第5章_发酵菌种的制备.ppt

发酵工程,2/jing/c76/zcr-1.htm,南阳师范学院 生命科学与技术学院,发酵工程,第一章 发酵工程总论 第二章 发酵设备 第三章 发酵工业原料及其处理 第四章 发酵工业灭菌 第五章 发酵菌种的制备 第六章 发酵工业放大 第七章 微生物发酵机制 第八章 发酵动力学 第九章 发酵过程工艺控制 第十章 发酵染菌及防治 第十一章 发酵工业废物、废水处理和资源化技术 第十二章 展望,1 发酵工业微生物菌种的选育 2 工业微生物种子的扩大培养 3 种子培养基及其制备,第五章 发酵菌种的制备,2/jing/c76/zcr-1.htm,1.1 工业微生物的特点 1.2 发酵工业对菌种的要求 1.3 工业生产常用的微生物菌种 1.4 工业微生物菌种的分离 1.5 发酵高产菌种的选育 1.6 菌种的退化与保藏,1 发酵工业微生物菌种的选育,第五章 发酵菌种的制备,1.1 工业微生物的特点,1 发酵工业微生物菌种的选育,一个现代化的发酵工业必须具有优良的菌种、合适的工艺和先进的设备、严格的检测与控制，其中菌种是主体,其他则是为了充分发挥菌种的优良性能而考虑和设计的。 能用于发酵生产的微生物即为工业微生物，它们具有个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能力强、易变异改造等特点。,1.2 发酵工业对菌种的要求,1) 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且产量高； 2）培养条件易于控制； 3）生长速度快，发酵周期短； 4）满足代谢控制的要求； 5）抗噬菌体和杂菌的能力强； 6）遗传性状稳定，菌种不易变异退化； 7）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、降低成本有重要意义； 8）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳源利用； 9）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。,地球上的微生物资源非常丰富，目前已发现的仅占其总数的1%5%，而在工业生产中被利用的仅有数百种，分属于细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、担子菌、藻类。,1.3 工业生产常用的微生物菌种,放线菌（链霉素四环素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢等）,一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,一、抗生素生产有关的微生物,抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：,已工业化产品生产菌的介绍,1.3 工业生产常用的微生物菌种,二、氨基酸生产有关的微生物,代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。,20世纪50-60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：,1.3 工业生产常用的微生物菌种,已工业化产品生产菌的介绍,hd:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸 的合成调节机制,ht:高丝氨酸转乙酰酶,ak:天冬氨酸激酶,氨基酸生产菌的要求：,代谢途径比较清楚，简单,谷氨酸发酵的菌种：,其他氨基酸生产菌：,棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌,常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌,1.3 工业生产常用的微生物菌种,二、氨基酸生产有关的微生物,三、食品酶制剂生产有关的微生物,开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到fda的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。,淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌,1.3 工业生产常用的微生物菌种,已工业化产品生产菌的介绍,三、常用的基因表达系统,(一)原核生物：大肠杆菌(1977年boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌,生长迅速、蛋白产量高;,表达蛋白的纯化、分离及分析快速；,外源基因的导入相对容易；,已建立了整套表达理论及技术。,已工业化产品生产菌的介绍,1.3 工业生产常用的微生物菌种,(二) 真核细胞表达系统,酵母(既是微生物又是真核细胞),生长迅速，营养要求不高，易培养；,安全性好；,比哺乳动物细胞操作简单；,具有一定的修饰蛋白的能力。,1.3 工业生产常用的微生物菌种,已工业化产品生产菌的介绍,具有准确的转录后修饰功能；,具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；,具有重组基因的高效扩增和表达能力；,具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；,cho很少分泌自身的内源蛋白。,1.3 工业生产常用的微生物菌种,已工业化产品生产菌的介绍,问题：,生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？,礼来(eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。,例：,1.3 工业生产常用的微生物菌种,已工业化产品生产菌的介绍,一、菌种分离的一般过程,样品采集,预处理, 增殖培养, 纯培养, 菌种的鉴定,问题：如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,1.4 工业微生物菌种的分离, 生产性能测定,复合酶系 复合菌系,二、采样时要注意的问题,气候、水分、空气,来源要广,结合产品的特点,标签：地点、时间、气候等,1.4 工业微生物菌种的分离,富集的三种方案：,定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。,三、目的微生物富集的一些基本方法,富集的目的：,让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，,不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法,1.4 工业微生物菌种的分离,定向培养的方法,物理方法：加热、膜过滤等，,但主要是通过培养的方法,1.4 工业微生物菌种的分离,三、目的微生物富集的一些基本方法,2/jing/c76/zcr-1.htm,定向培养的富集方法,1、底物,2、ph条件,3、培养时间,4、培养温度,等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批、连续）后使目的微生物在种群中占优势。,三、目的微生物富集的一些基本方法,四、菌落的选出,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,1.4 工业微生物菌种的分离,实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选,采样（造纸厂）,80 30 min处理,文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌,0.0075%曲利本蓝1%cmc（羧甲基纤维素），ph10.5 培养34 d，选择有凹陷圈的菌落,从285个土样中获得62株,26株为组成型,36株为诱导型,1.4 工业微生物菌种的分离,实例：醛肟水解酶的筛选,-journal of biotechnology 94(2002), 65-72,培养基中含0.05% of z-paox,每隔23 d移去一半培养物，补充新鲜培养基,不断分析样品，2-3个月后z-paox降低后，稀释分离菌落,1.4 工业微生物菌种的分离,五、目的微生物富集方法的研究进展,分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16srna同 源性分析，基因序列分析及dna/dna杂交技术等,目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%，微生物的 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。,陈文新（科学院院士） ， 2002,1.4 工业微生物菌种的分离,目的,提高生产能力,提高产品质量,开发新产品,解决生产实际问题,防止菌种退化,1.5 发酵高产菌种的选育,方法,基因突变：,自然选育、诱变育种,基因重组：,杂交、原生质体融合、基因工程,基因的直接进化：,点突变、易位pcr、同序法 dna shuffling等,1.5 发酵高产菌种的选育,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9。,自然突变有两种情况：,一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。,另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。,一、自然选育,1.5 发酵高产菌种的选育,自然选育在工业生产上的意义,自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。,回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变,问题：,高产菌株是正突变高，还是负突变高？,1.5 发酵高产菌种的选育,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞(孢子)悬液的制备,平板分离,挑选单菌落,发酵试验,1.5 发酵高产菌种的选育,注意形态的观察,选择性培养法 随机分离法,平板划线法 平板稀释法,二、诱变育种,用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。,诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂（p103）,诱变剂,物理：紫外，快中子，射线，激光 化学：硫酸二乙酯（des），亚硝基胍（ntg） 生物：噬菌体，转座子,1.5 发酵高产菌种的选育,（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题,化学诱变剂使用过程的安全性,诱变剂量的选择,诱变剂的选择,出发菌株的选择,（一）、诱变育种的原理 诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。,压硝酸：0.07mna2hpo4 亚硝基胍：1mnaoh,二、诱变育种,（三）、诱变育种的一般步骤 （p103）,二、诱变育种,诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分。 诱变部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。 筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能力。 诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到达到高产菌株。,（三）、诱变育种的一般步骤,二、诱变育种,出发菌株的选择,制备菌悬液,诱变处理,突变菌株的筛选,营养缺陷型突变菌株的筛选 抗反馈阻碍和抗反馈抑制突变菌株的筛选 组成型突变株的筛选 抗性突变株的筛选,自然界直接分离到的野生型菌株 经历过生产条件考验的菌株 已经历多次育种处理的菌株,随机筛选,形态,理化性质,hd:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制,ht:高丝氨酸转乙酰酶,ak:天冬氨酸激酶,结构类似物抗性：lys的类似物aec, thr的类似物ahv,营养缺陷型：如thr缺陷型,黄色短杆菌f9-50的诱变谱系,bervibacterium flavum as 1.495 (leu-) lys.hcl 2.1 g/l,f6-16 (leu -, thr -) 20.8 g/l,f9-50 (leu -, thr -, aec r) 33.5 g/l,三、基因的直接进化(directed evolution),突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的筛选 基因复制与遗传,步骤：,在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。,1.5 发酵高产菌种的选育,主要应用：,酶活性能的提高: 生理环境工业催化环境,ph,温度,有机溶剂,底物专一性,脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯,例：,pla,pla光学拆分选择性(%),2 31 57 75 81 90,5次错位pcr 2次定点突变 reetz (1997) liebeton(2000),定点突变,错位pcr,dna改组(dna shuffling): 指dna分子的体外重排，是基因在分子水平上进行有性重组(sexual recombination)。,dna改组技术(1994)的发明人stemmer博士，他以5项美国专利为技术支撑点，于1997年创立了专门从事dna改组研究的公司maxygen。公司刚刚建立，世界上几家最大的公司纷纷与之洽谈并建立了合作关系。这些公司包括最大的农业公司 dupont公司、生产抗生素的世界巨头 dsm公司和工业酶研究生产之最的novo nordisk公司。此外，迄今为止，maxygen公司还得到了来自美国国防高级研究计划局(darpa)和国家科学技术协会(nist)的5项资助，共计2100万美元。从另一角度反映了dna改组的重要性及美国政府及商家对dna改组技术的重视程度。,图1 有性pcr法改组dna的基本程序,dna shuffling,图2 交错延伸法改组dna的基本程序,dna shuffling,x xxx,x xx x,xx x,xxx x,xx x,x xxx,xx x,x xx x,xxx x,x xxx,xx x,x xx x,xxx x,xx x,xx x,xx xxx x x x x x xx x,fragment reassemble select best with dnasei fragments recombinants,repeat for multiple cycles,dna shuffling,dna shuffling与常规定向进化的比较,部分dna shuffling技术的研究成果,dna改组(dna shuffling)技术的应用领域,1）菌种的退化及原因,菌种退化：指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。 常见的菌种衷退在形态上表现为分生孢子的减少或菌落颜色的改变，与由于环境条件变化而引起菌落形态和生理上的变异是不同的 。,1.6 菌种的退化与保藏,菌种退化的原因：基因突变、变异菌株性状分离、其他因素（温度、湿度、培养基成分及各种培养条件）,1.6 菌种的退化与保藏,狭义的菌种复壮指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，从而达到恢复该菌原有典型性状的目的。 广义的菌种复壮指在菌种的生产性能尚未衰退前，就经常有意识地进行纯种分离和生产性能测定工作，从而逐步提高菌种的生产特性。,2）菌种的复壮,一、退化菌种的复壮,1.6 菌种的退化与保藏,常用的方法是对已退化菌株用一定培养条件进行单细胞分离纯化，从而限制退化菌株在数量上占优势，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得以复壮。 纯种分离的方法常用的有三种：稀释分离法、平板划线法和组织分离法（用于高等真菌）。,2）菌种的复壮,1.6 菌种的退化与保藏,二、通过寄生进行复壮 寄生型微生物的退化可接种到相应寄生体内以提高菌株的活力。 三、联合复壮 对退化菌株还可用剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍（ntc）联合处理进行复壮。,2）菌种的复壮,3）防止菌种退化的措施,合理的育种 选用合适的培养基 创造良好的培养条件 控制传代次数 利用不同类型的细胞进行移种传代 选择有效的保藏方法,1.6 菌种的退化与保藏,4）菌种保藏,菌种保藏的意义：是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。,1.6 菌种的退化与保藏,菌种保藏的原理：根据菌种的生理生化特点，采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸中中和剂等方法，使使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。,4）菌种保藏,1.6 菌种的退化与保藏,小 结,涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有 特定的微生物(动、植物)才具有大量表达的潜力；,传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是 自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；,目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生 物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；,基因重组、直接进化技术的应用，大大加快了生 物产品开发的进程。,1 发酵工业微生物菌种的选育,3.1 菌体组成和细胞外代谢产物 3.2 种子培养的培养基选择和配制原则,3 种子培养基及其制备,第二章 菌种的制备,2/jing/c76/zcr-1.htm,3.1 菌体组成和细胞外代谢产物,3 种子培养基及其制备,1）菌体组成： ? 2）胞外代谢产物 胞外产物多达37大类，根据微生物代谢产物和生长繁殖的关系不同，分为两大类： 一类是微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，称为初级代谢产物，此类产物的生产菌种主要是细菌、酵母、霉菌等。 另一类代谢产物与微生物生长繁殖无明确关系，称为次级代谢产物，如抗生素、生物碱、色素等。发酵工业用来生产次级代谢产物的微生物仅有少数几个类群，主要是丝状放线菌、丝状真菌等。,3.1 菌体组成和细胞外代谢产物,3 种子培养基及其制备,3）微生物的营养类型（nutritional types),碳源利用,自养型 （autotrophs） 异养型 （heterotrophs）,能量来源,光能营养型 （phototrophs） 化能营养型（chemotrophs）,3.2 种子培养的培养基选择和配制原则,3 种子培养基及其制备,1）培养基的营养成分及来源 培养基（medium)是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。包括：,碳源(source of carbon) 氮源(source of nitrogen) 无机盐(inorganic salt) 生长因子(growth factor) 水(water),3.2 种子培养的培养基选择和配制原则,3 种子培养基及其制备,2）培养基的类型和用途 来源：天然培养基（complex medium；undefined medium） 合成培养基（synthetic medium； defined medium） 半合成培养基（semidefined medium） 外观：固体培养基（solid medium） 液体培养基（liquid medium） 半固体培养基（semisolid medium） 功能：孢子培养基（sporemedium）和种子培养基。,3.2 种子培养的培养基选择和配制原则,3 种子培养基及其制备,3）培养基的配制原则 选择适宜的营养物质、营养物质浓度及配比合适、选择合适的ph、氧化还原电势、营养成分的加入顺序（先加缓冲化合物，溶解后加入主要物质，然后加入维生素、氨基酸等生长素类的物质）。,2/jing/c76/zcr-1.htm,3.2 种子培养的培养基选择和配制原则,3 种子培养基及其制备,4）培养基成分配比的选择 种子和孢子培养的目的是获得大量质量良好的菌体或孢子，因此产量提高是选择培养基的一个重要标准。 c/n比 来源丰富、价格便宜、取材方便 方法：单因子试验、正交试验、均匀试验、影响面法,本章思考题,1 工业用微生物的要求有哪些？试举例说明微生物在工业中的应用。 2 简述自然分离微生物的一般操作步骤。 3 简述种子扩大培养的一般步骤。 4 如何防止菌种衰退？菌种复壮的措施有哪些？ 5 影响种子质量的因素有哪些？如何控制种子质量？,2008中国大学评价研究报告还发布了“2008中国最受媒体关注大学排行榜”，排行榜以2007年度高校网络新闻搜索的数量统计得出，位居前十强的高校是北京大学、清华大学、中国人民大学、复旦大学、浙江大学、中山大学、北京师范大学、上海交通大学、武汉大学、同济大学。,中国一流大学名单,校名 入选根据 清华大学 研究1型、工学第1名 北京大学 研究1型、理学第1名 浙江大学