结核杆菌的研究进展.ppt

LOGO 结核杆菌的最新研究进展 Company Logo 结核杆菌的介绍1 结核杆菌诊断技术研究进展2 Company Logo 结核杆菌的介绍 v 自从1882年Robert Koch发现结核分枝杆菌 (MTB)以来，已报道的分枝杆菌有100多种。有关 分枝杆菌的分类方法很多，通常分为典型结核分枝杆 菌(TM)和非结核分枝杆菌(NTM)。 v TM包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非 洲结核分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，又称为结核分枝杆 菌复合群(MTBC).该群中DNA相关性为85一100 ，分类地位相近。 v NTM包括MTBC和麻风分枝杆菌以外的所有其他分 枝杆菌，在自然界中分布广泛，由于NTM对氯化物 具有抗性，它们甚至可以在自来水管道系统中生存。 Company Logo 结核是由MTBC中的细菌引起的人畜共患传染病，近 年来在全球的发病率逐年上升，特别是发现了由牛结核分 枝杆菌引起的人类结核和由MAC引起的肺炎有增多的趋 势，已成为值得关注的公共卫生问题。研究表明，结核病 牛可通过痰液、乳汁、粪便等向外排出结核杆菌污染环境 。因此，动物检疫是控制结核病的重要环节。 结核是一种慢性消耗性疾病，每年引起全球约300万 人死亡。20世纪80年代后结核病的发病率曾有所降低， 但近年其全球疫情又呈现上升趋势，而且由于结核分枝杆 菌耐药性和多重耐药菌株的出现，结核病对某些国家已构 成严重的健康威胁。因此，对结核杆菌的研究非常重要。 结核杆菌的介绍 Company Logo 结核杆菌诊断技术研究进展 结核杆菌诊断技术研究进展 一、细菌学检测 结核病人的细菌学检测是结核病诊断、治疗及 评价治疗效果的可靠手段。在过去的20年中，针 对结核分枝杆菌的早期感染已经建立了一系列快 速检测系统。 1 、全自动分枝杆菌检测系统（BACTEC） 该法采用放射同位素技术对细菌的生长进行 自动检测。该法检测的阳性率比L-j法提高了10 ，但其局限性在于无法观察菌落形态、容易污 染、有放射性及价格昂贵。 Company Logo 结核杆菌诊断技术研究进展 2、分枝杆菌生长指示系统(MGIT) MGIT系统是继全自动分枝杆菌检测系统 (BACTIEC)检测系统之后发明的一种非放射性 培养法，包括MiddleBrood 7H9液体培养基和 分枝杆菌生长指示剂，该指示剂在有氧条件下发 生荧光淬灭。当培养基中分枝杆菌生长代谢逐渐 消耗氧时，培养基的氧化还原电势降低，指示剂 发出荧光这样可通过紫外线透射仪观察，分枝 杆菌生长所产生的荧光在气液面及试管底部呈橙 色即为阳性结果。 Company Logo 结核杆菌诊断技术研究进展 3、MBBacT系统 MBBacT系统是由德国Heipha Biotest公司生产的一种液体培养基系统，该 系统对标本中结核分枝杆菌复合群(MTBC) 初代分离率高于全自动分枝杆菌检测系统 (BACTE)TB460，可以通过肉眼观察到细 菌生长，且无放射性污染.但不能用于分支 杆菌的菌型鉴定。 Company Logo 结核杆菌诊断技术研究进展 4、噬茵体报告技术 该技术原理为，萤光素酶指示的分枝杆菌噬菌体 与在含抗结核药物培养基中短暂培养的待检菌混 合后，能感染活的耐药菌，使之表达萤光素酶基 因，再加入萤光素底物，活菌会产生荧光，而敏 感菌无荧光产生。此办法直观性高、用时短，但 如要被广泛应用于结核杆菌的快速检测还需要进 一步的探索必须使用标准化的细菌、标准化的 萤光素酶系统，以及标准化的培养基和发光检测 仪，并能与用常规方法所测最低抑菌浓度值相符 。 Company Logo 结核杆菌诊断技术研究进展 二、血清学检测 多数血清学实验检测时间短，具有较高的特异性 。可用于人群筛选。但日前已商品化的组合抗原 检测试剂盒都无法检测出所有结核患者血清中的 抗结核抗体。结核分枝杆菌抗原多且复杂，在宿 主体内表达的数量、种类或时机可能随患者的个 体免疫背景和病程而异，从而表现出不同的抗体 谱。因此，采用多种抗原联合检测的手段，在保 证特异性的基础上有助于改善灵敏低的缺点。 Company Logo 结核杆菌诊断技术研究进展 1、酶联免疫吸附法 由于酶联免疫吸附法(ELSA)简使、 易行、快速、无需特殊精密仪器，所 以在结核病血清学诊断方面研究最多 、应用最广。 Company Logo 2、斑点金标免疫渗滤法 斑点金标免疫渗滤法(DIGFA)是将固相人型结 核分枝杆菌蛋白衍生物(PPD)纯化抗原包被在斑 点反应板上，其与体液中的抗结核分枝杆菌抗体 (PPDIgG)形成复合物胶体金标记抗人IgG 或海藻硫酸多糖(SPA)与复合物结合，形成肉眼 可见的红色斑点。这种方法具有简便、快速、结 果易于判读、无需特殊仪器、能进行单个标本的 测定、受检患者可及时得到结果等特点。但受结 核菌或其他分枝杆菌感染及卡介苗接种等影响， 可能出现交叉反应。 结核杆菌诊断技术研究进展 Company Logo 结核杆菌诊断技术研究进展 3、结明实验 结明实验(MycoDot)是国内外使用较早、较普 遍的结核抗体快速检测实验。将脂阿拉伯甘露聚 糖(LAM)作为抗原固定在电泳梳上，再将此附有 抗原的电泳梳于稀释的血清或全血中浸泡，标本 中如有LAM抗体，则与梳上LAM抗原相结合， 浸入显色液后，抗体会颗粒便会特异性地聚集在 抗原抗体复合物上，在梳上附着抗原处形成红色 圆形斑点，即为阳性。结核菌细胞壁成份中含有 阿拉伯甘露糖因此只有当患者患活动性结核病 时，才会有阳性反应。健康人、既往感染者以及 卡介苗接种者都显示为阴性。 Company Logo 结核杆菌诊断技术研究进展 三、分子生物学诊断方法 1 、结核杆茵DNA扩增法(PCR法) 在过去的20年，已建立起多种PCR技术用来检测结核 分枝杆菌特异性的靶序列。实验证明，PCR是一种简便、 快速、灵敏、特异的基因诊断技术，特别适用于因排菌量 少、结核杆菌发生L型变异而被常规细菌学检查漏诊者的 早期诊断、鉴别诊断及化疗后排菌情况的观察，标本不需 要预培养，有很高的临床诊断价值。虽然PCR技术有诸多 好处，但是目前该方法仍缺少权威性的诊断试剂盒，存在 的主要问题是扩增时气溶胶污染导毁的假阳性、标本中 PCR抑制物质导致的假阴性，因此还有待进一步改进。 Company Logo 结核杆菌诊断技术研究进展 2、实时荧光定量PCR技术 实时荧光定量PCR技术具有引物和探针的双 重特异性。与传统PCR相比，在对结核分枝杆菌 检测的特异性上大为提高。尽管实时荧实时荧 光定量 PCR技术术在结核分枝杆菌检测方面有许多优势， 但由于其高灵敏性、实验操作易受污染等而容易 出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增 即可为阳性结果，故并不能作为诊断依据，只有 当一定数量的病原体存在时才有临床意义。 Company Logo 结核杆菌诊断技术研究进展 3、限制性片段长度多态性（PCRRFLP） 分子生物学诊断方法PCRRFLP(限制性片 段长度多态性)是以PCR为基础的分类鉴定技术 和限制性内切酶分析相结合的技术。PCR RFlJP分析是鉴定分枝杆菌种的可靠程序，比形 态学和生理、生化特征等常规方法更准确，快速 。 Company Logo 4、 DNA探针技术 结核杆菌DNA探针主要包括eDNA探针、全染色 体DNA探针、克隆DNA探针和寡核甘酸探针等 。DNA探针的缺点是灵敏度低标本中细菌数较 少时难以检出，因此限制了其临床应用。将灵敏 度高的PCR技术与特异性强的DNA探针技术有 机结合，将成为结核病诊断的发展趋势。世界卫 生组织最近推出一种分子检测法，又称为线性探 针检测法，其应用将给抗药性结核病的治疗带来 显著进展。 结核杆菌诊断技术研究进展 Company Logo 5、生物芯片检测 生物芯片(又称DNA芯片、基因芯片)。该方 法适用于基因表达、基因功能、基因分型和序列 分析等的研究。基因芯片正以其无可比拟的信息 量、高通量及快速、准确地分析基因的本领，在 结核分枝杆菌菌种鉴定、耐药性监测、基因组比 较分析等方面发挥着重要的作用，但由于仪器昂 贵和制备芯片成本偏高等因素限制了其普及。 结核杆菌诊断技术研究进展 Company Logo 结核疫苗研究进展 v结核疫苗的研究策略目前，研究疫苗的总体思路 来说，主要分为以下三种。 v第一种策略将一些重要的抗原或者其它因子重新 导入到现有的BCG 株，得到一个以BCG 为载体 的重组BCG 疫苗，或者使结核分枝杆菌的基因缺 失得到基因缺失突变株从而制造出新的结核疫苗 ，取代我们传统用的BCG，这种方法制备的结核 分枝杆菌减毒活疫苗可显著地表达多种抗原并激 活各T 细胞群联合免疫。作为临床试验的候选， 这种疫苗肯定会比BCG 更有效，更安全。 Company Logo 结核疫苗研究进展 v 第二种策略是对已接种卡介苗的儿童进行强化免疫，进而 加强免疫应答并将免疫保护力延续至成人阶段。这一策略 目前公认的最佳方案是应用亚单位疫苗加强免疫。亚单位 疫苗组成明确，结构简单，可应用于有免疫缺陷的人群， 倍受人们关注。亚单位疫苗主要是由有限数量的抗原构成 ，所引起的保护性免疫应答也高度集中。但其在体内滞留 时间短，免疫应答的持续时间也较短，必须与佐剂联用才 有效，使其应用受到限制，几种主要的候选疫苗均采用了 将单抗原与多聚蛋白融合的方法，这样不仅增强了单抗原 的免疫力，也易于进行规模化生产。所以佐剂的发展对强 化免疫策略的实现功不可没。 Company Logo 结核疫苗研究进展 v第三种策略是将重组BCG 和亚单位疫苗或两种以 上的疫苗结合到一起，从而解决结核疫苗免疫效 果低下这一难题，虽然这个方法要求至少需要几 年的时间进行第三期临床试验，这就需要做一个 时间计划表来设法减少疫苗期试验，做一个成功 的疫苗接种计划。 Company Logo 结核疫苗研究进展 v从疫苗结构完整性来看一般可分为：重组BCG、 亚单位疫苗、DNA 疫苗基因和缺失疫苗等。 Company Logo 结核疫苗研究进展 1、重组弱毒疫苗 主要包括基因缺失弱毒疫苗和以BCG 为载体的重组疫苗。 v rBCG30 是一种经过基因改造的卡介苗。比BCG能产生更强的免疫 应答。rBCG30已经通过临床1 期试验，人体对其显示了 良好的耐受性12。 v rBCGreC:Hly 德国柏林Max-Planck 研究所研发的携带李斯特菌溶解 素（Hly）而自身尿素酶C 基因缺乏的重组BCG。 v 基因剔除疫苗ICL v 营养缺陷株疫苗 该疫苗可用于HIV 感染者而不引起相关性疾病。正在研 制的该类疫苗约有9 种，在动物实验中均有一定的保护效 果，但持续时间短，免疫记忆差，且毒力尚不确定。 Company Logo 结核疫苗研究进展 v 2、亚单位基因工程疫苗 v Ag85B-ESAT6 融合蛋白（Hybrid1）和Ag85B- TB10.4 融合蛋白（Hybrid4） v 热休克蛋白疫苗（J774-HSP65，BMC-HSP65） v MTB72f. 利用表现为Rv0125(MTB39)和Rv1196(MTB32)融 合蛋白质配合免疫佐剂（AS02A，AS01B）。 v MVA-85A. 利用自己不复制的痘苗病毒为载体,表达出具有强免疫原性 的结核杆菌Ag85A 抗原的基因疫_苗重组，从而在儿 童中获得预防结核病的长久免疫保护效果。在技术上只是 为了增强卡介苗的效果。 Company Logo 结核疫苗研究进展 v3 、DNA 疫苗 v Pro-apoptotic BCG 俗称“促凋亡卡介苗”，卡介苗的生产抗细胞凋亡 的因素在减少，改造提高疫苗的免疫水平从而可 以诱导出更为强烈的免疫反应。 v 联合多价DNA 疫苗 Company Logo 结核病疫苗的未来展望 最近几年由于结核病的死灰复燃，引起社会各界的广泛关注 。随着来自公共基金如欧盟、政府卫生机构基金的投资的 不断增加，结核疫苗的研究、开发和评估已经成为热点， 并且几种疫苗已进入早期临床阶段。当BCG 的保护性捉 襟见肘时，基因疫苗开始成为了科学家们关注和研究的焦 点。1998 年，英国的Sanger 中心和法国Pasteur 研 究所联合完成了