bFGF基因转染MSCs对COPD的修复作用及其机制研究硕士论文开题报告.doc

2014级学术硕士研究生开题报告课题名称：bFGF基因转染MSCs对COPD的修复作用及其机制研究注释：bFGF碱性成纤维细胞生长因子 MSCs骨髓间充质干细胞报告提要：1.立题依据，2.研究方法和内容，3.可行性分析，4.创新之处，5，拟解决的问题。1.立题依据（含参考文献不少于15篇） 慢性阻塞性肺疾病（COPD）：是一种以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，其气流受限多呈进行性发展，与气道和肺组织对烟草烟雾等有害气体或有害颗粒的慢性炎症反应增强有关1。 流行病学调查；据WHO统计，预测12个亚太国家和地区COPD患病率为6.3%，病死率在世界范围内排在第四位2.目前全球已有2.1亿人患有COPD，预计患病率还会上升，到2030年将成为全球第三大致死疾病.在中国约有超过3800万患者，随着经济发展和环境污染不断的加重，中国同时是一个吸烟大国，烟草生产和消费全球第一这些因素是COPD的诱因，我国COPD患者人数将会不断加大，每分钟我国约有2.5个人死于COPD，每年更有100万人死于此病。所以对于COPD发病机制的研究和治疗新方法的研究刻不容缓。 COPD的治疗现况包括：倡导戒烟，避免职业及环境暴露，增强体质，缓解症状。但是治标不治本，不能阻止肺功能持续降低，不能逆转其病理改变，病情易反复，进行性加重3。因此进一步研究COPD的发病机制，寻找有效的治疗手段，达到治本的目的，是医学研究领域新的方向及热点4！ COPD发病机制5：各种有害因素通过损伤气道上皮细胞促进炎症细胞的聚集和活化，再通过炎症介质 介导气道炎症产生慢性支气管炎5；有害因素也可以损伤肺毛细血管使肺毛细血管床减少，同时因为支气管的炎症导致气道分泌物增多，导致气道的一个呼气时狭窄加重，从而使终末气道肺组织、肺泡残气量增加，进而肺组织弹性减低，各种炎症因子作用，是肺组织弹性纤维损失，产生肺气肿，而肺组织周围毛细血管受肺泡的挤压而退化，肺毛细血管大量减少，肺泡间血流减少，肺泡有通气而无血流，产生死腔样通气，而长期的慢性炎症同样是毛细血管内皮损失，产生血栓栓塞，导致肺毛细血管硬化、闭塞,进而通气/血流比例上升，代偿性肺泡融合使肺泡弥散面积从而肺气肿。慢性支气管炎和肺气肿最终导致COPD的发生7。 研究设想：那么是否存在是一种修复气道上皮细胞及肺实质、抑制炎症反应，促使肺毛细血管修复，改善重塑，再生、改善血流通气比，改善、肺的换气功能，从而减轻或逆转COPD的病理生理过程，从而达到治本的目的。 参考文献1.Serum levels of VEGF andbFGFin hypoxic patients with exacerbatedCOPD.Pavlisa G, Pavlisa G, V, Kolonic SO, Markovic AS, Jaksic B.Eur Cytokine Netw. 2010 Jun;21(2):92-8. doi: 10.1684/ecn.2010.0193. Epub 2010 May 27.2.Bronchial vascular remodelling in patients withCOPDand its relationship with inhaled steroid treatment.Zanini A, Chetta A, Saetta M, Baraldo S, Castagnetti C, Nicolini G, Neri M, Olivieri D.Thorax. 2009 Dec;64(12):1019-24. doi: 10.1136/thx.2009.114629. Epub 2009 Sep 6.3.The potential role of growth factor in the airway wall remodeling of achronic obstructive pulmonary diseaserat model and the effects of drugs on them.Song Y, Cui D, Mao P.Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2000 Nov;39(11):751-4. Chinese.4.Decreased maturation of dendritic cells in the central airways ofCOPDpatients is associated with VEGF, TGF- and vascularity.Zanini A, Spanevello A, Baraldo S, Majori M, Della Patrona S, Gumiero F, Aiello M, Olivieri D, Saetta M, Chetta A.Respiration. 2014;87(3):234-42. doi: 10.1159/000356749. Epub 2014 Jan 14.5.Airway angiogenesis in stable and exacerbatedchronic obstructive pulmonary disease.Kristan SS, Marc MM, Kern I, Flezar M, Suskovic S, Kosnik M, Korosec P.Scand J Immunol. 2012 Jan;75(1):109-14. doi: 10.1111/j.1365-3083.2011.02623.x.6.Biological effects and mechanisms of action of mesenchymal stem cell therapy inchronic obstructive pulmonary disease.Jin Z, Pan X, Zhou K, Bi H, Wang L, Yu L, Wang Q.J Int Med Res. 2015 Jun;43(3):303-10. doi: 10.1177/0300060514568733. Epub 2015 Apr 1.7.Mesenchymal stem cells alleviate airway inflammation and emphysema inCOPDthrough down-regulation of cyclooxygenase-2 via p38 and ERK MAPK pathways.Gu W, Song L, Li XM, Wang D, Guo XJ, Xu WG.Sci Rep. 2015 Mar 4;5:8733. doi: 10.1038/srep08733.8.Tracking intravenous adipose-derived mesenchymal stem cells in a model of elastase-induced emphysema.Kim YS, Kim JY, Shin DM, Huh JW, Lee SW, Oh YM.Tuberc Respir Dis (Seoul). 2014 Sep;77(3):116-23. doi: 10.4046/trd.2016. Epub 2014 Sep 30.9.Pericytes inchroniclungdisease.Rowley JE, Johnson JR.Int Arch Allergy Immunol.2014;164(3):178-88. doi: 10.1159/000365051. Epub 2014 Jul 15. Review.10.Mesenchymal stem cells reduce cigarette smoke-induced inflammation and airflow obstruction in rats via TGF-v1 signaling.Song L, Guan XJ, Chen X, Cui ZL, Han FF, Guo XJ, Xu WG.COPD. 2014 Sep;11(5):582-90. doi: 10.3109/15412555.2014.898032. Epub 2014 Apr 25.11.Regulation of transplanted mesenchymal stem cells by the lung progenitor niche in rats withchronic obstructive pulmonary disease.Zhang WG, He L, Shi XM, Wu SS, Zhang B, Mei L, Xu YJ, Zhang ZX, Zhao JP, Zhang HL.Respir Res. 2014 Mar 25;15:33. doi: 10.1186/1465-9921-15-33.12.Mesenchymal stem cell therapy in lung disorders: pathogenesis of lung diseases and mechanism of action of mesenchymal stem cell.Inamdar AC, Inamdar AA.Exp Lung Res. 2013 Oct;39(8):315-27. doi: 10.3109/01902148.2013.816803. Epub 2013 Aug 30. Review.13.Concise review: adult mesenchymal stromal cell therapy for inflammatory diseases: how well are we joining the dots?Griffin MD, Elliman SJ, Cahill E, English K, Ceredig R, Ritter T.Stem Cells. 2013 Oct;31(10):2033-41. doi: 10.1002/stem.1452. Review.14.A placebo-controlled, randomized trial of mesenchymal stem cells inCOPD.Weiss DJ, Casaburi R, Flannery R, LeRoux-Williams M, Tashkin DP.Chest. 2013 Jun;143(6):1590-8. doi: 15.Mesenchymal stem cells protect cigarette smoke-damaged lung andpulmonaryfunction partly via VEGF-VEGF receptors.Guan XJ, Song L, Han FF, Cui ZL, Chen X, Guo XJ, Xu WG.J Cell Biochem. 2013 Feb;114(2):323-35. doi: 10.1002/jcb.24377.研究内容bFGF是血管生长因子家族重要成员之一，在大鼠胚胎肺发育过程中bFGF及其受体的表达主要定位于气道上皮细胞，是肺发育必不可少的因子之一，其生物学特性强烈促血管生成作用，促进增殖、分裂和生长，诱导毛细血管样管腔形成，强烈趋化血管内皮细胞8。外源性bFGF缺点：半衰期短，在肺内容易被稀释或降解，难以保持有效的作用浓度；且残存的肺细胞自分泌能力十分有限9。骨髓间充质干细胞（MSCs）有来源广泛，易体外培养，多向分化潜能（肺泡血管内皮细胞），低免疫原性，可分泌多种生长因子和使外源性性基因易于导入和表达。MSCs优点：来源广泛，多向分化的潜能（具有向肺血管内皮细胞分化的潜能），易于培养，低免疫原性，具有独特的细胞增殖分裂模式，使外源性基因易于导入和表达，同时可以分泌多种细胞因子，各种细胞因子有助于肺组织的修复，如促血管内皮细胞生长因子,可以促进肺血管的增生和修复，从而可以修复肺毛细血管，改善肺组织的通气/血流比例，使肺换气功能改善，有助肺功能的改善，从而逆肺组织的损失，从而达到从根本上治疗慢性阻塞性肺疾病11。最佳载体12。转染bFGF基因的MSCs与肺泡血管内皮细胞共培养，观察其生长情况，结合基因治疗和细胞治疗这两种治疗方式既克服了单一方法的局限性和过于简单化，又能使治疗产生协同作用，效果更佳13,这样就能达到一个优势互补的情况。拟解决的关键问题从携带bFGF基因的MSCs植对肺泡血管内皮细胞的生长情况影响入手，初步探讨其干预COPD的机理并进一步揭示COPD的治疗新方法。研究方法与手段、一、MSCs的体外分离纯化、传代培养及鉴定13.二、bFGF基因鉴定、转染大鼠 1、bFGF基因的获取、扩增及鉴定14. 2、构建重组pcDNA-bFGF质粒 3、重组pcDNA-bFGF质粒转染MSCs（脂质体转染法） 检测转染后MSCs表型的变化及MSCs表达外源性 基因bFGF。 筛选（G418法）和培养稳定表达bFGF的MSCs。3、 体外实验：将bFGF基因转染的MSCs与大鼠肺血管内皮细胞在transwell培养体系中共培养，检测（MTT法等）其对肺血管内皮细胞增殖、迁移等功能影响。4、 实验分组对照组： 0、肺泡血管内皮细胞 + PBS实验组： 1、肺泡血管内皮细胞 + MSCs 2、肺泡血管内皮细胞 + pcDNA3.1 3、肺泡血管内皮细胞 + pcDNA3.1-bFGF 4、肺泡血管内皮细胞 + MSCs + pcDNA3.1-bFGF统计分析：计量资料用XS表示，SPSS19.0统计软件行单因素方差分析(one-way ANOVA)，样本均数间的多重比较，方差齐性时用LSD-t检验，方差不齐时则Games-Howell检验或非参数检验，以P0.05为有统计差别意义 。可行性分析： 1、 本课题组前期进行了大鼠、小鼠MSCs的体外分离培养、标记等生物学特性研究，体内归巢、分化的研究，得到了省、部级科研基金资助，取得阶段性结果，具有一定的前期研究基础。 2、课题组长期从事COPD、干细胞生物学特性及基因转染的研究，主要成员熟练掌握细胞培养、基因转染、PCR、免疫组化等实验技术。 3、实验场所南昌大学呼吸研