC及araBAD各有启动子， 但转录方向相反 Nanjing University （二）araBAD操纵元的调 控 Nanjing University 1，araC基因产物及其结合位 点 （1）araC基因对araBAD正调 控的遗传学证据 （2）AraC蛋白的2种形式 Crep：未结合阿拉伯糖的AraC 蛋白 Cind：结合阿拉伯糖的AraC蛋 白 Nanjing University （3）AraC结合位点 araO1 (-110-140)：与araPC 重叠 araO2 (-265-294) araI (-40-78)：下游与RNA 聚合酶结合位点紧密相连，上 游与CAMP-CAP结合位点（- 107-78）紧密相连 Nanjing University 2，对araBAD操纵元起调控 作用的因素 （1）Crep 对araBAD 及araC 的作用 A，Crep 与araO1结合 有效阻遏araC基因的转录 对araBAD有轻微的阻遏 Nanjing University B，Crep 与araO2结合 与araO2结合的Crep 通过与结合在启 动子上的其他蛋白质发生相互作用， 实现对araBAD的有效阻遏。两种蛋白 质之间的DNA形成环状结构，其间插 入非螺旋整倍数目的核苷酸将改变两 种蛋白质在DNA双螺旋侧面上的位置 关系，从而降低阻遏效率 Crep 二聚体同时结合araO2和araI， 实现对araBAD的有效阻遏 Nanjing University （2）Cind对araBAD 及araC的作用 Cind与araI结合激活araBAD基因的 转录 Cind与araO1结合阻遏araC基因的转 录 （3）cAMP-CAP是araBAD和araC表 达的正调控因子 Nanjing University 3，araBAD操纵元的调控（图812） （1）无AraC及cAMP-CAP时，araC转录， 但很快会被Crep所阻遏（自身调控） （2）有AraC，无cAMP-CAP时，araBAD和 araC均不转录 （3）有AraC，阿拉伯糖及cAMP-CAP时， araBAD转录 （4）Cind 和cAMP-CAP促进araBAD转录的 机制 促进RNA聚合酶与araBAD的结合并形成 开放性启动子复合物 Nanjing University 三、 色氨酸操纵元：可阻遏系统 （一） trp操纵元的结构 1， 结构基因及其编码的酶 trpE，trpD：编码邻氨基苯甲酸合 成酶的2个亚基，各为60KD trpC：编码吲哚甘油磷酸合成酶， 分子量为45KD trpB，trpA：编码色氨酸合成酶的 亚基（50KD）和亚基（29KD） Nanjing University 2，前导序列 trpO与trpE之间有一段162bp的序列可以转 录到mRNA中 3，终止子 在trpA基因下游36bp处有一个不依赖于 因子的终止子t 在t的下游250bp处有一个依赖于因子的 终止子t 4，调节基因 调节基因trpR与Trp操纵元相距较远，编码 阻遏蛋白 Nanjing University （二）Trp操纵元的阻遏调控 1，Trp的作用 Trp有两方面的