蛋白酪氨酸磷酸酶B的缺陷抵抗TGFβ在肝细胞中引起的抑制作用.ppt

蛋白酪氨酸磷酸酶1B的缺陷抵 抗TGF-在肝细胞中引起的抑 制作 用 2110430 何顺漪 目的 研究PTP1B在对TGF-进行细胞应答过 程中的作用 意义 对研究磷酸酶在TGF-信号通路中的作 用开拓了新思路 简 介 实验相关技术 实验过程及结果 结 论 内容 简 介 在肝脏中，转化生长因子(TGF-）是一种重要的调 节细胞因子。它在调节肝细胞的增殖和死亡过程中发挥重 要作用。然而，TGF-也可调节形成肿瘤的过程，例如， 上皮细胞向间叶细胞的转变，此过程可导致细胞迁移、生 存、细胞入侵，免疫调节或微环境的调节。 TGF-最终的作用是通过生存信号的活化而被调节， 这些信号依赖于不同的蛋白激酶，例如，表皮生长因子受 体（EGFR）或Ras/ERK途径。这些激酶通常是通过蛋白 磷酸酶将其磷酸化来调节。在这些酶中，蛋白酪氨酸磷酸 酶1B（PTP1B）是无受体PTP中能广泛表达的一员，主要 位于有细胞内膜的细胞器中，如内质网。它的缺乏可抵抗 由不同刺激物引起的细胞死亡 。 TGF-信号途径中涉及到的酶 活性氧组分（ROS） NADPH氧化酶(NOX) PTP1BNF-B TGF-NOX1 实验方法 1、细胞培养 -DEME 2、细胞数量分析-crystal violet staining 3、细胞周期的分析-flow cytometry 4、细胞增殖的测量-3H-thymidine 5、细胞内氧化还原状态的测量氧化作用敏感的荧 光探针 6、分析凋亡的细胞核 实验方法 7、caspase-3 活性的分析 8、基因表达的分析semiquantitative PCR Real Time PCR 9、蛋白印迹 10、免疫细胞化学研究 11、沉默实验分析-siRNA real-time quantitative PCR 指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特 异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行 分离。 应用： 1. DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测, 转基因动 植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等 。 2. 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异( 如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证 。 3. 基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等 。 常 用 方 法 SYBR green: 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异 性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子 不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完 全同步。 Taqman Probe: PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该 探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基 团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增 时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧 光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完 全同步。 实验过程及结果 为了研究PTP1B在TGF-信号途径中的作用，首先比较较野生型和缺陷 型细细胞中几种激酶的基本活性。 对照 ERK：细胞外调节蛋白激 酶，将信号从表面受体传 至核内，参与细胞增殖分 化、细胞凋亡等。 AKT：是一种丝氨酸/苏氨 酸蛋白激酶，在细胞存活 和凋亡中起重要作用。 结果：缺陷型细胞的ERK和AKT 磷酸化水平较高 实验过程及结果 野生型和缺陷型细胞对TGF-应应答进进行比较较 结晶紫染色 结果：经36h处理后，野生型细胞数量减少， 缺陷型细胞数量没有变化 实验过程及结果 据报道，经TGF-处处理后细细胞数量减少是由于细细胞凋亡和生长长抑制的 组组合效应应，所以测测定它在应应答细细胞因子过过程中的作用。 结果：野生型细胞中TGF- 能够够抑制EGF诱导诱导 的DNA合成。 EGF：表皮生长因子 实验过程及结果 测定caspase3的活性，研究细胞凋亡情况。 小结： 缺陷型肝细胞 能够抵制TGF- 的抑制作用， 如：生长长抑制 细细胞凋亡。 实验过程及结果 考虑到PTP1B缺乏的肝细 胞能够抵制TGF-的作用， 对对参与细细胞因子信号传导传导 过过程的分子进进行研究。 首先，证明这些肝细胞能够表达所有参与TGF- 介导的信号传导过程的蛋白， 如，受体，smad蛋白。 实验过程及结果 对照 RT-PCR 实验过程及结果 检测smad2和smad3磷酸化水平 total Nuclear extracts 结果：缺陷型细胞中 两者均减少。 实验过程及结果 结果：磷酸化的Smads转移至核中的量减少。 DAPI染色 染色原理： 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole)，是一 种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。因为 DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。 实验过程及结果 寻找在抵制TGF-信号过过程中起作用的蛋白激酶，将 细细胞与不同蛋白激酶抑制剂剂共孵育： PD98095 LY294002 PP2 ERK1/2 PI3K/AKT SRC 结果：不能使缺陷型细胞对TGF-敏感。 实验过程及结果 发现： 当一种酪氨酸 蛋白激酶抑制剂， gentistein, 加到培 养基中时，表现出 对TGF-产产生应应答 。 PTP1B缺陷型 结果：genistein能够抑制AKT和 ERK的磷酸化。 T+Gen使细 胞数量降低 ，并伴随 caspase-3 活性增高。 Smad2/3磷 酸化水平增 高。 结果：TGF-的抵制作用与smad2/3的磷酸化降低有关，但可在酪氨酸蛋白激酶存 在下恢复。 实验过程及结果 相关报道认为，NF-B在TGF-信号途径中起作用。将p65亚亚 基转转移至核中作为为NF-B激活的标志。 结果：缺陷型细胞中 p65核转移增加。 为了研究NF-B途径在缺陷型细细胞中对对TGF-的抵制作用，用siRNA 定向沉默p65。 P65的沉默使两种细胞对TGF- 作用都敏感。 P-Smad2/3增加，smad7下降 。 核中P-smad2/3 显著增加。 然而，在野生型细胞中，Smads磷酸化水平没有受到p65沉默的影响。 说明，在PTP1B缺陷型细胞中，当TGF- 存在时，NF-B活性增加会抵 制TGF-的作用。 实验过程及结果 NOX酶产生的ROS产物是TGF-诱导诱导 的细细胞凋亡过过程中重要的 调节调节 因子。 此外，先前已提出在应应答TGF-过程中，NF-B与NADPH的关系 。 由于这这些原因，研究它们们在PTP1B缺陷细细胞对对TGF-的作用是否 有影响。 分别测量NOX1和NOX4表达量 下降 上升 缺陷型细胞中，经TGF-处处理后 ，NOX酶表达量不平衡。 NOX1表 达下降 缺陷型细胞中以NOX1为目标的沉默实验 表达量下降凋亡的细胞核增加 P65核转移减少 smad2磷 酸化增加 smad7减 少 以上结果表明，NOX1活化上调NF-B的活性。然而，当p65被沉默 时时NOX1表达水平下降说说明存在一种依赖赖于NF-B的NOX1表达的正 反馈环馈环 。 讨 论 TGF-在肝脏脏病理生理学中起到双重作用：抑制和促进进 肿肿瘤的生长长。 PTP1B的缺乏抵制TGF-的抑制作用，并且与ERK和 AKT磷酸化水平升高有关。 经TGF-处理后，在缺陷型细胞中，smad2&3的磷酸化 水平下降。 PTP1B缺乏时，由激酶引发的TGF-抑制作用的损害不 能通过简单的抑制几种酶来克服，而当一种酪氨酸蛋白激 酶抑制剂存在时，可以观察到细胞凋亡。 TGF-不仅诱导凋亡前信号也诱导生存前信号，而且这 些信号是依赖于NF-B活性。 P65沉默实验证明了NF-B对TGF-信号途径有抑制作用 。 NOX1被TGF-调节似乎与Smads无关，但与NF-B有 关