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蛋白质的定性测定考马斯亮蓝法该染料和蛋白质是通过范德华力结合的。考马斯亮蓝含有较多疏水集团，和蛋白质的疏水区有较大的亲和力，和凝胶基质的亲和力不如氨基黑，所以用考马斯亮蓝染色是漂洗要容易的多。原理：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。蛋白质的定量测定常量凯氏定氮法原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。1. 消化 总反应式：2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4（98%）=(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O浓H2SO4脱水性： 有机物脱水被炭化C、H、N浓H2SO4氧化性： 2H2SO4+C=2SO2+2H2O+CO2 SO2+N(含氮化合物) NH3+ SO3 SO3+H2O=H2SO4 NH3+H2SO4=（NH4）2SO42. 蒸馏 消化完全样品+NaOH 40% 碱性加热蒸馏NH32NaOH+(NH4)2SO4=2NH3+Na2SO4+2H2O3. 吸收与滴定1)用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂,甲基红-溴甲基酚绿混合指示剂）或者用亚甲基兰+甲基红(国标) 指示剂 红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸）2) 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。催化剂的功能K2SO4：可以提高溶液的沸点而加快有机物分解。它与H2SO4作用生成KHSO4可提高反应温度340400 K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3K2SO4加入量不能太大，以防造成体系温度过高，又引起已生成铵盐分解，放出NH3 （NH4）2SO4NH3+（NH4）HSO4 2（NH4）HSO42NH3+2SO3+2H2O 也可用Na2SO4或KCl代替,但效果不及K2SO4。 CuSO4 2 CuSO4CuSO4+SO2+O2 C+2 CuSO4Cu2SO4+SO2+CO2 Cu2SO4+H2SO42Cu2SO4+SO2+2H2O消化完全后，不再有 Cu2SO4生成（褐色）蓝绿色CuSO4还可作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂另外还可以加氧化汞、汞(均有毒，价格贵)、硒粉、二氧化钛等。氧化剂： 如双氧水、次氯酸钾等，目的加速有机 物氧化速度步骤：消化蒸馏吸收滴定注意事项所用试剂应用无氨蒸馏水配制。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附壁上造成消化不完全，损失氮。消化过程中应注意不时转动瓶凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在壁上残渣洗下，并促进消化完全。样品中若含脂肪 或 糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫小火加热，或加少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂；注意控制热源强度。样品消化液不易澄清时，可加30%H2O223ml消化一般消化至透明后，继续30min ,即可，但含特别难以氨化的氮化合物样品，如：赖氨酸，组氨酸、色氨酸、酪氨酸，需延长时间、有机物消化完全呈蓝色的浅绿色，但含Fe高时，呈较深绿色。 蒸馏前给水蒸汽发出器内装水至2/3容积处，甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升使其始终保持酸性，这样可以逸避免水中NH3被蒸发而影响结果。 2%硼酸吸收液每次用量10ml用前加入甲基红一溴甲酚绿混合指示剂2d。蒸馏时，蒸气发生要均匀充足，蒸馏过程不得停火断汽，否则将发生倒吸。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。加碱要足，操作要迅速，漏斗应采用水封，以免NH3由此逸出。混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。蒸馏装置不能漏气。若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 mL的比例增加硫酸用量。氨基酸分离及测定薄层色谱法原理：取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。优点： 展开时间短，一般在2030分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。 层析后得到的斑点小而清晰。 能够使用多种显色剂。 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10100倍） 精确到0.01ug。 也可用于大量分离500 mg，作为样品制备层析。缺点：Rf值重现性比纸上层析差。分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等。氨基酸自动分析仪法原理：见书本P156样品处理：酸水解如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核算、无机盐等杂志，必须将样品预先出去杂质后再进行算数接处理。去杂质的方法：去糖和淀粉：把样品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗涤，得蛋白质沉淀物去脂肪：先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物去核酸：将样品在100g/L氯化钠溶液中，85度加热6小时，然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥即可去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时还必须用阳离子交换树脂进行去盐处理第九章 灰分及几种重要矿物质元素含量的测定1、灰分概念：食品经高温灼烧（550）以后，残留的不挥发性的无机成分。高温灼烧时，有机物被空气中的O2氧化（CO2H2ONO2）而除去，此外一些挥发性的物质与水易于除去，留下来的是无机盐和金属氧化物。灰分一般指总灰分（或称粗灰分）2、灰分测定原理：一定样品炭化后放入高温炉内灼烧，食品中的水分及挥发物质以气态放出，有机物质中的碳、氢、氮等元素与有机物质本身的氧及空气中的氧生成CO2、N的氧化物（NO、NO2、N2O3、N2O4）及水分而散失；而无机物质以硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐、氧化物等无机盐和金属氧化物形式残留下来，残留物即为灰分。 （灼烧前后成分的变化见原理）3、炭化 炭化的原因：试样经预处理后，在放入高温炉灼烧前要先进行炭化处理，防止在灼烧时，因温度高试样中的水分急剧蒸发使试样飞扬，防止糖、蛋白质、淀粉等易发泡膨胀的物质在高温下发泡膨胀而溢出坩埚，不经炭化而直接灰化，炭粒易被包住，灰化不完全。 炭化操作一般在电炉或煤气灯上进行。小心加热使试样在通气情况下逐渐炭化，直到无黑烟产生。特别容易膨胀的试样（如含糖多的食品），可先于试样中加数滴辛醇或纯植物油，再进行炭化。4、原子吸收的原理：原子吸收是一个受激吸收跃迁的过程。当有辐射通过自由原子蒸气，且入射辐射的频率等于原子中外层电子由基态跃迁到较高能态所需能量的频率时，原子就产生共振吸收。原子吸收分光光度法就是根据物质产生的原子蒸气对特定波长光的吸收作用来进行定量分析的。 原子吸收光的波长通常在紫外和可见区。第十一章 酸度的测定1、总酸度：是指食品中所有酸性成分的总量。它包括未离解的酸的浓度和已离解的酸的浓度，其大小可用标准碱滴定来测试。又称“可滴定酸度”。2、有效酸度：指被测溶液中H+的浓度，溶液中H+的活度，反映的是已离解的那部分酸的浓度。常用pH值表示，大小可借酸度计（pH计）测定。3、挥发酸：指食品中易挥发的有机酸，如甲酸、醋酸、丁酸等低碳链的直链脂肪酸。大小可通过蒸馏法分离，再用标准碱滴定来测定。4、牛乳酸度：（外表酸度、真实酸度）固有酸度（外表酸度）：指刚挤生出来的新鲜牛乳本身所具有的酸度。由磷酸、酪蛋白、白蛋白、柠檬酸和CO2等引起的。约占牛乳的 0.150.18%(以乳酸计）。发酵酸度（真实酸度）：指牛乳放置过程中，在乳酸菌作用下乳糖发酵产生了乳酸而升高的那部分酸度。新鲜牛乳含酸量在0.2%以下，不新鲜牛乳0.2%，达0.3%就有酸味，0.6%就能凝固。 新鲜牛乳的酸度为1618T包装材料的有害物质：1单体检测 氯乙烯 苯乙烯 己内酰胺 2增塑剂的检测 PAEs 己二酸酯 双酚A PCR技术聚合酶链式反应：是一种在利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称无细胞的分子克隆。有普通PCR技术 实时荧光定量技术 环介导PCR技术（lamp） 免疫PCR技术PCR定性检测抗虫转基因玉米MON810品系范围 本方法适用于在原料和加工产品中的转基因成分检测，不适用于对转基因堆积品种的转基因成分检测。原理 通过PCR扩增和凝胶电泳分离可得到大小为170bp的DNA片段，包括CaMV35S启动子和玉米基因组的DNA序列。转基因食品：利用基因工程技术，将某些外源基因转移到动物，植物或微生物中，进行该物种遗传密码改造，促其形状，营养价值或品质向人们所需目标妆变，由这些转基因物种所产生的食品。检测：1核酸水平（PCR）2蛋白质水平（ELISA,双抗体夹心方法原理）苯并a芘苯并a芘，又称3，4-苯并a芘，是一种由5个苯环构成的多环芳烃。苯并a芘常温下为浅黄色针状结晶，性质稳定。是多环芳烃中最主要的环境和食品污染物，是一种强烈的致癌物质，对机体各器官，如对皮肤、肺、肝、食道、胃肠等均有致癌作用。并怕对食品的污染主要是针对熏制、烘烤和煎炸等食品而言的，该类食品中的苯并a芘一方面来源于煤、煤气等不完全燃烧，另一方面来源于食品中的脂肪、胆固醇等成分的高温热解或热聚。据研究报道，在烤制过程中动物食品所滴下的油滴中苯并a芘含量是动物食品本身的10-70倍。当食品经烟熏或烘烤而发生烤焦或炭化时，苯并a芘生成量随着温度的上升而急剧增加。丙烯酰胺丙烯酰胺是一种白色晶体化学物质，是生产聚丙烯酰胺的原料。聚丙烯酰胺主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。 2002年4月瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学研究人员率先报道，在一些油炸和烧烤的淀粉类食品，如炸薯条、炸土豆片等中检出丙烯酰胺，而且含量超过饮水中允许最大限量的500多倍。 丙烯酰胺毒性急性毒性试验结果表明，大鼠、小鼠、豚鼠和兔的丙烯酰胺经口LD50为150-180 mg/kg，属中等毒性物质。神经毒性和生殖发育毒性大量的动物试验研究表明丙烯酰胺主要引起神经毒性；此外，为生殖、发育毒性。大鼠90天喂养试验，以神经系统形态改变为终点，最大未观察到有害作用的剂量（NOAEL）为0.2 mg/kg bw/天。大鼠生殖和发育毒性试验的NOAEL为2 mg/kg bw/天。遗传毒性丙烯酰胺在体内和体外试验均表现有致突变作用，可引起哺乳动物体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常，并证明丙烯酰胺的代谢产物环氧丙酰胺是其主要致突变活性物质。 致癌性动物试验研究发现，丙烯酰胺可致大鼠多种器官肿瘤，包括乳腺、甲状腺、睾丸、肾上腺、中枢神经、口腔、子宫、脑下垂体等。国际癌症研究机构（IARC） 1994年对其致癌性进行了评价，将丙烯酰胺列为2类致癌物（2A）即人类可能致癌物，其主要依据为丙烯酰胺在动物和人体均可代谢转化为其致癌活性代谢产物环氧丙酰胺。丙烯酰胺形成丙烯酰胺主要在高碳水化合物、低蛋白质的植物性食物加热(120C 以上)烹调过程中形成。140-180为生成的最佳温度，而在食品加工前检测不到丙烯酰胺。在加工温度较低，如用水煮时，丙烯酰胺的水平相当低。水含量也是影响其形成的重要因素，特别是烘烤、油炸食品最后阶段水分减少、表面温度升高后，其丙烯酰胺形成量更高；但咖啡除外，在焙烤后期反而下降ELISA检测方法ELISA中最为经典的是双抗体夹心方法，其操作步骤是：（1） 样品的预处理（2） 样品抽提（3） 测试样品中目标蛋白浓度的计算（4） 结果可信度判断的原则（详细见327页）增塑剂的