Zetasizer Nano系列专题.ppt

zetasizer nano 系列专题:,malvern instrument,who are malvern instruments?,马尔文仪器是一家英国公司，专注于设计和制造精确的测量仪器，应用于 粒子尺寸及其分布 粒子的电荷 分子量 粒子形态 分散体系的流体力学性质,where are we?,英国总部,zetasizer nano 能够测量什么参数？,三种测量技术 动态光散射（dynamic light scattering） 通过非侵入背散射 (nibs)测量粒径及其分布 激光多普勒电泳（laser doppler electrophoresis） 通过激光多普勒测速和相位分析光散射技术相结合的马尔文m3-pals专利技术测量zeta电位 静态光散射（static light scattering) 分子量以及第二维利系数a2测量,zetasizer nano系列:,粒子尺寸 胶体颗粒，乳液，高分子溶液 高灵敏度 高浓度 zeta电位 维护简单 高灵敏度，准确率 高分辨率 分子量 蛋白质和高分子,zetasizer nano 的应用,应用,涂层,化学工业,纳米技术,生物/药物,多糖,疫苗,诊断,蛋白质特性,药物释放,dna / 基因疗法,纳米钻石,纳米银颗粒,量子点,色素/油漆,油墨,炭化分散体系,高分子,陶瓷,表面活性剂,微乳液,高分子溶液,二氧化硅分散体系,contents,动态光散射 测量原理 由相关曲线得到粒径信息 数据分析 样品要求及制备 静态光散射 zeta 电位 zeta nano zs的应用,光散射技术的光学系统,apd,zetasizer nano是如何测试粒子的粒径的?,动态光散射dynamic light scattering (dls)，也称光子相关光谱photon correlation spectroscopy (pcs) ，准弹性光散射quasi-elastic scattering，测量光强的波动随时间的变化 粒子的布朗运动brownian motion导致光强的波动 光子相关器correlator将光强的波动转化为相关方程 相关方程检测光强波动的的速度，从而我们得到粒子的扩散速度信息和粒子的粒径d(h) 从相关方程我们还可以得到尺寸的分布信息,动态光散射及布朗运动,微小粒子在悬浮溶液中的随意运动 布朗运动的速度依赖于 粒子的大小 媒体的粘度,散射光的相叠加,激光,检测器,平均测量角度,大部分光未被 散射，穿过样品,平均光强,动态光散射测量原理 (iso 13321),相关方程,光强相关方程: where: g2 : 光强相关方程 g1 : 场强相关方程 : 相关器延迟时间 a : 相关方程基线 b : 相关方程截距,相关方程表示随时间变化的相关性质,time, = 0,time, = 1,intensity,time,intensity, = 2, = ,光强波动，相关函数和粒径分布,stokes-einstein equation,2,动态光散射,由相关曲线得到粒径信息 : 数据分析,相关曲线,这里: g = dq2 为衰减率 d 为扩散系数 q = (4 p n / lo) sin (q/2) 为散射矢量 n 为折光指数 lo 为照射光波长 q 为散射角度,对于单分散体系,stokes-einstein equation,相关曲线,累积距法：得到平均粒子尺寸和分布系数（pd.i） 多指数分析模型：得到粒子实际尺寸和分布,对于多分散体系,这里g1(t)是相关曲线中所有指数衰减的总和,累积距法,iso13321 阐述用三次方多项式拟和相关方程 这里 t 是衰减时间 与z-均 扩散系数相关 由z-均 扩散系数得到z-均直径 为分布系数,分布系数 （pd.i）,多指数分析模型对于分布的分析,general purpose 算法适用于大部分分布状况未知的样品 multiple narrow mode 算法适用于已知的分布状况不连续的样品,光强, 体积和数量分布 设想一个由相等数量的 5 nm 和 50nm 球型粒子组成的混合物,数量分布,数量平均粒径 28nm,体积平均粒径 49nm,光强分布 (rayleigh theory),光强平均粒径 = 50nm,体积分布,n1:n2,n1*3/4r13 : n2*3/4r23 n1v1:n2v2,n1v12 : n2v22,动态光散射的特点：,上亿个粒子的统计学效果，使得对粒径及其分布的测量更加准确 对微量存在的大颗粒极其敏感 在溶液状态下测量颗粒的尺寸 需要溶液的粘度和折光指数等光学参数 所得到的尺寸分布正比于不同种类颗粒对光强的贡献率,动态光散射 dynamic light scattering,样品要求,样品要求,样品应该较好的分散在液体媒体中 理想条件下，分散剂应具备以下条件: 透明 和溶质粒子有不同的折光指数 应和溶质粒子相匹配 （也就是：不会导致溶胀, 解析或者缔合） 掌握准确的折光指数和粘度，误差小于0.5% 干净且可以被过滤 iso 13321 (1996),动态光散射对粒子尺寸的下限,依赖于： 粒子相对于溶剂产生的剩余光散射强度 溶质和溶剂折光指数差 样品浓度 仪器敏感度 激光强度和波长 检测器敏感度 - 雪崩式光电二极管（apd) 仪器的光学构造 - 非侵入背侧光散射技术（nibs),动态光散射对粒子尺寸的上限,动态光散射测量粒子无规则的热运动/ 布朗运动 若粒子不进行无规则运动，动态光散射无法提供准确粒径信息 粒子尺寸的上限定义于沉淀行为的开始 因此上限取决于样品 应考虑粒子和分散剂的密度,样品浓度总结,从动态光散射得到的样品尺寸应该不依赖于浓度 (iso 13321) 每种样品都有其理想的测试浓度范围 如果浓度太低，可能散射光强不足以进行试验 这种状况不太可能出现在nano s/nano zs系列中，除非在一些极端条件下 如果样品浓度太高，实验结果可能会依赖于浓度 为了得到正确的尺寸信息，可能会需要在不同的浓度下检测样品尺寸,样品浓度下限,依赖于： 粒子相对于溶剂产生的剩余光散射强度 折光指数 样品浓度 仪器敏感度 激光强度和波长 检测器敏感度 仪器的光学构造,样品浓度上限,对于高浓度样品，由动态光散射测得的表观尺寸可能会受到不同因素的影响 多重光散射 检测到的散射光经过多个粒子散射 扩散受限 其他粒子的存在使得自由扩散受到限制 聚集效应 依赖于浓度的聚集效应 应电力作用 带电粒子的双电层相互重叠，因而粒子间有不可忽视的相互作用。这种相互作用将影响平移扩散,独特的非侵入背侧光散射特点 (nibs),在nano s 和 nano zs 系列中，光散射检测角度为173o ，因此成为背光散射 光学系统不穿过样品，因此称为非侵入性 nibs所观察到的样品散射体积为在90o （ zetasizer nano s90 ）条件下的8倍，因此能够得到更多的散射光强，仪器也更加灵敏 更高的灵敏度使仪器能够检测低浓度下小尺寸的粒子 激光不需要穿过整个样品，因此降低了多次光散射效应。可以检测较高浓度的样品 多次光散射效应通常降低粒子的表观尺寸，增加光子相干曲线的截距 污染物，如灰尘粒子，得散射光通常在较小的角度有比较大的散射光强 因此背侧光散射可有效的降低灰尘的影响,非侵入背侧光散射: nibs,173,contents,动态光散射 静态光散射及分子量的测定 测量原理 应用实例 zeta 电位 zetasizer nano 的应用,静态光散射 static light scattering (sls),在静态光散射中，我们检测溶质粒子的绝对散射光强随浓度的变化 在zetasizer nano zs中，我们在一个角度检测光强 通过debye曲线我们可以测量 绝对分子量 第二维利系数,第二维利系数 2nd virial coefficient (a2),一个热力学性质，形容溶质和溶剂间的相互作用 当 a2 0, 溶质分子稳定的存在于溶剂中 当 a2 = 0, 溶质分子和溶剂分子的相互作用等同于溶质分子内部相互作用被称为 theta 溶剂条件 当 a20, 溶质分子不能稳定存在于溶剂中，形成结晶或者聚集,什么样的样品适合静态光散射?,yes,no,proteins,polymers,dendrimers,liposomes,emulsions,mixtures,静态光散射,i (mw2) (c),k ：光学常数 c ：浓度 m：分子量 rq ：样品的瑞利比 a2：2nd 维利系数 p() ：形态因子,(rayleigh equation),静态光散射,静态光散射,对于瑞利散射, p() = 1 因此方程被简化,因此从kc/r 对浓度做曲线，截距值为分子量的倒数1/m，斜率为第二维利系数a2,(y = mx + c),debye 曲线,样品制备,在适合的溶剂中，制备一系列已知准确浓度的样品样品溶液 具体浓度依赖于所测量的样品，一般在0.1-10g/l,1,2,3,4,溶剂,样品制备,所有使用的玻璃容器，吸液管，样品池，溶剂，均应无尘 用过滤膜过滤所有的溶剂，分散剂 (e.g. whatman anotop 20nm pore size filters),分子量测定应用实例 (lysozyme in pbs),contents,动态光散射 静态光散射 zeta 电位 测量原理 样品制备 样品测试 zeta nano的应用,表面电荷的起源,大部分存在于水体系中的胶体颗粒携带电荷 关于表面电荷的产生，有很多种原因，依赖于粒子的表面性质和周围的媒体 表面基团离子化 有失去或者得到离子的趋势 带电物质吸附在粒子表面,zeta电位(zeta potential),什么是zeta电位?,zeta电位同时依赖于粒子表面和分散剂的化学性质 对于静电力稳定的分散体系，通常是zeta电位越高，体系越稳定 体系稳定与否通常以zeta电位是否大于 30mv为标准,影响zeta电位的因素,影响zeta电位的因素有： ph变化, 电导率 (浓度，盐的类型) 组成成分浓度的变化 (如高分子，表面活性剂),stern layer,slipping plane,diffuse layer,-,-100,0,mv,distance from particle surface,surface potential,stern potential,zeta potential,particle with negative surface charge,分散体系的稳定性 (dlvo理论),dlvo 理论以四位科学家命名 （derjaguin, verway, landau and overbeek） 胶粒分散体系的稳定性取决于粒子间近程吸引力（范德华力）和远程排斥力（静电力）之和 胶粒分散体系的可以通过不同机制失去稳定性,zetasizer nano是如何测量zeta电位的?,样品的散射光和参考光源相干产生调制信号 频率分析得出粒子电泳运动速度 zeta电位由henry 方程换算而得,颗粒以一定的速度进行电泳运动。速度的大小取决于: 电场强度 媒质的介电常数 媒质的粘度 zeta电位,电泳光散射,电泳是带电粒子在施加电场下相对于周围分散剂的定向运动,电泳光散射,一束激光穿照射在进行电泳运动的样品上，由于颗粒的电泳运动，散射光的频率发生偏移 频率的偏移f 与电泳的速度相关: = 粒子的电泳速度 = 激光波长 q = 散射角,f = 2 sin(/2)/,用激光多普勒电泳测量zeta电位 - 相位分析光散射技术,光强的波动是怎样被引发的?,f1,f2,将两束光结合,参考光 f1 和散射光 f2,光强的波动是怎样被引发的?,f2,f1,参考光 f1 和散射光 f2,这两束光在a处相干加强， 在 b 处相干减弱,b,a,a,相干的结果产生一个频率小得多的调制光源，这束光的频率等于参考光和散射光频率的差,f1,=,-,f,f2,检测器检测的是光强随时间的波动，进而得到拍频，进而得到带电粒子速度信息,拍频被聚焦到检测器处,电泳 electrophoresis,zeta 电位可利用henry equation 由带电粒子电泳速度得到,可抛弃性zeta电位毛细管样品池 disposable zeta cell,general purpose = ffr + sfr = m3,ffr: 高频转换 sfr: 低频转换,高频电场转换 ffr (fast field reversal),如果施加电场的转换频率很高，例如50hz, 我们就可以检测到带电粒子的速度，同时避免电渗的影响. 但是分辨率可能会偏低,m3 测试技术,高频电场转换1000hz能够准确地测量zeta电位的平均值，但是分辨率较低,低频电场的转换可以给出更好的分辨率但是受到电渗的影响,通过m3测试技术，结合高频和低频电场的转换，我们既得到准确地平均zeta电位，又得到了较高的分辨率,常规模式（general purpose） 相曲线,ffr（高频电场转换）,通过相分析得到平均电位 (ep),sfr（低频电场转换）,通过相分析和复利叶变换得到电位的分布,自动滴定仪 mpt-2 autotitrator,自动滴定仪可以进行以下滴定: ph 电导率 稀释 (样品浓度),tio2 的ph滴定,zeta,size,contents,动态光散射 静态光散射 zeta 电位 zeta nano的应用 生物/医药领域领域 化学领域,zeta nano的应用,生物/医药领域领域,使用动态光散射和静态光散射表征rise dwarf 病毒,典型的病毒尺寸范围在20-100 nm rise dwarf病毒是一种植物病毒，可以导致大范围的农作物减产 对病毒结构的研究，有利于防治疾病的发生 通过动态光散射的测量，我们得到病毒的直径在100 nm pd.i0.01 表明这是一个但分散体系,使用动态光散射和静态光散射表征rise dwarf 病毒,静态光散射实验中我们配置一系列不同浓度的溶液，并测量散射光强 通过debye曲线，我们得到病毒的分子量为4.2x106da,抗原和抗体,抗原是一种由人体产生的蛋白质，以对抗异物的侵入 抗体是导致抗原产生的异物 抗原可以和抗体结合形成免疫复合物,抗原和抗体：例1,加入抗体前/后蛋白质尺寸变化,加入抗体后蛋白质尺寸 随时间变化,抗原和抗体：例2,图1显示了血清中一种抗体的三次重复测试. 在图2中我们分别混合两种不同的抗体和一种病毒，然后使用动态光散射测量体系的粒径，通过这种方法来判断这两种抗体的对病毒的亲和性 根据粒子尺寸增长的速率，我们可以得出结论：抗体1显示更高的亲和性.,药物释放体系,在实际应用过程中有很多药物释放体系。 携带体系 包括: 脂质体，微胶囊，高分子微球，乳液，水凝胶. 对颗粒性质的了解有助于使药物释放更加有效 比如说微米级的粒子可以陷入肺部的毛细血管 zeta 电位可以用来表征药物携带体和药物的相互作用,钙离子添加物对乳液的稳定性影响: 20% w/v emulsion,药用乳液,样品a2在经过六个月后的静止存储后发生相分离,基因疗法,基因疗法释放基因物质来治疗遗传疾病 药物的携带物vector包括脂质体或者病毒 对于vector尺寸及结构稳定性的测定有利于了解药物的释放过程。携带物通常可以是脂质体或者病毒,阴离子和阳离子脂质体的检测 mrk575-01,阴离子脂质体在加入 dppg (dipalmitoylphosphatidylglycerol) 后表面带有更多负电 阳离子脂质体在加入ddab (dimethyldioctadecylammonium bromide)后表面带有更多正电 对zeta电位的检测有助于预测脂质体的性能,静脉脂肪乳浊液 intravenous fat emulsions pharmaceutical characterization of commercially available intravenous fat emulsions. komatsu, kitajima, okada et al.,静脉脂肪乳浊液使用小的油脂颗粒，他们可以有不同的功能: 药物释放 对于不能正常进食的患者的高能量的营养物 药物释放体系控制药物释放，降低副作用,静脉脂肪乳浊液 pharmaceutical characterization of commercially available intravenous fat emulsions. komatsu, kitajima, okada et al.,很多静脉脂肪乳浊液使用卵磷脂作为稳定剂 这样的体系一般被期望有两年以上的稳定期,静脉脂肪乳浊液-尺寸 pharmaceutical characterization of commercially available intravenous fat emulsions. komatsu, kitajima, okada et al.,静脉脂肪乳浊液-表面电荷 pharmaceutical characterization of commercially available intravenous fat emulsions. komatsu, kitajima, okada et al.,蛋白质表征,什么是蛋白质？,蛋白质是一种由带电的生物高分子紧密折叠堆积而成的结构 蛋白质的结构对溶液的环境非常敏感,蛋白质表征,很多处理过程可导致蛋白质不可逆聚集，变性,蛋白质表征,蛋白质表征对于了解其性能和行为非常重要 对蛋白质熔点的测定可以显示蛋白质变性的信息 测试还可以帮助寻找蛋白质最佳的结晶条件,蛋白质的表征：熔点 mrk704-01,样品a 熔点为 56c 样品 b 为处理过的样品阿a 样品b没有显示熔点，这说明处理的过程中蛋白质已经发生变性,蛋白质的表征：ph 临界点,在蛋白质中加入高分子可以形成高分子-蛋白质缔合物 缔合物的形成取决于高分子的表面电荷，蛋白质的类型，离子强度等因素,药用胰岛素表征,不同配方的静脉注射用胰岛素显示不同的尺寸,盐分对蛋白质稳定性影响：牛血清蛋白质（bsa）,盐分的加入导致了静电屏蔽效应，增加了bsa聚集倾向,zeta nano的应用,高分子及表面活性剂体系,高分子,高分子具有丰富的性能以及广阔的用途 尺寸，形态，构造以及高分子的化学构成都可以对其宏观性能造成影响 要想了解高分子的性能，就一定要了解其结构,高分子的表征 mrk568-01,测量分子量和尺寸 很多高分子的分子量和流体力学尺寸可以通过mark-houwink系数来换算 如果z-均尺寸线性依赖于分子量对数值，且斜率为0.31，那么这个高分子是球状的,高分子的表征 mrk568-01,测量高分子的状态随温度的变化 温敏材料：聚异丙基丙烯酰胺 poly(n-isopropylacrylamide) 低温下为链状结构， 35c时收缩为球状结构 检测高分子的形态改变 高分子粒子在高温下膨胀,for some polymer particles,乳液的稳定性,总体来讲乳液是非稳定的体系. 乳液的稳定性受到很多因素的影响 水的硬度 ph bacteria 离子强度 温度