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实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 肖晓秋 重庆医科大学生命科学研究院 讲 座 提 纲 q 实时荧光定量PCR原理 q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 q q 实时荧光定量PCR原理 q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 q 实时荧光定量技术的应用 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通 过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR原理：实时原理 常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 ，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时 检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应 中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标 准曲线的分析对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR原理：实时原理 实时荧光定量PCR原理：定量原理 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分 析 实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： q 前15个循环信号作为荧光本底信号 （baseline），即样本的荧光背景值和 阴性对照的荧光值 q 荧光域值的缺省设置是315个循 环的荧光信号的标准偏差的10倍 q 手动设置：原则要大于样本的荧光 背景值和阴性对照的荧光最高值，同 时要尽量选择进入指数期的最初阶段 ，并且保证回归系数大于0.99 q 真正的信号:荧光信号超过域值 实时荧光定量PCR 原理 -Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定 的阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) value 实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性 横轴：PCR反映循环数 纵轴：荧光信号量 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理 实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理 实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线 q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越 小 q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标 准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中 所含的模板量 qq确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 qq通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量 Sample 实时荧光定量PCR原理 绝对定量 25 讲 座 提 纲 q 实时荧光定量PCR原理 q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 q 实时荧光定量PCR实验设计及应用 q 实时荧光定量PCR原理 q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 q 实时荧光定量PCR实验设计及应用 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 实时荧光定量PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记 实时荧光定量PCR 方法 1-SYBR Green 法 SYBR Green SYBR Green法 工作机理 q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 q SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光 q 变性时，DNA双链分开，无荧光 q 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在 此阶段采集荧光信号。 SYBR Green 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理 53 53 SG No Emission SG SG SG Excitation SG SG SGSGSG SGSG 53 53 Emission Excitation 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理SYBR Green ISYBR Green I熔解曲线分析熔解曲线分析 温度 荧光强度 Tm TmTm值：值：DNADNA解链一半时的温度解链一半时的温度 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理SYBR Green ISYBR Green I融解曲线分析融解曲线分析 将温度与荧光强度的变化求导。将温度与荧光强度的变化求导。(- (-dI/dTdI/dT) ) -dI dT Tm SYBR Green 法 融解曲线分析 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确 非特异性产 物 Cycle number Flourescenc Ck 102 Ck 104 Sample Cycle number Log of DNA concentration SYBR Green 法 定量原理 q 模板DNA量越多，荧光达 到域值的循环数越少 q Log浓度与循环数呈线性关 系，根据样品Ct值，就可以计 算出样品中所含的模板量 SYBR Green 法 -PCR反应的建立 反应体系的建立及优化: 1.SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太 弱，不易检测 2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4.反应Buffer 体系的优化 5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6.其他与常规PCR相同 SYBR Green 法 应用范围 q 起始模板的测定 q 基因型的分析 q 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对 常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以 区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产 物。 SYBR Green 法 优缺点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNA q 使用方便 -不必设计复杂探针 q 非常灵敏 q 便宜 优 点 q 容易与非特异性双链DNA 结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分 析，优化反应条件 q 对引物特异性要求较高 缺 点 与目标序列互补 实时荧光定量PCR 方法2 -TaqMan法 TaqMan-水解型杂交探针 v 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 v 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) v 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针 TaqMan法 工作原理 每扩增一条DNA 分子，释放一个 荧光信号，可以 在循环过程中任 一点检测荧光 TaqMan 法 PCR反应的建立 1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ，45 S， 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同 TaqMan法 优缺点 q 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定 q 设计相对简单 -与目标序列某一区域 互补 q 重复性比较好 优 点 q 只适合一个特定的目标 q 委托公司标记，价格较 高 q 不易找到本底低的探针 缺 点 讲 座 提 纲 q 实时荧光定量PCR原理 q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 q 实时荧光定量PCR实验设计及应用 q 实时荧光定量PCR原理 q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 q 实时荧光定量PCR实验设计及应用 n绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 n相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 实时荧光定量PCR法：绝对定量与相对定量 绝对定量与相对定量的定义 绝对定量通过标准品定量 n绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： n含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 n含有和待测样品相同扩增片段的cDNA nPCR的产物 绝对定量：从荧光到拷贝数 实时荧光定量PCR法:相对定量通过内标定量 n内标（Endogenous Control）通常是-actin、 GAPDH基因等看家基因 n在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小 n内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量 实时荧光定量PCR法:相对定量-参照因子 Calibrator 实时荧光定量PCR法-相对定量分析方法1: -Ct 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在5以内: 1、用内参基因的Ct值归一目标基因的Ct值： Ct（test)= Ct （target,test) - Ct （ref,test) Ct（calibrator)= Ct （target, calibrator) - Ct （ref, calibrator) 2、用校准样本的Ct值归一试验样本的Ct值： Ct= Ct（test) - Ct（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 Ct=表达量的比值 实时荧光定量PCR法-相对定量分析方法2： 双标准曲线法 目标基因与内参基因扩增效率不同： 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度 实时荧光定量PCR法：实验要素1-样品 DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间 DNA用量：0.05 ng 100 ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取 1 uL 实时荧光定量PCR法：实验要素2-标准品 实时荧光定量PCR法：实验要素2-标准品 标准品梯度稀释方法 复管测试 样品和标准品都要重复 重复次数须遵循统计学要求 实时荧光定量PCR法：实验要素3-重复 实时荧光定量PCR法 TaqMan法举例 TaqManTaqMan法研究法研究ERBB2 ERBB2 在乳腺肿瘤在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异组织标本中的表达差异 TaqMan法举例 标记探针 使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量 q Fam标记目标基因探针 q VIC标记看家基因探针 TaqMan法举例 材料准备 q从正常乳腺组织中提取的总 RNA q从乳腺癌组织中提取的 总RNA q含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准 曲线 q单双通道同时进行，独立分析 qq ControlsControls no RNAno RNA：阴性对照阴性对照 RNA + no reverse transcriptaseRNA + no reverse transcriptase：基因组对照基因组对照 TaqMan法举例 癌症标记物表达 Color 2 - VIC detection for GAPDH Color 1 FAM detection for ERBB2 TaqMan法举例 实验结果 定量 Copies ng/ l Total RNA Healthy RNA Tumor RNA Tumor/H ealthy ERBB21095 1052 2130 2492 2.16 X GAPDH95500 85730 136000 130800 1.45 X TaqMan法举例 实验结果 定量分析 ERBB2 copies / GAPDH copies 1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012 2130/136000 = 0.017 2492/13080