BDPharmingen产品专题.ppt

BD Pharmingen 产品专题 基因公司市场部 田丽平 Lynn_ 主要内容 nBD Pharmingen 简单介绍 nBD Pharmingen 产品分类 nBD Pharmingen 特色技术 BD Pharmingen 简介 nBD公司成立于1897年，财富周刊500强 n公司的业务分为三大类 ： BD医疗系统 BD生物科学系统 BD临床实验室系统 n产品丰富，足迹遍及世界六大洲 BD Pharmingen 简介 nBD Biosciencens BD Immunocytometry Systems (IS) BD Pharmingen /pharmingen/ BD Discovery Labware BD Clontech n分子生物学、 细胞生物学、免疫学、流式細 胞分析技术等领域 n为生命科学的基础研究和临床应用，提供全 方位強有力的支援和协助。 BD Pharmingen 简介 nBD Pharmingen是华人在美国最成功的生物公司 n涉及领域：免疫学，细胞生物学，分子生物学 n流式抗体和基于流式平台开发的产品种类日益丰 富，拥有全球领先科技和多项专利，与高速发展 的研究前沿保持一致 免疫学问题 n产生哪些BRM, 以及由何种类型的细胞产生? n这些细胞的数目和产生频率? n体外分析抗原特异性 T cells? n对一个样品同时分析多种BRM (multiplexing)? BD Pharmingen产品特色 nPMG高品质的流式产品在BD和Beckman Coulter的流式细胞仪上都能得到完美的检测结 果。 n Pharmingen优势在于免疫学领域，不仅是流式 。 n直标型抗体，FITC, PE, APC等特异性灵敏性好 n抗体涉及多个物种，常规抗体齐全。 n抗体效价很高。 n许多产品具有独家的专利产权。 BD Pharmingen常见抗体 nICC：免疫细胞化学(甩片) nIHC：免疫组织化学 nIHC(F)*：免疫组织化学-甲醛固定样品（需 抗原修复） nIHC(Fr)：免疫组织化学-冰冻切片 nIHC(P)： 免疫组织化学-石蜡切片 nIHC(Zn)：免疫组织化学-锌固定 nIC/FCM：胞内染色（流式细胞分析） nIctrl：同型对照 BD Pharmingen 流式抗体标记 缩写 中文名 标记 em (nm) FITC 异硫氰酸荧光素 直标 530 PE 藻红蛋白 直标 575 APC 别藻蓝蛋白 直标 660 PerCP 多甲藻素叶绿素 直标 679 PerCPCy5.5 多甲藻素-叶绿素-花青甙5.5 直标 694 Biotin 生物素 间标，需加avidin/streptavidin标记的二 抗 Purified 未标记，间接法检测，需加荧光标记的二抗 BD Pharmingen 产品分类 BD Dimer X nTCR不能自动与Ag结合，Ag必须被摄取、加 工，与MHC结合为复合物由APC（DC、B细 胞、巨噬细胞）呈递给T细胞。 nMHC Class I 将Ag（胞内）呈递给CD8+T 细胞 产生细胞毒性免疫反应 nMHC Class II 将Ag（胞外） 呈递给CD4+ T cells 引起细胞因子分泌和Ig的产生 BD Dimer X nMHC Class I 病毒、肿瘤细胞等胞内基因编码的Ag经加工后 的肽段或者胞内寄生细菌产生的Ag经加工后的 肽段 810 aa 的Ag肽段在ER中与MHC I分子结合 MHC I/肽复合物由Golgi 转运到细胞表面，Ag被 呈递给CD8+T细胞 nMHC Class II 胞外蛋白经过加工后的抗原肽段，比MHC I分子 结合的肽段长且结构复杂 MHC II/肽复合物被呈递给CD4+T细胞 Dimer X 结构 v b2微球蛋白使 MHC I 分子具有结合 肽段的功能 v 重组融合蛋白表 达于真核细胞系( 鼠 浆细胞瘤细胞系 J558L), 具有更好的 构象完整性，更容易 加载肽段，结构高度 稳定。 BD OptEIA 特色： F(ab)检测抗体 、专用Buffer和 稀释体系 包装： Kit、Set 和Pair BD IMAG 磁分离系统 抗原-抗体反应 磁场原理 BD IMAG 磁分离流程 1 向细胞悬液 中加入抗体标 记的磁珠 2 磁珠通过特 异性抗体与带 有相应抗原的 细胞结合 3 置于磁场 中，与磁珠 连接的细胞 被磁场吸附 4 吸去上清，带 有抗原的细胞留 在试管里，其他 细胞在吸出的上 清中 正选法: 去除上清，将试 管移出磁场，分 析被磁珠捕获的 细胞，即为目的 细胞 负选法: 分析上清，目的 细胞在上清液中 BD IMAG 磁分离产品 BD IMag：直接标记磁珠/间接标记磁珠 磁珠包被了针对白细胞亚群表面特异性标志的单抗 磁珠包被了链霉亲和素（streptavidin） 在实验系统中加入biotin标记的单抗，磁珠通过streptavidin与 biotin标记的单抗结合，单抗与细胞表面相应抗原特异性结合 而使细胞被磁珠间接捕获，从而达到分离。 这种磁珠使研究者可根据自己需要选择生物素标记的各种单抗去 分离目的细胞，应用范围更广泛，使用更灵活。 BD ELISPOT ELISPOT（酶连免疫斑点）：体外检测 单个细胞分泌某特定蛋白的水平和确定产 生该特定蛋白的细胞频率的工具。 BD ELISPOT n单细胞水平检测分泌到的胞外细胞因子 n动态观察活细胞应答而非检测培养上清、血清 、血浆、裂解液（静态） n结果以斑点显示, 能计数效应细胞，分析效应 分子产生频率 n能检测产生细胞因子频率极低的细胞，灵敏度 高达1/300,000 n捕获抗体为BD Pharmingen高亲和力、无叠氮 钠、低内毒素抗体，不会引起非特异性细胞激 活。 ELISA与ELISPOT比较 nELISPOT-细胞产生效应分子一分泌出细胞， 被包被在板上的抗体直接捕获，灵敏度更高 nELISA - 细胞产生的效应分子分泌到上清后 被稀释，或者被其高亲和力的受体吸收而不 被抗体检测到或被蛋白水解酶降解而灵敏度 较低ELISA只能检测到分泌的效应分子总 量，而不知效应细胞有多少 nELISPOT能计数效应细胞，得到单个细 胞分泌效应分子的相对量；细胞活化后产生 效应分子的变化 BD CBA BD Cytometric Bead Array 简称BD CBA，是利用一系列荧光 强度不同的微球，同时分析样本中多种成分的流式检测方法 。 BD CBA n携带有荧光的微球包被有特异性捕获抗体，与 待测样本孵育后，形成“三明治”复合物。微球 在流式细胞仪的FL3通道检测，定性目的蛋白 ，PE标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白 定量。 液相ELISA n流式检测 BD CBA 技术原理 Capture Bead Capture AbBead + + Analyte of interestFluorescent detection Ab CBA检测原理 1 2 3 不同强度红色荧光 的捕获微球，在 FCM FL3检测 不同的目标蛋白 PE 标记的检测抗体， 在FCM FL2检测。 荧光强度即为靶蛋白量 4 5 6 BD CBA特点 n液相中反应,实时检测细胞因子的表达 n操作简单（无需包被），省时（3h） n同时同步检测多指标 n微量样本(5-50ul) n特异性和灵敏度2-7pg/ml, (20-100pg/ml) n避免由于信号放大的假阳性 n更好的线性度和更宽的检测范围 n流式细胞仪和CBA软件自动分析 CBA与ELISA比较 ELISA n抗原检测的经典方 法 n单项检测 n每项实验样本用量 50-200L n需要抗原包被 n实验时间大于24h n酶-底物背景干扰 BD CBA 多参数检测 样本用量少-50L 操作方便，节省时间 流式细胞仪自动检测 标准曲线自动生成， 专用软件自动计算结果 无酶-底物背景干扰 提高检测效率 BD CBA 应用 n眼泪等来源珍贵的微量样本(5-10ul)，血清、 血浆或培养液上清 n细胞凋亡等信号传导通道蛋白 n肿瘤研究，疾病诊断、预后判断、病程检测 n多参数同时分析 nSLE，新生儿脓血症等免疫疾病的监控 n药物研发，疫苗研究总体免疫功能分析 n免疫性疾病：自身免疫病、过敏等炎症反应 ，白血病、淋巴瘤、癌症等 BD CBA Flex Set-New Flex Set微球带有近红外和 红色两种荧光，分别在流 式细胞仪的FL3（近红外 荧光）和FL4（红色荧光 ）通道检测，通过这个二 维矩阵（对应于微球上的 特定序号）识别捕获微球 ，从而定性目的蛋白，PE 标记的检测抗体在FL2通 道来对目的蛋白定量。 CBA Kit与CBA Flex Set比较 CBA Kit n同时检测5或者6个 n捕获微球、标准品、检 测抗体、缓冲液和稀释 液等全部试剂 n灵敏度0.3pg/ml n检测范围 0-5000pg/ml nCBA Analysis Softw